柑橘黃龍病對沙田柚樹體特性和果實(shí)品質(zhì)的影響

王飛燕 張瑞敏 吳文 朱從一 黃永敬 陳杰忠 曾繼吾

摘 ?要：柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing，簡稱HLB）是柑橘的毀滅性病害，柑橘感染后不僅導(dǎo)致葉片黃化，影響果實(shí)品質(zhì)，而且會使樹勢減弱直至植株死亡。本研究以感染黃龍病和健康沙田柚[Citrus maxima （Burm.） Merr. cv. Shatian Yu]為材料，對比分析黃龍病樹（HLB+）和健康樹（HLB）在葉片形態(tài)特征、果實(shí)品質(zhì)、礦質(zhì)元素等方面的差異，旨在掌握黃龍病對沙田柚樹體和果實(shí)的影響，為促進(jìn)柑橘黃龍病的防控提供理論參考。沙田柚黃龍病植株與健康植株相比，葉片面積減少28.13%，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素分別降低40.38%、44.00%和40.47%;果實(shí)外觀著色異常且果實(shí)偏小，平均單果重下降45.62%，果皮變薄，種子敗育增多，果實(shí)維生素C升高26.44%，達(dá)到顯著水平，并且不同組織的多個元素發(fā)生顯著變化。與健康植株相比，黃龍病葉片N和Ca元素分別減少19.00%和49.72%，果肉N元素減少18.00%，而果皮和果肉Ca元素顯著升高;病樹根、葉片、果皮和果肉S元素均顯著低于健康樹。病樹葉片B和Cu元素分別降低了35.07%和54.45%，果皮Cu元素顯著降低了42.96%，果肉Zn元素顯著升高了41.30%。黃龍病嚴(yán)重影響了沙田柚葉片形態(tài)和果實(shí)品質(zhì)以及礦質(zhì)元素代謝，應(yīng)高度重視提高沙田柚果園的黃龍病防控管理水平。

關(guān)鍵詞：柑橘黃龍病;沙田柚;色澤;品質(zhì);礦質(zhì)元素

中圖分類號：S436.66 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： Citrus Huanglongbing （HLB） is a devastating disease that seriously affects the development of citrus industry. It not only leads to leaf yellowing and affects the fruits quality， but also affects the life cycle of citrus trees. In order to investigate the effects of HLB on Shatian pomelo [Citrus maxima （Burm.） Merr. cv. Shatian Yu]， the effects of HLB on the leaf morphological characteristics and fruit appearance and internal quality as well as mineral elements of Shatian pomelo were systematically analyzed. The result could provide references for the control of citrus HLB. In this study， the HLB positive Shatian pomelo trees and fruits were used for the experimental group （HLB+） and the HLB negative Shatian pomelo trees and fruits were used as the control group （HLB）. The leaf area， content of chlorophyll a， chloro-phyll b and carotenoid of HLB+ leaf decreased by 28.13%， 40.38%， 44.00% and 40.47%， respectively. The color of the HLB+ fruits was abnormal and the fruits of HLB+ was smaller. The average fruit weight of HLB+ fruits decreased by 45.62%. The HLB+ fruits had thinner peels and its most seeds could not develop normally. The vitamin C content of HLB+ fruits was significantly higher than that of HLB fruits， increased by 26.44%. The content of mineral elements in different tissues changed obviously after infection with HLB. The content of N and Ca of the leaves decreased by 19.00% and 49.72%， respectively， and the content of N of the pulp decreased by 18.00%， but the content of Ca of HLB+ peel and pulp significantly increased compared to the HLB peel and pulp. And the content of S of the HLB+ trees was significantly lower than that of the healthy trees. The content of B and Cu of the HLB+ leaf decreased by 35.07% and 54.45%， respectively. The content of Cu of the HLB+ peel decreased by 42.96% and the content of Zn of the HLB+ pulp increased by 41.30%. HLB seriously affected the leaf morphology， fruit quality and mineral element metabolism of Shatian pomelo trees. So more attention should be paid to the prevention and control of HLB-infected Shatian pomelo.

