內質網(wǎng)應激相關性細胞凋亡在HMGB1介導嚴重燒傷小鼠脾臟樹突狀細胞功能障礙中的作用

吳 瑤 許碧磊 ,2 郭 方 董 寧 于 燕 祝筱梅 姚詠明

(1.解放軍總醫(yī)院醫(yī)學創(chuàng)新研究部創(chuàng)傷修復與組織再生研究中心，北京 100048；2.武漢市普仁醫(yī)院體檢中心，湖北 武漢 430081)

膿毒癥和多器官功能障礙綜合征（MODS）是現(xiàn)代重癥醫(yī)學的難題，其確切發(fā)病機制尚未充分理解，尤其是對機體免疫功能紊亂的關鍵發(fā)病環(huán)節(jié)以及可調控的作用靶點認識不足，尚沒有可應用于臨床的行之有效的防治措施[1-3]。樹突狀細胞(dendritic cell, DC)是體內功能最強的專職抗原呈遞細胞，其大量凋亡以及抗原呈遞能力的降低是機體免疫功能抑制、抗感染能力下降、并發(fā)膿毒癥的關鍵環(huán)節(jié)[4]。我們團隊的前期研究表明，過度的內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)誘導DC大量凋亡在嚴重燙(燒)傷小鼠免疫功能紊亂發(fā)生的信號機制中具有重要意義[5-6]。但是目前對于過度ERS反應的關鍵誘發(fā)因素尚不明確。高遷移率族蛋白B1 (high mobility group box-1 protein, HMGB1) 作為一種重要的晚期炎癥因子，參與了膿毒癥病理過程。本研究探討HMGB1是否通過誘導ERS反應導致燒傷小鼠脾臟DC過度凋亡，以及拮抗HMGB1對燒傷小鼠的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康 Balb/C小鼠（SPF清潔級），雄性，6～8周，體重（20±2）g，購自北京華阜康科技股份有限公司。CD11c+免疫磁珠、MS柱、LS柱購自德國Miltenyi Biotec公司；藻紅蛋白標記抗CD11c+抗體(PE-CD11c)、細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；HMGB1購自美國R&D公司；HMGB1兔多克隆中和抗體委托北京康為世紀生物科技有限公司定制；Salubrinal（Sal）購自美國Selleck公司；抗GRP78(Bip)抗體、CHOP抗體購自美國Cell Signaling Test公司；β-actin抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔二抗、HRP標記羊抗小鼠二抗購自北京普利萊基因技術有限公司；小鼠淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、RPMI-1640、胎牛血清購自依科賽生物科技有限公司。MiniMACS磁性分選儀為德國Miltenyi Biotec公司產(chǎn)品；流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-7)為北京六一儀器廠產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)Image Quant LAS 4000 為美國GE公司產(chǎn)品。

1.2 小鼠嚴重燒傷模型復制 小鼠禁食12 h，經(jīng)5%水合氯醛0.2 ml腹腔注射進行麻醉，刮剃背部和側腹部毛后，浸于(99.0±0.5)℃水浴中7 s，形成12% TBSA的Ⅲ度燒傷區(qū)，燒傷部位涂20 g/L碘伏進行抗感染處理(每日2次)，傷后1 h耳后皮下注射1 ml/kg林格液抗休克。假傷組小鼠除所浸水浴為37 ℃外，其余處理同燒傷組。

1.3 動物分組與處理 ①燒傷模型小鼠和假傷組小鼠于燒傷后1、2、3、5、7 d處死小鼠，留取血清和脾臟，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清HMGB1水平，Western Blot檢測脾臟HMGB1蛋白水平。②將燒傷模型小鼠和假傷組小鼠均隨機分為3組：HMGB1抗體干預組于燒傷（或假傷）后6 h、18 h經(jīng)尾靜脈注射定制的抗HMGB1中和抗體(兔免疫血清純化產(chǎn)物，抗體效價1:27 000，每只200 μl)；未免疫血清干預組同樣方法給予等量的未經(jīng)免疫的兔血清IgG；生理鹽水對照組同樣方法注射等量生理鹽水。部分批次小鼠用于7 d生存率觀察，各實驗組樣本數(shù)為：燒傷組44只，燒傷后HMGB1抗體干預組45只，燒傷后未免疫血清干預組44只，假傷組（生理鹽水對照）16只。另有部分小鼠于48 h后處死，留取脾臟，Western Blot方法檢測脾臟DC中ERS相關分子蛋白的表達（n=3）。③ 正常小鼠給予亞致死量HMGB1(每只10 μg或20 μg)經(jīng)尾靜脈進行體內注射，48 h后處死小鼠，留取脾臟，分離提純CD11c+DC后用于ERS相關分子蛋白水平的檢測。

