烏司他丁對(duì)煙霧吸入性肺損傷大鼠肺組織細(xì)胞凋亡和炎癥的影響

劉欣健 崔正軍 張樹(shù)堂 王常印 郭鵬飛 孟慶楠 周 健 鄒仕波 王 旭 余祖改

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷修復(fù)重建外科，河南 鄭州 450000）

煙霧吸入性肺損傷在我國(guó)仍時(shí)有發(fā)生，輕者僅有咳嗽、胸悶等癥狀，重者可出現(xiàn)急性肺損傷、呼吸功能衰竭，危及生命［1］。煙霧吸入性肺損傷致病機(jī)制尚不完全明確，也無(wú)有效的治療方法。研究證實(shí)，煙霧吸入性肺損傷所致的呼吸道損傷并不僅僅是熱力燒傷所致，還與細(xì)支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等肺組織細(xì)胞的凋亡有關(guān)［2］。導(dǎo)致吸入性損傷的煙霧中含有多種化學(xué)物質(zhì),這些物質(zhì)具有毒性和腐蝕性，不僅會(huì)引起支氣管上皮細(xì)胞壞死，而且會(huì)導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮的凋亡［2］。細(xì)胞凋亡在煙霧吸入性肺損傷的病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，應(yīng)用藥物抑制吸入性肺損傷時(shí)肺組織細(xì)胞的凋亡，可能有助于煙霧吸入性肺損傷的改善。烏司他?。╱linastatin）是抑制炎癥反應(yīng)的常用藥物［3］。近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，烏司他丁能抑制體內(nèi)多種細(xì)胞的凋亡，如周圍神經(jīng)損傷小鼠脊髓神經(jīng)元、膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞、膿毒癥肺泡上皮等［4-6］。但烏司他丁對(duì)煙霧吸入性肺損傷肺支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞的凋亡及炎癥抑制作用研究較少。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)構(gòu)建大鼠煙霧吸入性損傷模型，探討烏司他丁對(duì)煙霧吸入性損傷大鼠肺組織細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 煙霧吸入性肺損傷動(dòng)物模型的制備 采用本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的煙霧生成裝置和致傷裝置（見(jiàn)圖1）模擬火災(zāi)導(dǎo)致的煙霧吸入性肺損傷，待燃燒松木屑后煙霧出現(xiàn)時(shí)，將SD大鼠置于致傷裝置內(nèi)上部并封閉，每批3只，致傷裝置內(nèi)溫度始終保持在55～70 ℃，7 min后結(jié)束。

圖1 自制煙霧生成裝置（A）和致傷裝置（B）

1.2 動(dòng)物分組與處理 健康清潔級(jí)成年SD大鼠27只，體重200 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(豫)2017-0001。隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為3組（n=9）:對(duì)照組、吸入組和烏司他丁組。吸入組和烏司他丁組建立煙霧吸入性肺損傷模型，模型制備成功后，烏司他丁組給予烏司他丁1×104U/kg腹腔注射，吸入組和對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 血清白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量測(cè)定 模型制備成功后24 h，經(jīng)腹主動(dòng)脈取全血2 ml,常溫靜置1 h，以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，上層血清以注射器抽出留存。血清IL-6和TNF-α含量采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)，操作步驟按說(shuō)明書(shū)要求。

1.4 肺組織病理學(xué)分析 模型制備成功后24 h，切取雙側(cè)肺組織，4%甲醛固定標(biāo)本，乙醇脫水，二甲苯透明、石蠟包埋、超薄切片，脫蠟、水化、蘇木素-伊紅染色，顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變，包括肺支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞的變化及炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.5 免疫組化法檢測(cè)Bax/Bcl-2蛋白表達(dá) 石蠟包埋組織塊，切片，脫蠟、脫水，抗原修復(fù)，一抗孵育，二抗孵育，DAB染色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，脫水，二甲苯浸泡5 min后中性樹(shù)膠封片。Bax蛋白一抗孵育比例為1:200；Bcl-2蛋白一抗孵育比例為1:200。光鏡下見(jiàn)胞漿中有黃色顆粒為陽(yáng)性，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.6 肺組織細(xì)胞凋亡檢測(cè) 肺組織石蠟切片行細(xì)胞凋亡原位標(biāo)記，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，PBS沖洗，在37 ℃條件下TUNEL反應(yīng)液孵化60 min，PBS沖洗，加25 μl堿性磷酸酶抗體，在37 ℃條件下以孵化盒孵化30 min，PBS沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片并烘干，光鏡下選取10個(gè)顯微鏡視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)和全部細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）。