Keywords： Citrus Huanglongbing; Citrus maxima （Burm.） Merr. cv. Shatian Yu; color; quality; mineral elements

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.018

沙田柚[Citrus maxima （Burm.） Merr. cv. Shatian Yu]是蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus）的一個栽培品種，是我國柚類著名良種，因其風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富、耐貯藏等特點(diǎn)而馳名中外，深受消費(fèi)者喜愛。沙田柚原產(chǎn)廣西，現(xiàn)廣泛栽培于廣西、廣東、湖南等省（區(qū)），僅廣東省梅州沙田柚種植面積超過2萬hm2，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，為經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。由于黃龍病的猖獗蔓延，使得沙田柚的種植面積和產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響，阻礙了包括沙田柚在內(nèi)的柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。

柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing， HLB）是世界范圍內(nèi)柑橘生產(chǎn)的毀滅性病害，由韌皮部桿菌（Candidatus Liberibacter spp.）引起，該病原能感染柑橘不同品種，并于1995年正式命名為柑橘黃龍病[2]。該病在柑橘葉片、果實(shí)、花、根部、種皮、莖部等部位均顯示癥狀，但癥狀會因品種不同而有差異[3-5]。黃龍病危害后的葉片出現(xiàn)斑駁黃化、均勻黃化和缺素狀黃化3種類型，另外，染病植株容易早期落果，保留的部分果實(shí)，品質(zhì)也發(fā)生變化[6]。柑橘果實(shí)富含糖類、生物堿類、檸檬苦素類、有機(jī)酸、黃酮類、礦物質(zhì)及維生素類等物質(zhì)[7-9]。植株的營養(yǎng)水平和色素代謝明顯影響果實(shí)的品質(zhì)[10]，沙田柚果實(shí)的糖、酸含量和固酸比或糖酸比為沙田柚果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)，沙田柚感染黃龍病后，嚴(yán)重影響果實(shí)的外觀和內(nèi)在品質(zhì)，降低其商品價值，成為制約沙田柚產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[11-12]。

因此，本研究通過對比分析沙田柚健康和感染黃龍病植株的形態(tài)特征、果實(shí)品質(zhì)、礦質(zhì)元素等方面的差異，具體量化了黃龍病對沙田柚樹體和果實(shí)的影響，研究結(jié)果可為沙田柚果園的管理升級和柑橘黃龍病的防控措施優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料為種植于梅州市梅縣城東鎮(zhèn)的沙田柚成年樹，沙田柚無癥狀植株和黃龍病癥狀植株均為同一地段。根據(jù)沙田柚黃龍病田間典型癥狀進(jìn)行識別，對病樹外圍有枝梢黃化、葉片不對稱斑駁黃化、果實(shí)不能正常成熟等特征進(jìn)行取樣。無癥狀植株和黃龍病癥狀植株各選3株植株，分別標(biāo)注HLB1、HLB2、HLB3和HLB+1、HLB+2、HLB+3。

1.2 ?方法

1.2.1 ?沙田柚病樹黃龍病菌檢測 ?從每株植株外圍四方和內(nèi)堂等5個方位采集30片葉，混合粉碎后進(jìn)行黃龍病菌檢測。采用CTAB法提取DNA[13]。PCR擴(kuò)增引物為5-GGAGAGGTG?A?GT?-GGAAT TCCGA-3，5-ACCCAACATCTAGGT-AAAAA?CC- 3[14]。擴(kuò)增體系：Taq mix 12.5 μL;Primer-f 1.0 μL;Primer-r 1.0 μL;DNA模板1.0 μL;H2O 9.5 μL，總體積25.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35個循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，擴(kuò)增帶大小約500 bp。根據(jù)PCR鑒定結(jié)果確定其中的黃龍病陽性植株（HLB+）和健康植株（HLB），并將其用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 ?葉片葉綠素及葉面積測定 ?根據(jù)PCR檢測結(jié)果確定的黃龍病陽性植株（HLB+）和健康植株（HLB），從每株植株中采集30片葉，分別進(jìn)行粉碎混合，參照Arnon的方法[15]進(jìn)行優(yōu)化，采用乙醇與丙酮等體積浸提法提取葉綠素[16]，并通過Lichtenthaler[17]修正的公式計算3種色素含量。

每株植株隨機(jī)選取30片鮮葉，并進(jìn)行恒溫烘干至恒重，葉片鮮重與干重差值為葉片含水量。采用掃描儀對每株植株各掃描20片鮮葉，采用Image J 1.51計算葉面積。

1.2.3 ?沙田柚品質(zhì)測定 ?從每株黃龍病陽性植株（HLB+）和健康植株（HLB）各隨機(jī)選取10個果實(shí)，分別測定可溶性固形物、可滴定酸、維生素C、還原糖、蔗糖。用手持折光儀測定果實(shí)可溶性固形物含量，采用2，6-二氯靛酚鈉滴定法測定維生素C，采用蒽酮法測定果實(shí)總糖和蔗糖含量，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定還原糖含量[18]，采用堿滴定法測定總酸[19]。

