穩(wěn)定同位素D標(biāo)記甜蜜素的合成

邱 婷，張曙盛,2，朱蘇珍，郭寅龍

(1.中國(guó)科學(xué)院 上海有機(jī)化學(xué)研究所，上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué) 創(chuàng)新中藥研究院，上海 201203)

甜蜜素，化學(xué)名環(huán)己基氨基磺酸鈉(sodium cyclamate)，是一種常用的人工合成甜味劑，于1937年被伊利諾伊大學(xué)的學(xué)生麥克爾·斯維達(dá) (Michael Sveda) 發(fā)現(xiàn)。甜蜜素甜味純正，甜度能達(dá)到蔗糖的40～50倍，是一種非營(yíng)養(yǎng)型甜味劑。由于其價(jià)格便宜，而且用量稍多也不會(huì)有苦味[1]，因而被廣泛應(yīng)用于各類食品、調(diào)味品、化妝品中。從1986年我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)甜蜜素作為食品添加劑至今，甜蜜素在我國(guó)已使用了幾十年。但有研究指出甜蜜素在腸道細(xì)菌作用下能分解成有慢性毒性的環(huán)己胺[2]，可能有致癌、致畸、損害腎功能等副作用。因而包括美、英、日、韓、加拿大等在內(nèi)的40多個(gè)國(guó)家相繼禁止在本國(guó)使用甜蜜素作為食品添加劑。我國(guó)雖還未明文禁止使用甜蜜素，但由于其安全性一直受到質(zhì)疑，在中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760—2014)中，就對(duì)人工甜蜜素的適用范圍和使用量進(jìn)行了明確限定。為了規(guī)范甜蜜素的使用，需要一種能快速、準(zhǔn)確的技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定》(GB 5009.97—2016)中規(guī)定了三種甜蜜素的分析檢測(cè)方法，分別為氣相色譜法、液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法。其中液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法因?yàn)榫哂徐`敏度高、分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越多。但是，該方法需要克服復(fù)雜的食品樣品的基質(zhì)效應(yīng)，樣品處理過(guò)程較為繁瑣。相比傳統(tǒng)的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)試劑與同位素稀釋質(zhì)譜法結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)能在保證高靈敏度的同時(shí)，還具有抗干擾能力強(qiáng)、快捷高效等優(yōu)點(diǎn)，因此有望成為一種很有前途的替代方法，不過(guò)同位素稀釋質(zhì)譜法需要相應(yīng)的穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)試劑配合使用[3-4]。因此穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)試劑的合成無(wú)疑是這種檢測(cè)方法是否能使用的關(guān)鍵。

目前報(bào)道的同位素標(biāo)記甜蜜素主要為放射性標(biāo)記，如用35S和14C標(biāo)記的甜蜜素研究甜蜜素在生物體內(nèi)的分布和代謝[5-7]，35S標(biāo)記的甜蜜素用于同位素稀釋法定量測(cè)定甜蜜素[8]等，而穩(wěn)定同位素標(biāo)記的甜蜜素則未見報(bào)道。而且，由于35S、14C具有放射性，它們的衰變過(guò)程中標(biāo)記試劑的化學(xué)純度會(huì)不可避免地隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而越來(lái)越低。同時(shí)，目前由于放射性物質(zhì)需要具有相應(yīng)資質(zhì)的單位和個(gè)人才能使用，因此其應(yīng)用受到限制。為了解決這些問(wèn)題，本研究開發(fā)了一種穩(wěn)定同位素氘標(biāo)記的甜蜜素，其合成方法簡(jiǎn)單成熟，原料廉價(jià)易得，得到氘代甜蜜素的氘同位素豐度大于99 %，可很好的作為內(nèi)標(biāo)試劑用于甜蜜素的定性、定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

IKA RCT basic IKAMAG safety control型磁力攪拌器：艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司； Heidolph Hei-VAP Precision型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：海道爾夫儀器設(shè)備(上海)有限公司；JULABO FL601型冷卻循環(huán)器：優(yōu)萊博技術(shù)(北京)有限公司；400MHz核磁共振譜儀：美國(guó)布魯克公司(Bruker)；Thermo Scientific TSQ Fortis三重四極桿質(zhì)譜儀：美國(guó)賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher)。

1.2 主要材料與試劑

重水(D2O)：2H同位素豐度≥99.8%，美國(guó)劍橋穩(wěn)定同位素公司(Cambridge Isotope Laboratories, Inc)；環(huán)己酮、鹽酸羥胺、無(wú)水乙酸鈉、鄰二氯苯、無(wú)水乙醚、氫氧化鈉、金屬鈉、無(wú)水硫酸鎂等試劑：均為市售分析純或化學(xué)純，購(gòu)買后直接使用，未進(jìn)一步純化，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