1.4 小鼠脾臟DC分離與鑒定 無菌留取小鼠脾臟，嚴格按照試劑盒操作說明，應用鼠淋巴細胞分離液(Ficoll-Paque)分離出單個核細胞懸液，與CD11c+免疫磁珠共孵育，用MiniMACS磁化細胞分選儀分離純化，所獲得的DC細胞進行細胞活性鑒定和純度檢測，確定適合用于后繼實驗。

1.5 HMGB1誘導DC凋亡及ERS反應的體外實驗正常小鼠脾臟DC 用細胞培養(yǎng)液(RPMI-1640，含10%胎牛血清)重懸，調整為2×106/ml，接種到細胞培養(yǎng)板，細胞培養(yǎng)箱中進行適應性培養(yǎng)（37oC，5%CO2)，24 h后隨機分為以下5組：正常對照組，1 ng/ml HMGB1低劑量刺激組，10 ng/ml HMGB1中劑量刺激組，100 ng/ml HMGB1高劑量刺激組，以及salubrinal (Sal)干預組（20 μmol/L Sal預處理1 h后加入HMGB1刺激），培養(yǎng)24 h后收集各組細胞，檢測DC凋亡及DC中ERS相關分子蛋白水平。

1.6 DC凋亡率測定 收集細胞，預冷PBS洗滌2次，用 100 μl結合緩沖液（binding buffer）重懸，按照試劑盒說明進行PE-Annexin Ⅴ和7-AAD染色，避光孵育(室溫，15 min)后，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.7 Western blot檢測小鼠脾臟HMGB1及ESR相關分子GRP78、XBP-1、sXBP-1、CHOP蛋白表達 收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次后離心棄上清，細胞團加入200 μl細胞裂解液 (含混合蛋白酶抑制劑)充分混勻，放置冰上30 min，然后浸入液氮反復凍融3次，低溫高速離心機12 000 r/min離心15 min，留取上清，利用BCA法進行蛋白濃度測定，調整蛋白濃度一致后按比例與上樣緩沖液混勻，98 ℃煮沸5 min，冷卻，4 ℃冰箱保存。經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）進行蛋白電泳后電轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室溫下應用10%脫脂奶粉溶液孵育2 h，按順序進行相應的一抗、二抗孵育后，凝膠成像系統(tǒng)進行顯影，Quantity One軟件分析，結果以灰度值表示。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，q檢驗進行組間兩兩比較；χ2檢驗比較各組存活率差異。雙側P＜0.05認為有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1 嚴重燒傷致HMGB1水平升高及抗HMGB1中和抗體的保護作用 與假傷組相比，小鼠脾臟及血清HMGB1蛋白水平在燒傷后1 d即有明顯升高，于燒傷后2～3 d達到峰值，并持續(xù)保持較高水平至5～7 d（見圖1）。于傷后6、18 h給于抗HMGB1中和抗體干預，以未免疫兔血清IgG為對照，觀察小鼠7 d生存率，結果顯示，嚴重燒傷小鼠7 d存活率為38.64%（17/44只），抗HMGB1中和抗體可有效提高燒傷小鼠7 d存活率至71.11%（32/45只），且明顯較未免疫血清干預組存活率52.27%（23/44只）為高（P＜0.05，見圖2）。