同時從其中選取5個果實(shí)，用色差儀（HP- 200）沿果實(shí)赤道線取三位點(diǎn)進(jìn)行果實(shí)色差測定，分析黃龍病對沙田柚果實(shí)色差的影響。色差采用常用的L*值、a*值、b*值C*以及h0表示。L*值表示表面亮暗，L*值越大則樣品表面越亮;a*值表示紅綠色差，其正值為紅色，負(fù)值為綠色;b*值代表黃色與藍(lán)色相比的程度，b*值越大，表明果實(shí)黃色越深;h0值表示色澤的色調(diào)角，在0°～90°色調(diào)角范圍內(nèi)，隨著角度的增大，顏色依次從紫紅色（0°）、紅色、橙紅色、橙黃色到黃色（90°）過渡;C*值表示色澤的色飽和度，C*值越大，色澤越鮮艷;h0值在90°～180°范圍內(nèi)，則顏色從黃綠色、綠色到藍(lán)綠色（180°）過渡;而a*/b*值基本能夠反映果實(shí)的真實(shí)色澤[20]。

1.2.4 ?不同組織中元素的測定 ?從每株黃龍病陽性植株（HLB+）和健康植株（HLB）中采集根、葉、果皮和果肉。依次分別用清水、洗滌劑、超純水洗滌3次。烘箱105 ℃殺青0.5 h，80 ℃烘3 h至恒重。粉碎機(jī)粉碎后過40目篩子。采用凱氏定氮法[21]和原子吸收方法[22]測定樣品的大量元素N、P、K，中量元素Ca、Mg、S以及微量元素Fe、Mn、B、Zn、Cu等11種元素。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.4軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及相關(guān)性分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?沙田柚葉片黃龍病菌檢測結(jié)果分析

PCR檢測結(jié)果表明，有明顯黃龍病癥狀的3株植株顯示約500 bp電泳帶，黃龍病菌呈陽性;而無癥狀3株植株未顯示電泳帶而呈陰性（圖1），說明供試的有癥狀植株感染了黃龍病菌，而無癥狀植株為未感染黃龍病，兩種植株可用于后續(xù)試驗(yàn)材料。

2.2 ?黃龍病對沙田柚葉片的影響

通過對HLB和HLB+植株葉片掃描計算葉面積，結(jié)果表明，HLB+植株平均葉面積比HLB減小28.13%，呈顯著性差異（圖2A，表1）。葉片葉綠素和類胡蘿卜素測定結(jié)果顯示，HLB+葉片葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量比HLB分別降低了61.65%、64.79%和57.58%;HLB和HLB+植株的3種色素均呈顯著差異;HLB和HLB+葉片含水量分別為58.90%和59.10%，無顯著性差異。說明黃龍病可影響沙田柚葉片相關(guān)色素的合成或分解代謝，但不影響葉片的含水量，葉片斑駁黃化與含水量無相關(guān)性。

2.3 ?黃龍病對沙田柚果實(shí)外觀品質(zhì)的影響

由表2可知，HLB+果實(shí)L*值比HLB低12.45%，HLB+果實(shí)b*值比HLB低9.87%，L*值和b*值均呈差異顯著;HLB+和HBL?植株的果實(shí)a*值均為負(fù)值，但無顯著性差異。HLB+和HLB果實(shí)的L*值和b*值呈顯著性差異和其外觀表型結(jié)果一致，說明沙田柚感染黃龍病后，會影響果實(shí)亮度和黃藍(lán)色比例導(dǎo)致外觀品質(zhì)不佳。HLB+和HLB果實(shí)h0值均在90°～180°范圍內(nèi)，HLB+和HLB果實(shí)的a*/b*值分別為-0.41和-0.32，h0值和a*/b*值均無顯著性差異。

HLB+和HLB果皮色澤指標(biāo)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：HLB果皮L*值分別與a*值、a*/b*值呈極顯著和顯著正相關(guān)，a*值與a*/b*值呈顯著正相關(guān)。而HLB+果皮僅b*值與C值呈顯著正相關(guān)，其他指標(biāo)之間無顯著性相關(guān)（表3）。這在一定程度上說明黃龍病對沙田柚果皮色澤的形成過程產(chǎn)生影響。