同位素氘標(biāo)記甜蜜素的合成路線示于圖1，以環(huán)己酮為原料，經(jīng)過(guò)H-D交換、還原胺化、磺?；?、堿中和成鹽等幾個(gè)關(guān)鍵步驟，得到2,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸鈉。

1.3.12,2,6,6-四氘代環(huán)己酮肟的合成 干燥的50 mL茄形瓶中加入20 mL重水、100 mg氫氧化鈉(或者50 mg金屬鈉)，溶解后再加入4.0 mL環(huán)己酮，裝上回流冷凝管，加熱至90 ℃并攪拌反應(yīng)3 h進(jìn)行氫-氘交換反應(yīng)，冷卻到室溫后用無(wú)水乙醚萃取，收集有機(jī)相用無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮后得鄰位氘代環(huán)己酮；將得到的鄰位氘代環(huán)己酮再進(jìn)行兩次氫-氘交換反應(yīng)，最后得到四氘代環(huán)己酮與重水的混合液；向得到的四氘代環(huán)己酮與重水的混合液中加入6.0 g鹽酸羥胺、9.0 g無(wú)水乙酸鈉，加熱至70 ℃并攪拌反應(yīng)10 min，冷卻到室溫后用乙醚萃取，有機(jī)相濃縮后柱層析得到2,2,6,6-四氘代環(huán)己酮肟3.5 g，收率為76%。

圖1 甜蜜素-D4的合成路線Fig.1 Protocols for the synthesis of sodium cyclamate-d4

1.3.22,2,6,6-四氘代環(huán)己胺的合成 250 mL的茄形瓶中依次加入3.0 g 2,2,6,6-四氘代環(huán)己酮肟，100 mL無(wú)水乙醚，冰水浴下攪拌，緩慢分批加入5.0 g氫化鋁鋰，加熱回流并攪拌反應(yīng)，30 min后用冰水浴冷卻反應(yīng)體系，緩慢滴加飽和硫酸鈉水溶液，使未反應(yīng)的氫化鋁鋰剛好猝滅，無(wú)氣泡產(chǎn)生為止，反應(yīng)體系用硅藻土過(guò)濾，濾餅用乙醚洗滌，濾液用無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，得到2,2,6,6-四氘代環(huán)己胺2.3 g，收率為85%。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ1.05～1.31(m,3H),1.55～1.75(m,2H),2.03(s,2H),2.64(s,1H)。

1.3.32,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸鈉的合成 20 mL的封管中加入1.0 g氨基磺酸、2.0 g 2,2,6,6-四氘代環(huán)己胺、4.0 mL鄰二氯苯，加入一顆磁力攪拌子，密封后加熱至180 ℃并攪拌回流反應(yīng)4小時(shí)，冷卻到室溫后加入10 mL 10%的氫氧化鈉溶液中和至pH值大于9，再加入10 mL石油醚，分去有機(jī)相，收集水相用活性炭脫色后，濃縮至4 mL左右，置于冰水浴中冷卻結(jié)晶，過(guò)濾，得到2,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸鈉1.9 g，收率為92%。高純度樣品可以使用熱水重結(jié)晶。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ1.01～1.21(m,3H),1.44～1.53(m,1H),1.56～1.64(m,2H),2.84(d,1H,J=6.02 Hz),3.79(d,1H,J=6.06 Hz)。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物合成

穩(wěn)定同位素氘標(biāo)記的環(huán)己胺的同位素豐度直接決定了最終合成的氘標(biāo)記甜蜜素的同位素豐度，因此本研究首先優(yōu)化了氘代環(huán)己胺的合成方法。Gordon等使用氘代氫化鋁鋰還原環(huán)己酮肟，得到一氘代環(huán)己胺[9-10]。本研究選擇環(huán)己酮還原胺化的方法合成環(huán)己胺，在堿性條件下使用重水與環(huán)己酮發(fā)生氫-氘交換反應(yīng)，得到羰基鄰位四氘代環(huán)己酮，再與鹽酸羥胺縮合得到四氘代環(huán)己酮肟，再使用氫化鋁鋰還原得到四氘代環(huán)己胺。在反應(yīng)過(guò)程中，使用的是同位素豐度99.8%的重水，加入氫氧化鈉催化環(huán)己酮羰基的烯醇化，實(shí)現(xiàn)了羰基鄰位的氫-氘交換。同時(shí)，為了保證得到同位素豐度足夠高的氘代環(huán)己胺，連續(xù)進(jìn)行了三次環(huán)己酮的氫-氘交換反應(yīng)(圖2)，來(lái)確保環(huán)己酮鄰位氘的同位素豐度大于99%。在合成四氘代環(huán)己酮肟時(shí)，由于四氘代環(huán)己酮價(jià)格昂貴，為了保證四氘代環(huán)己酮的高轉(zhuǎn)化率，本方法使用了過(guò)量鹽酸羥胺。同樣的，在還原四氘代環(huán)己酮肟時(shí)也使用了過(guò)量的還原劑氫化鋁鋰，最終以65%的總收率得到2,2,6,6-四氘代環(huán)己胺。