圖1 小鼠脾臟及血清中HMGB1蛋白檢測（A：Western blot技術分析小鼠脾臟組織HMGB1含量；B：ELISA方法檢測小鼠血清HMGB1水平）

圖2 抗HMGB1中和抗體干預對嚴重燒傷小鼠生存率的影響

2.2 HMGB1誘導燒傷小鼠脾臟DC的過度ERS反應 小鼠給予抗HMGB1中和抗體或未免疫血清干預，48 h后處死，檢測脾臟DC中ERS相關分子蛋白的表達，結果顯示，拮抗HMGB1可顯著抑制燒傷應激引起的小鼠脾臟DC中的ERS反應，與未免疫血清干預組相比，DC中的ERS標志分子GRP78表達水平以及XBP-1的表達和活化水平（sXBP-1）均明顯降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 HMGB1中和抗體減輕燒傷小鼠脾臟DC中ERS反應

應用重組HMGB1攻擊正常小鼠，可誘導脾臟DC發(fā)生明顯的ERS。不同劑量HMGB1體內注射均可誘導GRP78表達升高及XBP-1表達/活化水平的上調，且呈一定的劑量依賴性。見圖4。

2.3 HMGB1對DC凋亡的直接誘導效應及其與ERS的相關性 HMGB1體外刺激可誘導小鼠脾臟DC發(fā)生凋亡，與正常對照組相比，DC經(jīng)HMGB1刺激24 h，凋亡率明顯增加(P＜0.05)，以10 ng/ml組升高最為顯著(P＜0.01)，見圖5。同時檢測DC中ERS相關分子蛋白水平， 結果顯示，HMGB1刺激可直接誘導DC中ERS相關蛋白表達增加(P＜0.05)，其中GRP78表達隨HMGB1刺激濃度的增加而增加，ERS相關性細胞凋亡途徑中的關鍵分子CHOP在10 ng/ml劑量組表達最強(P＜0.01)，與HMGB1誘導DC凋亡效果一致，見圖6。

圖4 HMGB1攻擊誘導正常小鼠脾臟DC中ERS反應的發(fā)生

圖5 不同濃度HMGB1刺激對DC凋亡的影響(n=3)

為探討ERS在HMGB1誘導DC凋亡中的作用，我們進一步應用Salubrinal (可緩解ERS反應，減輕ERS所致細胞凋亡)進行干預。DC給予Sal預處理(20 μmol/L，1 h)可明顯減輕不同劑量HMGB1刺激誘導的DC凋亡(P＜0.01)，見圖7。與單獨應用HMGB1刺激DC相比，給予Sal預處理的DC 其ERS相關細胞凋亡的關鍵分子CHOP蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)，見圖8。

3 討 論

嚴重創(chuàng)（燒）傷后機體很早期即出現(xiàn)細胞免疫功能障礙的現(xiàn)象，機體免疫功能紊亂是創(chuàng)傷并發(fā)膿毒癥的重要病生理基礎[3]。目前已知DC是體內功能最強的專職抗原呈遞細胞，被認為是免疫系統(tǒng)的啟動者，處于免疫調控中心位置[7-8]。研究表明，燒（創(chuàng)）傷感染并發(fā)膿毒癥過程中，DC的凋亡以及免疫功能異常是導致機體免疫功能障礙的關鍵環(huán)節(jié)。但是，對于膿毒癥狀態(tài)下DC凋亡的具體分子機制及可能的調控環(huán)節(jié)目前尚未闡明。進一步明確燒（創(chuàng)）傷后影響DC功能狀態(tài)的主要因素及探索可能的調控靶點具有重要病理生理意義及臨床實用價值。

圖6 不同濃度HMGB1刺激對DC ERS相關蛋白表達的影響(n=3)

圖7 Sal干預對HMGB1誘導DC凋亡率的影響(n=3)

圖8 Sal干預對HMGB1誘導DC中ERS相關蛋白表達的影響(n=3)

