基質(zhì)分散固相萃取-同位素稀釋-液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中的100種獸藥

趙善貞，盛永剛，張 旖，鄧曉軍，伊雄海，趙超敏，朱 堅

(上海海關(guān)，上海 200135)

雖然針對獸藥殘留，我國已制定相關(guān)法律法規(guī)《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號公告：食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》[1]、《GB 31650—2019 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[2]，但是濫用獸藥問題仍舊嚴(yán)峻，動物源性食品中檢出國家規(guī)定不得使用的藥物，或者超量使用獸藥仍是目前食品中主要存在的問題之一。

目前，對于跨類別獸藥同時檢測的方法，農(nóng)業(yè)部已出臺相關(guān)的法律法規(guī)[3-4]，但是上述方法都是針對的是畜禽血液和尿液中多獸藥殘留的測定，對于動物源性食品中多獸藥殘留的同時檢測，尚未制定相關(guān)法律法規(guī)。

隨著國內(nèi)外技術(shù)不斷更新?lián)Q代，在獸藥多殘留檢測領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展[5]。隨著質(zhì)譜的發(fā)展和推廣，一次進(jìn)樣完成多種類殘留分析已成為可能[6]。目前對于動物源食品中多種獸藥同時測定的液相色譜-質(zhì)譜方法，包括液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法[7-12]等低分辨質(zhì)譜方法，以及液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法[13-18]、液相色譜-靜電場軌道阱質(zhì)譜法[19-22]等高分辨質(zhì)譜方法。采用三重四極桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測時，為了保證每個MRM通道的駐留時間，需要根據(jù)化合物的色譜保留時間分段設(shè)定參數(shù)，能夠同時檢測的化合物數(shù)量有一定的限制。如果要進(jìn)行未知化合物的篩選，則需要全掃描模式采集數(shù)據(jù)，單位分辨的四極桿質(zhì)譜在全掃描模式下的靈敏度很差，不能滿足殘留分析的要求。因此，獸藥殘留檢測正從傳統(tǒng)的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(LC-MS/MS)的定向檢測，逐漸向高分辨質(zhì)譜(HRMS)非定向全掃描方法轉(zhuǎn)變[23]。飛行時間質(zhì)譜儀的精確質(zhì)量測定在復(fù)雜樣品檢測中有很好的選擇性和靈敏度，同時也需要保證足夠的質(zhì)譜分辨率，否則在篩選時容易出現(xiàn)假陰性[24]。靜電場軌道阱質(zhì)譜儀具有分析速度快等特點，能夠使待測物和共流出物有效分離，同改善了高分辨質(zhì)譜的定量能力[25]。與飛行時間質(zhì)譜相比，靜電場軌道阱質(zhì)譜在分析復(fù)雜基質(zhì)樣品時，在前處理和方法優(yōu)化上效率更高，更節(jié)省時間[26]。

目前在多獸藥殘留檢測中，多采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。但是由于受到基質(zhì)效應(yīng)的制約，不科學(xué)的前處理方法往往會使分析結(jié)果產(chǎn)生較大偏差，在可獲得標(biāo)記目標(biāo)化合物的情況下，穩(wěn)定同位素稀釋技術(shù)(IDMS)是消除定量過程中基質(zhì)效應(yīng)影響最有效的方法[27]。采用同位素稀釋質(zhì)譜法測定食品中的農(nóng)獸藥殘留和非法添加劑等有害物質(zhì)，可校正前處理過程的損失，降低基質(zhì)效應(yīng)，消除儀器響應(yīng)的誤差，提高定量的準(zhǔn)確性[28]，在具有絕對測量性質(zhì)的方法中，同位素稀釋質(zhì)譜法是唯一一種微量、痕量和超痕量元素權(quán)威測量法[29]。

綜合考慮上述檢測方法和定量方法上的優(yōu)缺點，本方法結(jié)合基質(zhì)分散固相萃取(dSPE)進(jìn)行前處理，采用液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，同位素稀釋法進(jìn)行定量測定。方法具有前處理簡單，高通量、高靈敏度等特點，可為提高監(jiān)管部門的工作效率，保障水產(chǎn)品安全提供技術(shù)保障。

