ε-聚賴氨酸對柑橘酸腐菌的抑菌活性及作用機(jī)制

肖 媛，潘兆平，尹春曉，蘇 瑾，胡 筱，朱向榮,，單 楊，付復(fù)華,

（1.湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙 410125；3.果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410125）

柑橘是世界第一大水果，我國是柑橘的主要生產(chǎn)和消費(fèi)大國[1]。柑橘果實(shí)富含多種營養(yǎng)物質(zhì)及生物活性成分，深受消費(fèi)者喜愛[2]。但由于柑橘類水果成熟期集中，含水量較高且營養(yǎng)成分豐富，采后極易感染病原菌而發(fā)生霉變、腐爛，降低品質(zhì)，造成了較大資源浪費(fèi)和環(huán)境污染問題[3]。由柑橘酸腐菌（Geotrichum citri-aurantii）引起的酸腐病是柑橘類果實(shí)在采后貯運(yùn)中最重要的病害之一，其發(fā)病率僅次于綠霉病和青霉病[4]，幾乎影響到世界各產(chǎn)地所有柑橘類作物與栽培品種[5]。柑橘酸腐菌有較強(qiáng)的侵染力，且具有生長周期短、繁殖快、對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、不易被殺菌劑殺死、難以控制等特點(diǎn)[6]。酸腐病在柑橘采后貯藏后期易爆發(fā)，染病后果實(shí)腐爛液化易相互影響造成交叉感染，引起大面積的腐爛，危害巨大[7]。目前，化學(xué)殺菌劑是生產(chǎn)上防治柑橘采后病害的主要技術(shù)，大部分殺菌劑如咪鮮胺、抑霉唑、噻菌靈、嘧霉胺等可有效控制柑橘青綠霉病，但對柑橘酸腐病的防治有限[8]。聯(lián)苯酚鈉在一定濃度下能夠有效防治酸腐病，但因其對果實(shí)有損傷作用，使用量逐漸減少[9]。雙胍鹽類對酸腐病的控制有特定效果，因不明確其代謝途徑，無法有效檢測其殘留量，使其使用范圍受限[5,7]。化學(xué)殺菌劑防治技術(shù)具有高效、廣譜和使用方便等特點(diǎn)，其廣泛使用的同時(shí)，安全性等問題也引起了人們的高度關(guān)注。許多化學(xué)殺菌劑有致癌性、毒性大、易殘留等問題，處理不當(dāng)會(huì)對人的身心健康和生態(tài)環(huán)境安全有害[10]。另外，若長時(shí)間用一種或幾種藥劑，極易增強(qiáng)病原菌對藥劑的耐藥性，最終導(dǎo)致病害更難防治[11]。因此，亟需尋找安全、有效的防治措施來控制柑橘采后酸腐病的發(fā)生。

ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）來源于白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[12]，是一種高安全性的天然食品保鮮防腐劑。ε-PL是一種均聚氨基酸，是由單個(gè)賴氨酸分子α-位羰基和ε-位氨基通過酰胺鍵結(jié)合的聚合物，其有25～30 個(gè)賴氨酸殘基[13]。與化學(xué)防腐劑相比，ε-PL是生物發(fā)酵產(chǎn)物，更安全，其在體內(nèi)能分解為人體需要的賴氨酸[14]。而且，ε-PL還具有抑菌譜廣、耐高溫、水溶性好、pH值使用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[15]。ε-PL已被中國與美國等國家批準(zhǔn)為安全食品保鮮劑[14,16]，廣泛用于熟肉制品、蛋制品以及果蔬汁等多種食品的保鮮防腐。近年來，關(guān)于ε-PL的抑菌特性與抑菌機(jī)理的研究得到了廣泛的關(guān)注。Lin Lin等[17]研究了ε-PL對李斯特菌的抗菌機(jī)制，結(jié)果表明經(jīng)質(zhì)量濃度為200 mg/L的ε-PL處理能抑制99.99%李斯特菌的生長繁殖，帶正電荷的ε-PL與李斯特菌細(xì)胞膜表面的脂磷壁酸等帶負(fù)電荷的基團(tuán)結(jié)合使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起胞內(nèi)酶與可溶性蛋白的外流，菌體正常呼吸代謝功能紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bo Tao等[18]研究報(bào)道質(zhì)量濃度為50～200 mg/L的ε-PL處理導(dǎo)致釀酒酵母細(xì)胞膜的一系列變化，包括增加麥角甾醇含量，改變脂肪酸組成，對膜蛋白的構(gòu)象與功能造成影響，引起菌體滲透脅迫作用和質(zhì)壁分離的發(fā)生。Li Hua等[19]發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度150～450 mg/L的ε-PL處理對灰霉菌的細(xì)胞膜具有損傷作用，膜完整性的破壞能夠引起胞內(nèi)可溶性碳水化合物及核酸的滲漏，促進(jìn)其體內(nèi)活性氧的積累，并導(dǎo)致菌體內(nèi)BcXyn11A與BcRAS1等致病基因的表達(dá)下調(diào)，最終抑制灰霉菌的生長繁殖，有效降低紅棗灰霉病的發(fā)病率。