圖2 環(huán)己酮的氫-氘交換反應(yīng)Fig.2 Hydrogen-Deuterium exchange reaction of cyclohexone

環(huán)己基氨基磺酸鈉(甜蜜素)的常用合成方法示于圖3，一般以環(huán)己胺為原料，使用氨基磺酸、氯磺酸、三氧化硫-三甲胺復(fù)合物等不同的磺化試劑進(jìn)行磺化反應(yīng)[11-16]，再堿化結(jié)晶得到環(huán)己基氨基磺酸鈉。綜合考慮原料的易得性、腐蝕性和毒性，本研究選擇氨基磺酸為磺化試劑。同時(shí)，參考楊輝榮[14]等的工作，以鄰二氯苯為溶劑，環(huán)己胺和氨基磺酸的當(dāng)量比為1∶2，在160 ℃下反應(yīng)3 h，可以得到環(huán)己基氨基磺酸鈉。經(jīng)過(guò)嘗試，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)升高溫度和延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，有利于提高收率。由于環(huán)己胺的沸點(diǎn)為134 ℃，鄰二氯苯的沸點(diǎn)為179 ℃，為了防止氘代環(huán)己胺逸出反應(yīng)體系，選擇以封管為容器進(jìn)行反應(yīng)，在180 ℃下進(jìn)行4 h，最終以92%的收率得到氨基磺酸。

圖3 甜蜜素的常見合成方法Fig.3 The common method for the synthesis of sodium cyclamate

2.2 產(chǎn)物表征

關(guān)鍵中間體2,2,6,6-四氘代環(huán)己胺的核磁譜圖示于圖4，δ2.64為氨基α位氫的核磁信號(hào)，δ2.03為氨基氫的核磁信號(hào)，因與水的信號(hào)重疊，積分大于2，δ1.00～1.72之間的為環(huán)己烷3,4,5位6個(gè)氫的核磁信號(hào)。

產(chǎn)物2,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸鈉的核磁譜圖示于圖5，δ3.79為磺酰胺N-H的核磁信號(hào)，δ2.84為環(huán)己基1位氫的核磁信號(hào)，δ1.02～1.62之間的為環(huán)己烷3,4,5位6個(gè)氫的核磁信號(hào)。

圖4 2,2,6,6-四氘代環(huán)己胺的1H NMR譜圖Fig.4 1H NMR spectra of 2,2,6,6-tetradeuterium cyclohexylamine

圖5 2,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸鈉的1H NMR譜圖Fig.5 1H NMR spectra of sodium 2,2,6,6-tetradeuterium cyclohexyl sulfamate

采用負(fù)離子模式分析產(chǎn)物2,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸鈉的串聯(lián)質(zhì)譜行為。m/z182為2,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸根負(fù)離子[M-Na]-，二級(jí)譜圖可以看到裂解后主要得到m/z80的子離子[SO3]·-，還有少量m/z97的子離子[HDNSO3]-。其質(zhì)譜譜圖和裂解模式示于圖6。

圖6 2,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸鈉的MS/MS譜圖和裂解模式Fig.6 MS/MS spectra and fragmentation pattern of sodium 2,2,6,6-tetradeuterium cyclohexyl sulfamate

3 結(jié)論

本文以環(huán)己酮為原料，以便宜易得的重水為穩(wěn)定同位素標(biāo)記源，經(jīng)過(guò)氫-氘交換，還原胺化，磺?；汝P(guān)鍵步驟，合成了2,2,6,6-四氘代環(huán)己基氨基磺酸鈉。采用多次氫-氘交換的同位素標(biāo)記策略，保障產(chǎn)物中氘的同位素豐度不低于99%，能很好的作為內(nèi)標(biāo)試劑用于甜蜜素的定性定量分析或者示蹤劑用于科學(xué)研究。