2.4 ?沙田柚感染黃龍病后對果實(shí)品質(zhì)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，沙田柚感染黃龍病后，果皮厚度比未感染黃龍病的果皮薄了14.37%，呈顯著性差異;HLB+果的敗育種子數(shù)量比HLB顯著增多了將近兩倍（圖2B，表4）;單果重下降了46.03%，呈差異顯著（表4）。說明黃龍病可導(dǎo)致沙田柚果皮變薄，提高果實(shí)種子敗育率，且明顯降低單果重。

HLB+和HLB果實(shí)品質(zhì)分析表明，HLB+果實(shí)的維生素C含量比HLB升高了26.44%，呈顯著性差異;而HLB+和HLB果實(shí)的可溶性固形物、可滴定酸、還原糖、蔗糖、糖酸比、固酸比均無顯著性差異（表5），說明黃龍病能顯著影響沙田柚果實(shí)的維生素C代謝。

2.5 ?黃龍病菌感染對沙田柚不同組織元素含量的影響

2.5.1 ?黃龍病菌感染對沙田柚不同組織大量和中量元素的影響 ?對HLB和HLB+植株不同組織的N、P、K、Ca、Mg、S 6種元素進(jìn)行測定，結(jié)果表明，HLB+葉片中N和Ca元素分別比HLB的降低了18.64%和49.72%，達(dá)顯著性差異，病樹葉片N元素降低，田間表現(xiàn)為葉片黃化。HLB+果肉中的N比HLB降低了17.59%，而Ca元素升高了32.92%，兩者均呈顯著性差異;HLB+果皮中的Ca比HLB升高了37.43%，呈顯著性差異。因此，HLB+果實(shí)（果皮和果肉）中的Ca高于HLB果實(shí)，異于其他組織的元素分布（表6）。

HLB+植株根系、葉片、果皮、果肉中的S分別比HLB降低了32.76%、37.73%、60.47%、53.49%，根據(jù)顯著性分析，HLB根系、葉片、果皮和果肉中的S均顯著高于HLB+。HLB?和HLB+根系、葉片、果皮和果肉中的P、K、Mg元素含量均無顯著性差異（表6）。說明黃龍病對沙田柚不同組織的大量和中量元素存在不同程度的影響，其中對N、Ca和S元素的影響較大。

2.5.2 ?黃龍病菌感染對沙田柚不同組織微量元素的影響 ?對HLB+和HLB不同組織的Fe、Mn、B、Zn、Cu 5種微量元素進(jìn)行分析，結(jié)果表明，HLB+葉片中B和Cu分別比HLB的降低了34.74%和54.45%，果皮中Cu降低了42.96%，HLB+和HLB植株葉片B、Cu和果皮Cu均呈顯著性差異。HLB+果肉Zn比HLB的升高了41.30%，呈顯著性差異。Fe和Mn在HLB+和HLB間差異不顯著（表7）。

2.5.3 ?黃龍病對沙田柚葉片特性和果實(shí)品質(zhì)與礦質(zhì)元素相關(guān)性的影響 ?對HLB和HLB+葉片指標(biāo)與其11種礦質(zhì)元素進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HLB葉片Zn與類胡蘿卜素呈極顯著正相關(guān)，而Mg與類胡蘿卜素呈顯著負(fù)相關(guān)。另外，HLB葉片F(xiàn)e和K分別與葉片葉面積和含水量呈顯著正相關(guān)（表8）。由此可知，HLB葉片Zn、Mg、Fe、K元素與葉片特征指標(biāo)存在顯著相關(guān)性，而HLB+葉片的11種礦質(zhì)元素與葉片指標(biāo)無顯著相關(guān)性，黃龍病對沙田柚葉片營養(yǎng)和發(fā)育存在明顯的影響。

通過對HLB和HLB+果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)與其11種礦質(zhì)元素含量進(jìn)行相關(guān)性分析可知，HLB果實(shí)的Mg和Fe與還原糖含量呈顯著負(fù)相關(guān);HLB+果實(shí)中P和Mn與可滴定酸呈顯著負(fù)相關(guān)，而和發(fā)育正常種子數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)（表9）。

3 ?討論

3.1 ?黃龍病影響沙田柚葉片組織分化和果實(shí)正常發(fā)育

據(jù)報道，柑橘黃龍病可導(dǎo)致葉片不均勻斑駁黃化或缺鋅癥狀黃化，葉片變小，葉片葉綠素含量降低;果實(shí)變小，果皮光滑，無光澤，風(fēng)味差，且著色不均勻[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)黃龍病沙田柚葉片出現(xiàn)黃綠相間的斑駁黃化，葉片比健康樹小，且葉綠素和類胡蘿卜素含量明顯小于健康葉片，與前人報道一致。發(fā)現(xiàn)黃龍病果明顯偏小，HLB+和HLB的果實(shí)亮度和黃藍(lán)色差均存在顯著差異。因此，柑橘黃龍病可影響沙田柚果皮的正常著色和葉片特性，其具體機(jī)理還需進(jìn)一步探討。