ε-PL是一種安全、健康、綠色的防腐保鮮劑，對多種細(xì)菌和真菌有直接抑制作用，具有廣闊的商業(yè)應(yīng)用前景[20]。ε-PL對大腸桿菌O157:H7[21]、金黃色葡萄球菌等[22]食源性病原菌及灰霉菌[19]、粉紅單端胞霉[23]、指狀青霉[24]等常見的果蔬采后致病真菌均有較好的抑菌活性，但目前鮮有關(guān)于ε-PL抑制柑橘酸腐菌的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以柑橘酸腐菌為材料，分析了ε-PL對柑橘酸腐菌的抑制效果及抑菌特性，并進(jìn)一步探討了ε-PL對柑橘酸腐菌的抗菌機(jī)制，旨在為柑橘采后酸腐病的控制研究提供新思路，為研發(fā)適合柑橘貯藏的新型防腐保鮮劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

柑橘酸腐菌（Geotrichum citri-aurantii） 中國科學(xué)院華南植物園微生物實(shí)驗(yàn)室；沙糖橘為市場采購，產(chǎn)自廣西桂林。

ε-聚賴氨酸 上海富源生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose broth，PDB）液體培養(yǎng)基鄭州亞世生物科技有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司；SW-CJ-1C型凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 上海求精生化試劑儀器有限公司；DDS-307A電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)有限公司；TS-100B臺(tái)式空氣浴搖床 金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；XSP-36X型顯微鏡 鳳凰光學(xué)儀股份有限公司；UV-180型紫外-可見分光光度計(jì) 島津儀器（蘇州）有限公司；JSM-6360LV型高低真空掃描電子顯微鏡、JFD-320冷凍干燥儀 日本電子株式會(huì)社；SP8 STED 3X型激光共聚焦顯微鏡 徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ε-PL對柑橘酸腐菌的最小抑菌濃度的測定

將柑橘酸腐菌接種至PDA培養(yǎng)基上，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，用無菌水將柑橘酸腐菌洗入三角瓶中，用普通玻璃珠將孢子打散、過濾，將濾液充分搖勻制成孢子懸浮液。采用微量肉湯稀釋法研究ε-PL對柑橘酸腐菌最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）[8,25-26]。用無菌的96 孔微量板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別加入100 μL PDB培養(yǎng)基。吸取100 μL質(zhì)量濃度為51 200 mg/L的ε-PL溶液加入A1號(hào)孔板，采用倍半濃度稀釋法依次從A2號(hào)孔板稀釋至A11號(hào)孔板。在A1～A10號(hào)孔板和A12號(hào)孔板中加入100 μL含柑橘酸腐菌孢子濃度為107CFU/mL的PDB培養(yǎng)基，使A1～A10號(hào)孔板中ε-PL質(zhì)量濃度為12 800～25 mg/L。A11號(hào)孔板為空白對照，只加入培養(yǎng)基和ε-PL溶液，不接種菌液。A12號(hào)孔板為菌液對照組，不含ε-PL溶液28 ℃培養(yǎng)48 h后，用顯微鏡觀察其菌絲生長，以A1～A10號(hào)孔板中仍保持澄清的最低ε-PL質(zhì)量濃度為ε-PL對柑橘酸腐菌的MIC，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置8 個(gè)平行。