HMGB1是一種非組蛋白染色體結合蛋白，進化上高度保守，能夠參與基因轉錄、DNA重組、修復等多種生物學過程。存在于真核細胞的細胞核中的HMGB1可分泌至細胞外，參與機體免疫反應的調控，在膿毒癥發(fā)病及進展中起著重要作用。近年來研究證實，嚴重燒（創(chuàng)）傷時血清及組織中HMGB1水平升高與嚴重感染和休克患者的不良預后及膿毒癥模型動物的高死亡率密切相關[9-10]。多項研究證實，拮抗HMGB1的生物學作用可有效保護損傷的組織細胞[11-12]。本研究中，嚴重燒傷小鼠血清及脾臟組織內HMGB1蛋白水平明顯升高，抗HMGB1中和抗體干預可提高燒傷小鼠生存率，具有明確保護作用，與前期報道結果一致。HMGB1除作為晚期促炎因子在炎癥反應過程中發(fā)揮潛在的中心作用外，還作為免疫刺激因子調控免疫細胞的功能狀態(tài)及凋亡，介導機體免疫功能紊亂，對感染、休克、燒（創(chuàng)）傷、膿毒癥等急危重癥的病程進展發(fā)揮重要作用[13]。本室前期研究表明，HMGB1作為一種潛在免疫調節(jié)因子，對DC以及T淋巴細胞的功能狀態(tài)具有重要調節(jié)作用，特別是對DC的成熟分化可發(fā)揮雙向調控作用[14]。本研究中細胞實驗結果證實，HMGB1對體外培養(yǎng)的正常小鼠脾臟DC的凋亡具有直接誘導效應，提示嚴重燒（創(chuàng)）傷后體內高水平HMGB1誘導DC大量凋亡可能是導致機體免疫功能發(fā)生紊亂的重要機制所在。

ERS是近年來廣受關注的一種真核細胞內重要的內源性保護機制，對提高應激狀態(tài)下細胞適應力和耐受力至關重要。但ERS持續(xù)存在或者反應過強時則激活ERS相關性細胞凋亡通路(ERassociated death，ERAD)[15]，引發(fā)細胞大量死亡。本室前期研究結果顯示，ERS在介導HMGB1對DC免疫功能調節(jié)中具有重要意義[5]；而且，過度ERS誘導細胞凋亡通路活化是嚴重燒傷小鼠脾臟DC大量凋亡以及機體免疫功能障礙發(fā)生的重要機制[6,16]。本研究在前期工作成果的基礎上，進一步探討在燒（創(chuàng)）傷后體內高水平HMGB1刺激誘導DC凋亡的信號機制中ERS的地位及意義，以深入探索DC凋亡機制中的可干預環(huán)節(jié)。研究結果顯示，正常小鼠進行重組HMGB1體內注射可誘導脾臟DC中ERS反應的重要生物學標志分子GRP78及ERS介導細胞凋亡的關鍵分子CHOP的表達水平明顯上調。而且，本實驗中還發(fā)現(xiàn)，嚴重燒傷小鼠給予抗HMGB1中和抗體干預可緩解脾臟DC中的ERS反應水平。上述實驗結果提示，嚴重燒傷后體內高水平HMGB1是誘導DC內發(fā)生明顯ERS反應以及ERS相關性細胞凋亡的重要因素，緩解過激的ERS反應水平可能是抗HMGB1中和抗體保護效應的重要機制所在。

進一步的體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，HMGB1誘導DC凋亡過程中伴有明顯的ERS反應，HMGB1刺激誘導DC中GRP78蛋白表達上調，并隨刺激濃度增加而增加；CHOP蛋白表達水平明顯上調，與DC凋亡趨勢一致。而且，我們應用一種明確可減輕ERS相關性細胞凋亡的選擇性eIF2α脫磷酸作用抑制劑Sal[17]對DC進行預處理，可明顯減輕HMGB1誘導的DC凋亡的發(fā)生。這些數(shù)據(jù)提示ERS相關性細胞凋亡通路的活化在HMGB1誘導DC凋亡機制中發(fā)揮重要作用。

本研究中初步探討了HMGB1刺激誘導DC發(fā)生ERS相關性細胞凋亡及其與嚴重燒傷小鼠脾臟DC功能障礙間的內在聯(lián)系。拮抗嚴重燒傷小鼠體內高水平HMGB1作用可有效緩解脾臟DC中過激ERS反應；而且，緩解ERS反應水平的干預措施可降低HGMB1誘導的ERS相關性細胞凋亡。明確調控ERS的確切分子信號機制及可能的干預靶點，尋找控制ERS反應“適度” 的有效調控措施，將為改善膿毒癥患者免疫細胞功能狀態(tài)、尋找膿毒癥治療靶標、尋求膿毒癥新的干預方法提供新思路。