1 實驗方法

1.1 儀器、試劑與材料

四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀：Q Exactive美國賽默飛世爾科技，配有H-ESI Ⅱ離子源；液相色譜儀：Dionex Ultimate 3000高壓液相色譜帶自動進(jìn)樣器；電子分析天平：精度為0.000 01 g和0.01 g，德國Sartorius公司；均質(zhì)器：美國Polytron公司，轉(zhuǎn)速可達(dá)20 000轉(zhuǎn)；渦旋震蕩器：美國VORTEX公司；離心機：美國BECKMAN公司，轉(zhuǎn)速可達(dá)10 000 r/min；色譜柱：Boxton C18(100 mm×2.1 μm，粒徑3.5 μm)。

以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純試劑；水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。乙腈、甲醇：色譜純，德國CNW公司產(chǎn)品；甲酸：色譜純，美國Sigma公司產(chǎn)品；氟化銨、乙酸銨、C18、MgSO4、 NaCl：上海安譜科技有限公司；100種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品和26種獸藥內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品：純度均大于98%，上海道垚測試技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品提取 準(zhǔn)確稱取2 g(精確至0.01 g)試樣，于50 mL塑料離心管中，加入內(nèi)標(biāo)混標(biāo)，加入1 g氯化鈉，加入7.5 mL乙腈，均質(zhì)5 min，渦旋混勻5 min，超聲15 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液，殘渣用7.5 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并提取液，待凈化。

1.2.2樣品凈化 在上述提取液中加入900 mg MgSO4、50 mg C18，渦旋混勻，超聲15 min，4 ℃、4 000 rpm，離心5 min，取全部提取液，40 ℃水浴氮吹至近干，50%的乙腈水溶液定容至1 mL，10 000 rpm 離心5 min，取上清液，上機測定。

1.3 液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜條件

1.3.1液相色譜條件 色譜柱：Boxton C18(100 mm×2.1 μm，粒徑3.5 μm)。流動相：A：0.1%甲酸，B：含0.1%甲酸的乙腈(正模式)，A：乙腈，B：0.5 mmol/L氟化銨(負(fù)模式)；梯度洗脫程序：0～5.0 min：98%A～90%A；5.0～12.5 min：90%A；12.5～18.0 min 90%A～50%A；18.0～20.0 min：50% A～20%A；20.0～22.0 min：20% A～0%A；22.0～24.0 min 0%A；24.0～25.0 min：0%A～98%A；25.0～30.0 min：98%A。流速：400 μL/min。柱溫：35 ℃。進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件 質(zhì)譜掃描方式：檢測器全掃描(full MS)和數(shù)據(jù)依賴掃描(ddMS2)模式；電噴霧正離子掃描(ESI+)，電噴霧負(fù)離子掃描(ESI-)。其中，正離子模式：噴霧電壓2.8 kV，負(fù)離子模式：噴霧電壓-2.8 kV。碰撞氣、霧化器和干燥氣均為氮氣。透鏡電壓：55 V。離子源溫度：350 ℃。毛細(xì)管溫度：325 ℃。全掃描的分辨率R=70 000；全掃描范圍m/z80～1 200；二級全掃描模式：分辨率R=17 500。

1.3.3計算結(jié)果和表述

用色譜數(shù)據(jù)處理機或按式(1)計算試樣中100種獸藥的殘留含量,計算結(jié)果需扣除空白值：

(1)

式中：X——試樣中待測組分的含量，單位為μg/kg；c——標(biāo)準(zhǔn)工作液中待測組分的濃度，單位為ng/mL；csi——標(biāo)準(zhǔn)工作液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，單位為ng/mL；ci——試樣中內(nèi)標(biāo)物的濃度，單位為ng/mL；As——標(biāo)準(zhǔn)工作液中待測組分的峰面積；A——試樣中待測組分的峰面積；Asi——標(biāo)準(zhǔn)工作液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；Ai——試樣中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；V——樣品總稀釋體積，單位為mL；m——試樣質(zhì)量，單位為g。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