1.3.2 ε-PL處理對柑橘酸腐菌菌絲體生長的抑制效果

將PDA培養(yǎng)基于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min后取出，在培養(yǎng)皿中分別加入不同質(zhì)量濃度的ε-PL和PDA培養(yǎng)基，充分混勻，使每個(gè)平板培養(yǎng)基中ε-PL溶液的質(zhì)量濃度分別為0（對照組）、50、100、200、400、600、800 mg/L（均為處理組），備用。從用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的柑橘酸腐菌菌落邊緣取直徑為6 mm的菌餅，將菌餅分別接種于平板培養(yǎng)基正中央，每個(gè)平板接種一個(gè)菌餅，菌絲面朝下，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d[27]。每組重復(fù)3 次。菌落增長直徑與菌絲體生長抑制率分別按公式（1）、（2）計(jì)算。以ε-PL質(zhì)量濃度的對數(shù)值作為橫坐標(biāo)，菌絲體生長抑制率為縱坐標(biāo)，計(jì)算ε-PL對柑橘酸腐菌菌絲體生長的毒力方程和半最大效應(yīng)濃度（half maximal effective concentration，EC50）[28]。

1.3.3 ε-PL處理對柑橘酸腐菌孢子萌發(fā)抑制率的測定

采用涂布平板法測定ε-PL處理對柑橘酸腐菌孢子萌發(fā)的影響。柑橘酸腐菌在PDA平板上28 ℃培養(yǎng)7 d后，用無菌水洗下孢子，用無菌紗布過濾除去菌絲，將濾液在5 000 r/min下離心10 min，去除上清液，將柑橘酸腐菌孢子重懸于PBS溶液中，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)孢子濃度至106CFU/mL，制成孢子懸浮液備用。吸取50 μL孢子懸液涂布在含質(zhì)量濃度0（對照組）、50、100、200、400、600、800 mg/L（均為處理組）的ε-PL平板上[29]，每個(gè)處理3 次重復(fù)，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，直到對照組的萌發(fā)率達(dá)到95%以上，每皿隨機(jī)觀察100 個(gè)孢子，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)數(shù)/個(gè)，以芽管長度超過孢子最大直徑的一半作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)[30]。孢子萌發(fā)率和孢子萌發(fā)抑制率分別按公式（3）、（4）計(jì)算。以ε-PL質(zhì)量濃度的對數(shù)值作為橫坐標(biāo)，柑橘酸腐菌孢子萌發(fā)抑制率為縱坐標(biāo)，計(jì)算ε-PL對酸腐菌孢子萌發(fā)的毒力方程和EC50[31]。

1.3.4 柑橘酸腐菌細(xì)胞膜通透性的測定

將1×106CFU/mL的柑橘酸腐菌孢子懸浮液接種于PDB培養(yǎng)基中，于28 ℃且轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)3 d。4 000 r/min離心20 min后用無菌水離心沖洗3 次。將離心后的菌絲體置于25 mL的無菌水中，加入ε-PL使其質(zhì)量濃度分別為1×MIC、2×MIC，于28 ℃且轉(zhuǎn)速為200 r/min搖床培養(yǎng)并測定處理0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)的胞外電導(dǎo)率L/（μS/cm）。最后用沸水煮沸處理10 min，冷卻至室溫，再次測定的電導(dǎo)率為L’，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。用相對電導(dǎo)率表示細(xì)胞膜通透性，相對電導(dǎo)率按公式（5）計(jì)算[32-33]。

式中：L為各時(shí)間點(diǎn)的電導(dǎo)率/（μS/cm）；L0為0 h的電導(dǎo)率/（μS/cm）；L’為沸水處理后的電導(dǎo)率/（μS/cm）。

1.3.5 柑橘酸腐菌胞內(nèi)物質(zhì)釋放量的測定

將1×106CFU/mL的柑橘酸腐菌孢子懸浮液接種于25 mL的PDB培養(yǎng)基中，于28 ℃且轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)3 d。4 000 r/min離心20 min后用無菌水離心沖洗3 次。將離心后的菌絲體置于25 mL的無菌水中，加入ε-PL使其質(zhì)量濃度分別為1×MIC、2×MIC，加入等量無菌水為對照組[8,34]。于28 ℃且轉(zhuǎn)速為200 r/min搖床培養(yǎng)，于0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)取樣，將樣品置于12 000 r/min離心3 min收集上清液2 mL，在260 nm波長處測定吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 柑橘酸腐菌細(xì)胞膜完整性的測定