柑橘果實(shí)的生長發(fā)育與水和干物質(zhì)的積累有重要關(guān)系。柑橘受水分缺失脅迫的情況下，果實(shí)通常較小，果皮變厚，但隨施水量增加，果汁的TSS含量和酸度減少，固酸比和果汁量與施水量存在正相關(guān)關(guān)系[25]。黃龍病枝條的水運(yùn)輸和物質(zhì)積累受阻，使果實(shí)生長發(fā)育包括大小、重量和固酸比均降低，但果實(shí)酸度增加。Dagulo等[26]和Raithore等[27]均對比分析了哈姆林甜橙（Hamlin）、瓦倫西亞橙（Valencia）健康果實(shí)和具黃龍病癥狀的果實(shí)品質(zhì)，與健康果實(shí)相比，黃龍病果實(shí)的TSS減少量、檸檬酸增加量和固酸比的變化相似。Bassanezi等[6]測定了巴西多個感黃龍病甜橙品種的果實(shí)品質(zhì)，大部分品種感染黃龍病后，TSS含量、酸度、固酸比和果汁率等品質(zhì)指標(biāo)變化明顯。本研究發(fā)現(xiàn)黃龍病可顯著增加沙田柚果實(shí)維生素C含量，而對TSS、TA、還原糖和蔗糖的影響不明顯。

據(jù)報道，果實(shí)的N、K、Cu累積和Ca、Zn下降可導(dǎo)致果實(shí)可滴定酸和維生素C含量下降[28]。本研究中，黃龍病果果肉的N、Ca、Zn 3種礦質(zhì)元素含量與健康果肉相比發(fā)生了顯著變化，N元素顯著降低，而Ca和Zn元素卻顯著升高，這可能與黃龍病果實(shí)維生素C含量顯著升高有關(guān)。另外，HLB+果皮明顯比HLB的薄，HLB果皮厚度與Ca和S元素相關(guān)系數(shù)為分別為-0.94和0.88，HLB+果皮Ca和S元素分別為顯著增加和降低，因此，黃龍病影響果皮礦質(zhì)元素可能導(dǎo)致HLB+果皮變薄。

3.2 ?黃龍病影響沙田柚樹體元素的含量

柑橘黃龍病植株篩管胼胝質(zhì)大量積累，出現(xiàn)堵塞，因此，對于營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸形成障礙，影響了營養(yǎng)物質(zhì)正常流動[29]。同時，元素運(yùn)輸還受病原菌毒素或Fe和Zn螯合物載體的影響[30]。本研究顯示，沙田柚HLB和HLB+同種組織的元素存在差異，但在不同組織中的變化趨勢不同。N、P、K 3種元素中，HLB和HLB+僅葉片和果肉的N元素呈顯著性差異，推測黃龍病對葉片和果肉中的N運(yùn)輸影響更大。Ca元素僅在根部無顯著性差異，且HLB+果肉和果皮的Ca元素含量比HLB高，可能在HLB+果實(shí)中Ca離子代謝異常，導(dǎo)致Ca離子大量積累，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。微量元素對次生代謝活動和細(xì)胞結(jié)構(gòu)分化具有重要意義[31]。而HLB+多個組織的B、Zn、Cu元素和HLB均呈顯著差異，因此，黃龍病植株各類組織發(fā)育異?？赡芘c微量元素有關(guān)。

4 ?結(jié)論

沙田柚植株感染黃龍病后，葉片色素代謝和組織發(fā)育異常，果實(shí)表型等指標(biāo)發(fā)生顯著變化，樹體和果實(shí)營養(yǎng)元素也受到影響。葉片葉綠素等光合色素含量下降，嚴(yán)重影響光合作用，同時不同組織的多個營養(yǎng)元素含量顯著變化，對各類組織的形態(tài)發(fā)生產(chǎn)生重要影響。初步了解黃龍病樹的發(fā)育和營養(yǎng)分布特性，為進(jìn)一步研究黃龍病感染植株的異常生理代謝機(jī)制及其主要誘因奠定了基礎(chǔ)，同時為提高沙田柚果園黃龍病的防控管理水平提供參考依據(jù)。

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