本方法的化合物pKa范圍跨度較大，既有呈堿性的化合物如孔雀石綠等三苯甲烷類化合物、磺胺甲噁唑等磺胺類化合物、氧氟沙星等喹諾酮類化合物，也有部分呈酸性的化合物，如己烯雌酚、己烷雌酚等二苯乙烯類化合物。方法以脂肪含量較高的三文魚中100種獸藥的回收率為依據(jù)，考查乙酸乙酯和乙腈對100種獸藥的提取效率，這里采用外標(biāo)法定量。由圖1中典型獸藥的提取效果可見，乙腈的提取效果均優(yōu)于乙酸乙酯。再次方法比較了含 0.1%甲酸的乙腈和乙腈對上述化合物的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸的乙腈和乙腈對上述化合物提取效率相當(dāng)，但是紅霉素在酸性條件下極不穩(wěn)定容易分解[31]，方法最終確定以乙腈提取后進(jìn)行凈化。

再次，以三文魚中100種獸藥的回收率為依據(jù)，比較了C18、C8對目標(biāo)化合物的吸附和凈化效果。這里采用外標(biāo)法定量。C18和C8都是常用的分散固相萃取吸附劑，具有良好的除脂能力，水產(chǎn)品的主要成分為蛋白質(zhì)及脂肪，方法采用乙腈提取后，已沉淀大部分蛋白，經(jīng)過C18和C8除脂后可見，對于大部分化合物，C18的回收率較C8高，因此本方法最終選擇50 mg C18和900 mg MgSO4，作為凈化填料。

圖1 不同提取溶劑對典型化合物的提取效果Fig.1 Extraction effect of different extraction solvent for typical veterinary drugs

圖2 三文魚采用不同基質(zhì)分散固相萃取粉末凈化后100種獸藥的回收率Fig.2 Recovery of 100 kinds of veterinary drugs cleaned up by different kinds of dSPE powder in salmon

2.2 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

高效的色譜柱是多組分分析的前提條件，方法比較了Thermo Accucore RP-MS C18(100 mm×2.1 mm，粒徑2.6 μm)、Thermo Hypersil C18(150 mm×4.6 mm，粒徑3 μm)以及Boxton C18(100 mm×2.1 μm，粒徑3.5 μm)色譜柱對100種化合物的分離情況。結(jié)果表明，氧氟沙星、諾氟沙星等喹諾酮類化合物在Thermo Accucore RP-MS C18色譜柱上脫尾嚴(yán)重，采用Thermo Hypersil C18(150 mm×4.6 mm，粒徑3 μm)分離化合物時，隱色孔雀石綠、隱色結(jié)晶紫等化合物峰形較差，而Boxton C18(100 mm×2.1 μm，粒徑3.5 μm)色譜柱對上述化合物種化合物均具有較強的保留效果，各化合物色譜峰形較好。

根據(jù)100種獸藥的電離性質(zhì)(見表1)，分別選用ESI+和ESI-作為離子化模式，采用流動注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，選擇響應(yīng)最強的目標(biāo)離子作為一級母離子。己烯雌酚、己烷雌酚、己二烯雌酚、雌酮、炔雌醇、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考以及4’4-二硝基均苯脲等化合物在負(fù)離子模式下響應(yīng)較強，母離子為[M-H]-；其余化合物均在正離子模式下響應(yīng)較強，母離子為[M+H]+。

歐盟EC 2002/657號文件對多級質(zhì)譜確證時的碎片類型和所需識別點給出了明確規(guī)定，要求禁用物質(zhì)的確證必須達(dá)到4個識別點。在高分辨質(zhì)譜中，每個母離子的識別點規(guī)定為2.0，每一個子離子的識別點為2.5。因此，利用Orbitrap MS只需一個母離子和一個子離子即可完成對目標(biāo)物質(zhì)的確證。

四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜儀的分辨率可以達(dá)到70 000，對于分子組成成分不同，但是分子量接近的化合物可以通過質(zhì)譜儀進(jìn)行分離。如噁喹酸和氟甲喹，兩個化合物的母離子分子量十分接近，而且都會產(chǎn)生質(zhì)荷比(m/z)為 (262.0/224.0)的碎片，采用常規(guī)的低分辨質(zhì)譜儀如三重四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測時，必需通過色譜條件優(yōu)化，進(jìn)行色譜分離后，才能對化合物進(jìn)行定性定量檢測。 采用四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測時，由于其高分辨率，精確質(zhì)量準(zhǔn)確度誤差可達(dá)5 ppm，通過質(zhì)譜儀即可以分離上述化合物。對于同分異構(gòu)體，由于其化合結(jié)構(gòu)組成一致，因此母離子精確分子量也完全一致，高分辨質(zhì)譜儀也無法對其進(jìn)行分離，必需通過色譜分離。