將柑橘酸腐菌孢子添加到ε-PL質(zhì)量濃度分別為1×MIC、2×MIC的PDB培養(yǎng)基中，調(diào)整孢子濃度為1×107CFU/mL，以無菌水作對照。置于28 ℃且轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床中孵育6 h后，4 000 r/min離心3 min去上清液，加入500 μL的PI染色液，37 ℃水浴避光染色10 min。用PBS清洗3 次，去除多余染色液，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察[35-36]。

1.3.7 掃描電子顯微鏡觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察ε-PL處理后真菌菌絲的形態(tài)學(xué)變化。將6 mm的菌餅接種到質(zhì)量濃度為0、1×MIC、2×MIC的ε-PL的PDA培養(yǎng)基中28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，取平板中的菌絲（6～8 mm3）[27]，用體積分?jǐn)?shù)2.5%磷酸戊二醛與2%多聚甲醛固定2 h以上，放置于4 ℃冰箱。用體積分?jǐn)?shù)0.1% PBS清洗戊二醛3 次，每次40 min。將樣品放置于體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸固定2 h后，用體積分?jǐn)?shù)1% PBS清洗3 次，每次5 min。樣品于體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、90%乙醇和無水乙醇梯度脫水，每隔10 min一次。最后將樣品放置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，取出貼臺(tái)后噴金鏡檢。

1.3.8 柑橘果實(shí)酸腐病發(fā)病率和病斑直徑的測定

挑選無損傷、大小著色一致的柑橘果實(shí)，隨機(jī)分為4 組，每組10 個(gè)果實(shí)。在其表面噴灑體積分?jǐn)?shù)75%乙醇進(jìn)行消毒，用無菌水沖洗后，晾干。用滅過菌的打孔器在果實(shí)腰部等距離刺兩個(gè)直徑為3 mm、深3 mm的傷口，接種濃度為2×104CFU/mL孢子懸浮液20 μL，晾干后，處理組分別加入20 μL質(zhì)量濃度為1 600、3 200 mg/L和6 400 mg/L的ε-PL溶液至傷口，對照組加入20 μL無菌水。接種后置于塑料盒，用自封袋密封置于25 ℃、相對濕度為90%～95%的條件下培養(yǎng)8 d后，測定柑橘果實(shí)的發(fā)病率，用十字交叉法測量柑橘果實(shí)的病斑直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次[4,9]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)平行測定3 次，采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用DPS 7.05軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用Origin 2018軟件進(jìn)行制圖，應(yīng)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用鄧肯氏多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ε-PL對柑橘酸腐菌的MIC

表1 列出了ε-P L 對柑橘酸腐菌的M I C 值，質(zhì)量濃度≥400 mg/L的ε-PL對柑橘酸腐菌有較好的抑菌效果。經(jīng)微量肉湯稀釋法測定可知，ε-PL對柑橘酸腐菌的MIC為400 mg/L。

表1 ε-PL對柑橘酸腐菌的MICTable 1 MIC of ε-PL against Geotrichum citri -aurantii

2.2 ε-PL處理對柑橘酸腐菌菌落形態(tài)、菌落直徑的影響

由圖1A、B可知，隨著ε-PL質(zhì)量濃度的升高，對柑橘酸腐菌菌絲體生長的抑制作用逐漸增強(qiáng)。培養(yǎng)7 d后，當(dāng)ε-PL的質(zhì)量濃度≥400 mg/L時(shí)，可明顯抑制菌絲體的生長（圖1A1～A7）。培養(yǎng)2 d后，與對照組相比ε-PL處理組可以顯著抑制酸腐菌菌絲體的生長（P＜0.05），當(dāng)ε-PL的質(zhì)量濃度≥400 mg/L時(shí)，柑橘酸腐菌基本無生長。培養(yǎng)7 d后，對照組菌絲體生長迅速，菌落直徑達(dá)到了（76.83±0.14）mm（圖1B）。

圖1 ε-PL對柑橘酸腐菌菌落形態(tài)、菌落直徑的影響Fig. 1 Effect of ε-PL treatment on colony morphology and diameter of Geotrichum citri-aurantii

2.3 ε-PL處理對柑橘酸腐菌孢子萌發(fā)、菌絲體生長的影響

圖2 ε-PL處理對柑橘酸腐菌孢子萌發(fā)的影響Fig. 2 Effect of ε-PL treatment on spore germination rate of Geotrichum citri-aurantii