1.7 肺組織IL-6、TNF-α蛋白及凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase-3的測(cè)定 取左下肺組織，-80 ℃凍存，提取組織蛋白，Western blot法檢 測(cè) 肺 組 織 內(nèi)IL-6、TNF-α 及cleavedcaspase-3的蛋白表達(dá)，根據(jù)蛋白提取試劑盒的操作步驟分離胞質(zhì)蛋白，電泳分離蛋白樣品后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。脫脂奶粉封閉，在4℃下分別與IL-6抗體（1:1 000）、TNF-α抗體（1:300）、cleaved-caspase-3抗體（1:1 200）孵育過(guò)夜，以β-actin作為內(nèi)參，充分洗膜后加二抗（1:2 000）室溫孵育1 h，曝光洗片，以Image J軟件分析條帶。

1.8 統(tǒng)計(jì)法分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，多組間比較用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量的比較 吸入組血清TNF-α、IL-6表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；烏司他丁組TNF-α、IL-6表達(dá)明顯低于吸入組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠血清IL-6和TNF-α含量的比較（，n=9，pg/ml）

表1 3組大鼠血清IL-6和TNF-α含量的比較（，n=9，pg/ml）

注：與對(duì)照組比較：*P＜0.05;與吸入組比較：#P＜0.05

組別 IL-6 TNF-α對(duì)照組 38.33±1.91 108.96±12.02吸入組 420.19±15.92* 218.75±9.25*烏司他丁組 327.01±18.13#* 142.51±6.73#*

2.2 組織觀察 對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔完整，間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；吸入組肺組織間質(zhì)可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，充血，肺組織結(jié)構(gòu)破壞。烏司他丁組介于二者之間，較吸入組炎癥明顯減輕，見(jiàn)圖2（封二）。

2.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 鏡下觀察可見(jiàn)，TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞集中在肺泡上皮細(xì)胞和細(xì)支氣管上皮細(xì)胞，見(jiàn)圖3（封二）。吸入組凋亡指數(shù)為40.506±1.991，對(duì)照組凋亡指數(shù)為20.413±1.148，烏司他丁組凋亡指數(shù)為31.262±0.977。吸入組凋亡指數(shù)比烏司他丁組和對(duì)照組明顯增高（P＜0.05）,烏司他丁組較吸入組凋亡指數(shù)明顯減少（P＜0.05）。顯示煙霧吸入性肺損傷導(dǎo)致大鼠肺組織細(xì)胞凋亡明顯增加，烏司他丁能使其細(xì)胞凋亡明顯減少。

2.4 大鼠肺組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 促凋亡蛋白Bax在吸入組表達(dá)較多，在對(duì)照組和烏司他丁組表達(dá)相對(duì)較少（表達(dá)蛋白呈黃色）；抑凋亡蛋白Bcl-2在吸入組表達(dá)較少，在對(duì)照組和烏司他丁組表達(dá)較多（表達(dá)蛋白呈黃色），見(jiàn)圖4(封二)。

2.5 肺組織蛋白提取物中TNF-α、IL-6、cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組相比，吸入組IL-6、TNF-α、cleaved-caspase-3的表達(dá)均明顯增加（P＜0.05），烏司他丁組IL-6、TNF-α、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)含量明顯少于吸入組（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot法檢測(cè)肺組織蛋白提取物中IL-6、TNF-α、cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)情況

3 討 論

煙霧吸入性急性肺損傷的致病機(jī)制尚未完全明確，目前仍是臨床治療的難題和研究熱點(diǎn)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)煙霧吸入會(huì)誘發(fā)大量肺細(xì)支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的肺通氣和換氣功能障礙［7-8］。Wu等［9］發(fā)現(xiàn)，煙霧吸入性損傷2 h后，血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺內(nèi)炎癥細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯增加。

凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，其發(fā)生與多種基因的激活與表達(dá)相關(guān)。凋亡與炎癥的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜。IL-6在機(jī)體感染免疫反應(yīng)中起重要作用，是反映機(jī)體炎癥水平的重要分子。本研究中煙霧吸入導(dǎo)致大鼠血清、肺組織中IL-6表達(dá)水平均明顯升高。TNF-α可能是凋亡的啟動(dòng)介質(zhì)，可通過(guò)激活線粒體膜上Bax蛋白，進(jìn)而使細(xì)胞色素C得以穿過(guò)線粒體膜而激活caspase-9,并逐步激活caspase-3蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10］。凋亡細(xì)胞釋放出多種炎癥介質(zhì)引起炎癥加重，TNF-α等炎癥介質(zhì)也可作為凋亡啟動(dòng)因子。由此可見(jiàn)，煙霧吸入導(dǎo)致大鼠肺組織損傷的機(jī)制不僅包含炎性損傷還包含肺組織細(xì)胞的凋亡。

烏司他丁可以抑制纖溶酶等多種酶的活性，穩(wěn)定細(xì)胞溶酶體膜，抑制溶酶體釋放，目前在臨床上應(yīng)用較廣泛［11］。烏司他丁能減輕吸入性損傷患者肺內(nèi)炎癥，但其具體機(jī)制尚不十分清楚。對(duì)于烏司他丁能否抑制煙霧吸入引起的肺組織細(xì)胞凋亡尚無(wú)研究報(bào)道 。

本研究中發(fā)現(xiàn)，煙霧吸入會(huì)導(dǎo)致大鼠肺組織炎癥加重，肺組織細(xì)胞凋亡增加，表現(xiàn)為肺組織炎性浸潤(rùn)加重，細(xì)支氣管上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞脫落壞死增多，促凋亡蛋白Bax表達(dá)增高，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，凋亡指數(shù)明顯增加。烏司他丁組和吸入組相比，大鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，細(xì)支氣管上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞脫落壞死減少，促凋亡蛋白Bax表達(dá)相對(duì)減少，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)相對(duì)上升，凋亡指數(shù)明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)了烏司他丁能夠保護(hù)肺組織，具有抗細(xì)胞凋亡的作用。

烏司他丁能抑制煙霧吸入導(dǎo)致的肺組織細(xì)胞 中cleaved-caspase-3的 增 加。cleavedcaspase-3是caspase-3的活化形式，在細(xì)胞凋亡時(shí)，caspase-3會(huì)被切割成17 kD的大亞基和12 kD的小亞基，大、小亞基二聚化形成活化形式的cleaved-caspase-3。因此，cleavedcaspase-3能較準(zhǔn)確地反映組織細(xì)胞的凋亡水平。李永寧等［12］研究發(fā)現(xiàn)，烏司他丁能夠抑制膿毒癥大鼠肺組織中肺泡上皮細(xì)胞和抗血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，減少肺組織中caspase-3蛋白的表達(dá)。竇史慈等［13］研究發(fā)現(xiàn)，烏司他丁能抑制周圍神經(jīng)損傷小鼠脊髓神經(jīng)元的凋亡，降低脊髓神經(jīng)元凋亡蛋白caspase-3和caspase-12的表達(dá)。表明，烏司他丁不僅對(duì)煙霧吸入引起的肺組織細(xì)胞的凋亡及炎癥有抑制作用，還能抑制其他包括膿毒癥、神經(jīng)損傷在內(nèi)的多種疾病引起的組織細(xì)胞的凋亡及炎性反應(yīng)。

綜上所述，本研究通過(guò)觀察烏司他丁對(duì)煙霧吸入性損傷大鼠模型肺組織炎性反應(yīng)與凋亡的影響發(fā)現(xiàn)，煙霧吸入會(huì)導(dǎo)致大鼠肺組織細(xì)胞炎性反應(yīng)及凋亡水平增高；烏司他丁能明顯降低煙霧吸入引起的肺組織細(xì)胞的凋亡及炎癥反應(yīng)，對(duì)肺組織起到保護(hù)作用。未來(lái)需要開(kāi)展更多的研究探討煙霧吸入性肺損傷細(xì)胞凋亡與炎癥機(jī)制及相互作用機(jī)制。