圖3 100種獸藥的提取離子流色譜圖Fig.3 Extracted ion current chromatograms of 100 kinds of veterinary drugs

2.3 基質(zhì)效應(yīng)和定量方法的選擇

基質(zhì)效應(yīng)是由基質(zhì)中的共提干擾物(非目標(biāo)化 合物)與目標(biāo)化合物競爭電離所致[31]。本方法對100種獸藥的基質(zhì)抑制率進(jìn)行考察。基質(zhì)抑制率=樣品基質(zhì)中獸藥的響應(yīng)值/溶劑中獸藥的響應(yīng)值 。方法對三文魚和蝦中的基質(zhì)抑制率分別進(jìn)行考察，由圖4可見，三文魚和蝦中基質(zhì)抑制率差異不大，大部分化合物的基質(zhì)效應(yīng)在0.4～1.2之間。

圖4 100種獸藥的基質(zhì)抑制率Fig.4 matrix inhibition rate of 100 kinds of veterinary drugs

由于受到基質(zhì)效應(yīng)的制約，不科學(xué)的前處理方法往往會使分析結(jié)果產(chǎn)生較大偏差，在可獲得標(biāo)記目標(biāo)化合物的情況下，穩(wěn)定同位素稀釋技術(shù)是消除定量過程中基質(zhì)效應(yīng)影響最有效的方法。方法比較了外標(biāo)法和同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法對定量結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和外標(biāo)法相比，采用穩(wěn)定性同位素試劑作為內(nèi)標(biāo)，不僅能夠同時準(zhǔn)確地提供定性和定量信息，而且有效避免樣品基質(zhì)的影響，校正方法中出現(xiàn)的誤差，顯著提高獸藥殘留檢測方法的穩(wěn)定性。

本方法涉及的化合物種類繁多，同類化合物中不同化合物間也存在較大差異，本方法考察了三文魚基質(zhì)中，內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)對定量結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。在每一類化合物中選擇1～5種同位素內(nèi)標(biāo)，即保證所選內(nèi)標(biāo)的定量準(zhǔn)確性，同時盡量控制內(nèi)標(biāo)的數(shù)量，以減少實驗過程中內(nèi)標(biāo)配制等帶來的復(fù)雜操作，同時控制所用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的成本。圖5給出了典型化合物兩種定量結(jié)果的比較，可見和外標(biāo)法相比，大部分獸藥內(nèi)標(biāo)法的定量結(jié)果準(zhǔn)確性均有所提高。

圖5 三文魚中典型獸藥的不同定量方法結(jié)果比較Fig.5 Comparison of result by different quantitative method of typical veterinary drugs in salmon

2.4 方法的線性關(guān)系、定量限、回收率和精密度

在本方法所確定的實驗條件下，分別配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以化合物的母離子的響應(yīng)峰面積比值(Y軸)對相應(yīng)的質(zhì)量濃度比值(X軸)作圖，繪制各類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線，各藥物的線性方程相關(guān)系數(shù)R2>0.99，在空白基質(zhì)中添加各藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，信噪比S/N>10作為方法的定量限，本方法中，上述化合物的定量限在0.1～10 μg/kg之間。

分別在空白基質(zhì)中，添加1倍、2倍、10倍的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個添加水平進(jìn)行6次平行試驗，按上述方法進(jìn)行樣品預(yù)處理和測定100種，每類選取代表性獸藥1～4種，其平均回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)見表2。

2.5 實際樣品測定

采用本方法本方法在100批次水產(chǎn)品中進(jìn)行檢測，在甲魚、南美白對蝦等2個樣品中發(fā)現(xiàn)存在恩諾沙星殘留，含量在2.61 μg/kg～7.23 μg/kg之間。

表2 魚、蝦基質(zhì)中30種典型獸藥的回收率和RSDTable 2 Recovery and RSD of 30 kinds of typical veterinary drugs in fish and shrimp

續(xù)表2

續(xù)表2

4 結(jié)論

本方法采用基質(zhì)分散固相萃取-同位素稀釋-液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜方法，實現(xiàn)了水產(chǎn)品中100種獸藥同時定性、定量分析的方法。方法前處理簡單，重現(xiàn)性好，分辨率高，可滿足日常工作中對水產(chǎn)品中100種獸藥進(jìn)行快速定性、定量分析。