由圖2和圖3可知，ε-PL處理可顯著降低柑橘酸腐菌的孢子萌發(fā)率。圖2A1～A7為6 h時(shí)，200 倍的光學(xué)顯微鏡下，各組柑橘酸腐菌的孢子萌發(fā)情況，對照組的柑橘酸腐菌孢子萌發(fā)率較高，芽管伸長明顯，ε-PL處理組孢子萌發(fā)、芽管伸長受到明顯抑制。隨著ε-PL質(zhì)量濃度的增加，對柑橘酸腐菌孢子萌發(fā)率顯著下降（P＜0.05），呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系（圖2B）。由圖3可知，當(dāng)ε-PL的質(zhì)量濃度為200、400 mg/L和600 mg/L時(shí)，對柑橘酸腐菌菌絲體生長的抑制率分別為（52.42±1.40）%、（85.83±0.66）%與（92.63±0.38）%。經(jīng)質(zhì)量濃度800 mg/L的ε-PL處理后，能抑制99.50%以上的菌絲體生長，抑制率達(dá)（99.32±0.59）%，經(jīng)質(zhì)量濃度為400 mg/L與600 mg/L的ε-PL處理，對柑橘酸腐菌孢子萌發(fā)抑制率分別達(dá)到了（57.42±1.01）%和（84.80±1.01）%，與對照組差異顯著（P＜0.05），用質(zhì)量濃度800 mg/L的ε-PL處理后，基本無孢子萌發(fā)。

圖3 ε-PL處理對柑橘酸腐菌的菌絲體生長和孢子萌發(fā)的抑制率Fig. 3 Mycelium growth and spore germination inhibitory rates of Geotrichum citri-aurantii by ε-PL treatment

表2 ε-PL對柑橘酸腐菌的毒力回歸方程和C50Table 2 Virulence regression equation and EC50 ofε-PL against Geotrichum citri-aurantii

表2 ε-PL對柑橘酸腐菌的毒力回歸方程和C50Table 2 Virulence regression equation and EC50 ofε-PL against Geotrichum citri-aurantii

95%置信區(qū)間/（mg/L）菌絲 Y＝2.785 8X-0.877 8 0.932 2 128.79 82.694 3～200.586 1孢子 Y＝2.839 8X-1.622 4 0.930 1 214.77 146.409 5～315.042 5指標(biāo) 毒力回歸方程 決定系數(shù)R2 EC50/（mg/L）

由表2可知，ε-PL處理對柑橘酸腐菌菌絲體生長有抑制作用，其毒力回歸方程為Y＝2.785 8X-0.877 8，EC50為128.79 mg/L。ε-PL處理對柑橘酸腐菌對孢子萌發(fā)的毒力回歸方程為，Y＝2.839 8X-1.622 4，EC50為214.77 mg/L。

2.4 ε-PL處理對柑橘酸腐菌細(xì)胞膜通透性的影響

細(xì)胞膜為菌體的保護(hù)屏障，具有保護(hù)、識(shí)別、物質(zhì)交換等功能，能使菌體細(xì)胞維持相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境[37-38]。當(dāng)細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)滲漏到培養(yǎng)液中，致使培養(yǎng)液的電導(dǎo)率升高，相對電導(dǎo)率值的變化可以反映菌體細(xì)胞膜通透性的變化[39]。由圖4可知，對照組菌絲體的胞外相對電導(dǎo)率緩慢上升，至12 h時(shí)，相對電導(dǎo)率達(dá)（4.64±0.13）%。經(jīng)過ε-PL處理的菌絲體的胞外相對電導(dǎo)率在培養(yǎng)過程中上升較快，且隨著ε-PL處理時(shí)間的延長與ε-PL質(zhì)量濃度的增大，相對電導(dǎo)率增幅呈上升趨勢。至12 h時(shí)，經(jīng)質(zhì)量濃度為1×MIC和2×MIC的ε-PL處理，菌絲體的胞外相對電導(dǎo)率分別達(dá)（13.99±1.15）%、（35.82±0.64）%，與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)表明ε-PL處理可引起柑橘酸腐菌細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，使細(xì)胞膜喪失其正常的功能。

圖4 ε-PL處理對柑橘酸腐菌細(xì)胞膜通透性的影響Fig. 4 Effect of ε-PL treatment on cell membrane permeability of Geotrichum citri-aurantii

2.5 ε-PL處理對柑橘酸腐菌細(xì)胞成分釋放的影響

圖5 ε-PL處理對柑橘酸腐菌A260 nm細(xì)胞成分釋放的影響Fig. 5 Effect of ε-PL treatment on A260 nm of Geotrichum citri-aurantii

當(dāng)菌體處于不利環(huán)境中時(shí)，其生長受到抑制，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，膜內(nèi)的K+、PO43-等小離子物質(zhì)會(huì)連同DNA、RNA等大分子物質(zhì)泄漏[40]。因此，可通過測定260 nm波長處的吸光度來表征菌體經(jīng)ε-PL處理后酸腐菌核酸等胞內(nèi)物質(zhì)的釋放情況。由圖5可知，在0～12 h內(nèi)，經(jīng)ε-PL處理后的酸腐菌菌絲體的胞外A260nm明顯增加，且始終高于對照組。處理12 h后，對照組的A260nm（0.215±0.001）顯著低于1×MIC處理組（0.445±0.002）以及2×MIC處理組（0.628±0.006）（P＜0.05）。1×MIC、2×MIC處理組260 nm波長處的吸光度隨著作用時(shí)間的延長呈現(xiàn)上升趨勢，1×MIC、2×MIC處理組的作用效果與ε-PL質(zhì)量濃度正相關(guān)。說明ε-PL處理顯著增加了酸腐菌細(xì)胞成分的釋放，造成柑橘酸腐菌菌體內(nèi)部的核酸等物質(zhì)外泄，細(xì)胞內(nèi)含物泄漏速率與ε-PL質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

2.6 ε-PL處理對柑橘酸腐菌細(xì)胞膜完整性的影響

圖6 ε-PL處理對柑橘酸腐菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig. 6 Effect of ε-PL treatment on membrane integrity of spores of Geotrichum citri-aurantii

熒光染料PI可用于檢測ε-PL是否引起細(xì)胞膜完整性喪失[41]。PI是一種可對DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，PI不能通過健康的活細(xì)胞膜，但能穿過破損的細(xì)胞膜與細(xì)胞中的DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光，在顯微鏡下觀察到發(fā)出紅色熒光的細(xì)胞已經(jīng)死亡[42]。從圖6A可以看出，明場下觀察，對照組孢子長勢良好、結(jié)構(gòu)完整，而ε-PL處理組的孢子細(xì)胞部分出現(xiàn)破裂，產(chǎn)生細(xì)胞碎片等溶出物；暗場（PI染色）下觀察，對照組孢子基本無紅色熒光，ε-PL處理組則顯現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光，且熒光強(qiáng)度隨ε-PL質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，ε-PL處理能夠破壞酸腐菌孢子細(xì)胞膜的完整性。酸腐菌孢子失去細(xì)胞膜完整性的比例與ε-PL質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，當(dāng)用質(zhì)量濃度為1×MIC（400 mg/L）、2×MIC（800 mg/L）的ε-PL處理6 h后，分別有約（13.46±0.47）%、（31.29±0.78）%的酸腐菌孢子細(xì)胞膜完整性喪失（圖6B）。

2.7 掃描電子顯微鏡觀察ε-PL處理對柑橘酸腐菌菌絲體形態(tài)的影響

改變病原菌菌絲體形態(tài)是殺菌劑及抑菌活性物質(zhì)重要的作用途徑之一，抑菌劑可使菌絲呈多種畸形變化甚至斷裂，從而阻礙其正常的生長發(fā)育。由圖7可知，ε-PL處理對柑橘酸腐菌絲體形態(tài)存在明顯影響。對照組菌絲飽滿表面光滑、結(jié)構(gòu)完整、形狀規(guī)則、隔膜明顯，處于正常生長狀態(tài)。而經(jīng)1×MIC和2×MIC處理的柑橘酸腐菌菌絲體發(fā)生多種形態(tài)變化。1×MIC處理組的菌絲體表面粗糙、出現(xiàn)皺縮變形。相比之下，2×MIC處理組的菌絲體形態(tài)變化更為劇烈，菌絲體表面嚴(yán)重褶皺、膨大凸起、整體扭曲變形、菌絲斷裂，從而使細(xì)胞內(nèi)容物質(zhì)泄漏，這與ε-PL處理對柑橘酸腐菌細(xì)胞膜的影響部分結(jié)果一致。ε-PL處理對柑橘酸腐菌菌絲體具有損傷作用。

圖7 柑橘酸腐菌掃描電子顯微鏡圖Fig. 7 SEM images of Geotrichum citri-aurantii

2.8 ε-PL處理對柑橘果實(shí)酸腐病的防治效果

從圖8 A、B 可知，貯藏8 d 后，對照組發(fā)病率達(dá)（9 8.3 3±2.8 9）%，柑橘果實(shí)病斑直徑達(dá)（39.33±1.53）mm。與對照組相比，ε-PL處理能有效控制柑橘果實(shí)酸腐病的發(fā)生，達(dá)到了一定的防治效果。增加ε-PL的質(zhì)量濃度可以有效地減小柑橘果實(shí)的病斑直徑（P＜0.05），控制效果隨ε-PL質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。用1 600 mg/L的ε-PL處理柑橘果實(shí)后，病斑的生長直徑明顯減小，當(dāng)ε-PL的質(zhì)量濃度達(dá)到6 400 mg/L時(shí)，病斑直徑減小到（5.24±0.29）mm，發(fā)病程度明顯減輕。采用1 600、3 200 mg/L和6 400 mg/L ε-PL處理柑橘果實(shí)，發(fā)病率分別顯著降低到（83.33±2.89）%、（55.00±5.00）%和（21.67±2.89）%（P＜0.05）。因此，ε-PL處理對柑橘采后酸腐病的發(fā)生有一定的防治效果。圖8C表明貯藏8 d同孔接種不同質(zhì)量濃度ε-PL的柑橘果實(shí)病斑直徑的擴(kuò)展情況。可以看出，與對照組相比，隨著ε-PL質(zhì)量濃度的增加柑橘果實(shí)酸腐病的病斑直徑擴(kuò)展被抑制，質(zhì)量濃度為6 400 mg/L時(shí)處理效果最好。

圖8 ε-PL處理對柑橘果實(shí)酸腐病發(fā)病率和病斑直徑的影響Fig. 8 Effect of ε-PL treatment on sour rot incidence and lesion diameter of citrus fruit

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)探討了不同質(zhì)量濃度的ε-PL對柑橘酸腐菌的抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)表明ε-PL對柑橘酸腐菌具有良好的抑制作用，ε-PL對柑橘酸腐菌的MIC為400 mg/L，對菌絲體生長和孢子萌發(fā)抑制的EC50分別為128.79 mg/L和2 1 4.7 7 m g/L，當(dāng)ε-P L 的質(zhì)量濃度為2×M I C（800 mg/L）時(shí)，對菌絲生長和孢子萌發(fā)抑制率分別為（99.88±0.20）%和（99.32±0.59）%，基本抑制了孢子的萌發(fā)，菌絲體發(fā)生扭曲、斷裂現(xiàn)象，生長繁殖受阻。這與Liu Kewei等[24]研究發(fā)現(xiàn)ε-PL處理對粉紅單端胞霉菌的孢子萌發(fā)以及菌絲體生長具有抑制作用的研究結(jié)果一致。在活體實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)ε-PL質(zhì)量濃度達(dá)到1 600、3 200、6 400 mg/L時(shí)能顯著降低酸腐病的發(fā)病率與果實(shí)病斑的生長直徑，減輕酸腐病的發(fā)病程度，各處理組與對照組差異顯著（P＜0.05），可有效控制柑橘酸腐病的發(fā)生。Li Hua等[19]的研究結(jié)果表明，ε-PL處理可以有效防治紅棗采后灰霉病的發(fā)生，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果具有一致性。離體和活體實(shí)驗(yàn)均能說明ε-PL對柑橘酸腐菌有著較好的抑制作用。

細(xì)胞膜是細(xì)胞與周圍環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的通道和屏障，它的通透性和完整性在細(xì)胞進(jìn)行正常生理活動(dòng)中具有重要的作用，細(xì)胞膜是常見的抗真菌劑的重要作用靶標(biāo)[31,43]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道ε-PL具有多價(jià)陽離子特性，可對微生物細(xì)胞表面產(chǎn)生靜電吸附作用，破壞微生物的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞物質(zhì)、能量與信息傳遞中斷，抑制微生物的生長繁殖[19,44]。本實(shí)驗(yàn)也存在類似的研究結(jié)果，當(dāng)添加1×MIC和2×MIC的ε-PL后，酸腐菌菌絲體胞外相對電導(dǎo)率與260 nm波長處的吸光度都有顯著上升（P＜0.05）。相對電導(dǎo)率增加與細(xì)胞膜通透性異常變化有關(guān)。抑菌劑作用于細(xì)胞膜后，使細(xì)胞質(zhì)離子穩(wěn)態(tài)遭到破壞，電解質(zhì)泄漏、電導(dǎo)率上升，損壞了細(xì)胞質(zhì)膜的屏障，影響菌體的代謝繁殖。Su Ruihua等[45]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)ε-PL處理后的蠟狀芽孢桿菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率會(huì)增大、菌體細(xì)胞裂解率增加，Zhang Xiaowei等[21]用ε-PL處理大腸桿菌O157:H7后，發(fā)現(xiàn)處理組的大腸桿菌O157:H7細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)含物外滲，本實(shí)驗(yàn)也得到相似的結(jié)果。在0～12 h內(nèi)，ε-PL作用于柑橘酸腐菌細(xì)胞，引起細(xì)胞膜通透性異常變化，造成細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失衡，K+、Mg2+、Ca2+等小分子物質(zhì)滲出、胞外離子含量升高，相對電導(dǎo)率增加，1×MIC、2×MIC的ε-PL處理組顯著高于對照組（P＜0.05），相對電導(dǎo)率增加是ε-PL處理對病原菌產(chǎn)生損傷作用的早期表現(xiàn)。260 nm是核酸的特征波長，在處理12 h后，隨著ε-PL質(zhì)量濃度升高與作用時(shí)間延長，A260nm顯著升高，說明外源性的ε-PL與菌體細(xì)胞膜結(jié)合后，改變了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)流失、引起胞內(nèi)核酸等大分子物質(zhì)泄露。通過激光共聚焦顯微鏡觀察酸腐菌孢子核酸熒光染色，結(jié)果表明1×MIC、2×MICε-PL作用后的柑橘酸腐菌紅色熒光信號(hào)明顯高于對照組（P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)了ε-PL對細(xì)胞膜的損傷作用與抑菌活性。這一結(jié)果與Tan Zhilei等[22]研究報(bào)道的ε-PL處理對金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的損傷作用及Wei Lianhua等[46]關(guān)于ε-PL處理對白色念珠菌細(xì)胞膜完整性的破壞作用的結(jié)論一致。掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果表明，ε-PL處理后酸腐菌菌絲體的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生褶皺、腫大畸形、斷裂、內(nèi)容物外泄等裂解現(xiàn)象，這與Liu Kewei等[24]研究發(fā)現(xiàn)ε-PL處理對指狀青霉菌菌絲體形態(tài)結(jié)構(gòu)具有損傷作用的研究結(jié)果具有一致性。因此，ε-PL具有抑菌作用，其可能是通過破壞菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致內(nèi)容物外泄，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長代謝或造成細(xì)胞死亡，從而抑制其生長。一些抑菌活性成分也有相似的抑菌作用機(jī)制，如α-水芹烯及壬醛對圓孤青霉菌的抑菌機(jī)制[47]與檸檬醛對柑橘酸腐菌的抗真菌機(jī)制可能是破壞細(xì)胞膜的完整性和引發(fā)細(xì)胞成分的泄漏[8]，α-松油醇對意大利青霉的抑制作用也表現(xiàn)出相似的抑菌機(jī)制[48]。

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，質(zhì)量濃度800 mg/L的ε-PL對菌絲生長和孢子萌發(fā)抑制率分別為（99.88±0.20）%和（99.32±0.59）%，可有效抑制柑橘酸腐菌的菌絲體生長，延緩病原菌孢子萌發(fā)。質(zhì)量濃度為1 600、3 200、6 400 mg/L的ε-PL能顯著降低柑橘果實(shí)酸腐病的發(fā)病率與病斑直徑（P＜0.05）。ε-PL通過破壞柑橘酸腐菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使其通透性增加、完整性喪失，對細(xì)胞膜的穩(wěn)定性及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境造成一定的影響，引起細(xì)胞破損胞內(nèi)物質(zhì)外滲溢出，進(jìn)而抑制了菌體細(xì)胞的生長與繁殖。ε-PL能抑制柑橘酸腐菌的生長，可用于柑橘采后酸腐病的防治，有望開發(fā)成環(huán)境友好復(fù)合型的新型保鮮劑，本實(shí)驗(yàn)為柑橘果實(shí)采后酸腐病的控制提供了理論依據(jù)。