10 種植物精油對(duì)腐生葡萄球菌抑制效果比較及肉桂精油抑菌機(jī)制分析

藍(lán)蔚青，劉嘉莉，翁忠銘，陳夢(mèng)玲，謝 晶,

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)），上海 201306）

特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）是海產(chǎn)品中的一類重要微生物，具有調(diào)節(jié)魚體代謝產(chǎn)生一系列化合物與生物活性物質(zhì)的能力[1]。SSO還可能通過(guò)其初級(jí)或次級(jí)代謝，產(chǎn)生具有異味的揮發(fā)性有機(jī)化合物，直接影響魚肉的感官特性、質(zhì)地與新鮮度[2-3]。因此，其作為評(píng)價(jià)化學(xué)腐敗指數(shù)的重要部分，在貨架期預(yù)測(cè)中起到關(guān)鍵作用[4]。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬、希瓦氏菌屬與葡萄球菌屬是魚類冷藏期間的優(yōu)勢(shì)腐敗菌[5]。

近年來(lái)，天然植物及提取物以其優(yōu)良的生物活性、經(jīng)濟(jì)適用性與低毒性等特點(diǎn)逐漸在各類食品的貯藏保鮮上受到關(guān)注[6-8]。植物源提取物包括單一化合物、復(fù)合化合物與植物精油等。其中，植物精油是一種具有特殊芳香氣味的油性液體，具有易揮發(fā)、澄清、易溶于有機(jī)溶劑等特點(diǎn)?？赏ㄟ^(guò)蒸餾法、超臨界CO2法、冷壓法等從植株的多個(gè)部位提取獲得植物精油，其密度通常低于水[9-10]。植物精油作為芳香植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一種性質(zhì)復(fù)雜的天然混合物，一般含有約20～60 種不同濃度的組分。其中酚、醇、酮、醚與烴類常被認(rèn)為是香料植物中的主要抗菌成分[11]。因此，精油可作為降低細(xì)菌耐藥性的潛在替代品，為醫(yī)藥、食品等行業(yè)帶來(lái)便利。目前，部分學(xué)者開(kāi)展植物精油的抑菌機(jī)理研究。如Shan Bin等[12]分析了46 種草本植物提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌與沙門氏菌的抗菌活性，研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性菌比陰性菌敏感；Chan等[13]研究表明，植物精油中的香芹酚、香豆酸、反式肉桂醛、丁香酚、沒(méi)食子酸與迷迭香酸的抗菌性能良好；Dorman等[14]研究發(fā)現(xiàn)從牛至、黑胡椒、丁香與肉豆蔻中提取的植物精油對(duì)嗜水氣單胞菌的抗菌活性相近，而肉豆蔻與丁香精油則具更顯著的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)在對(duì)10 種植物精油對(duì)腐生葡萄球菌作用性能分析的基礎(chǔ)上，篩選出效果最佳的植物精油——肉桂精油；以其為研究對(duì)象，通過(guò)分析其對(duì)腐生葡萄球菌的微生物生長(zhǎng)曲線、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活力、紫外吸收物質(zhì)與掃描電子顯微鏡等綜合評(píng)價(jià)，并結(jié)合其對(duì)菌體生物膜的抑制率分析，研究肉桂精油對(duì)腐生葡萄球菌的作用機(jī)制與生物被膜形成的影響，以期為植物精油等植物源生物保鮮劑在水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）由上海海洋大學(xué)水產(chǎn)品加工與貯藏工程技術(shù)研究中心分離純化，鑒定后于-80 ℃超低溫下甘油管凍存。

羅勒精油、黑胡椒精油、甜茴香精油、芫荽籽精油、肉桂精油、姜精油、玫瑰草精油、茶樹(shù)精油、綠橘精油、白蘭葉精油（均為食品級(jí)） 雅琪實(shí)業(yè)（上海）有限公司；AKP測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所；胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB） 、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA） 青島海博生物技術(shù)有限公司；50%戊二醛溶液、無(wú)水乙醇、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、聚四氟乙烯（poly tetra fluoroethylene，PTFE）膜過(guò)濾器 生工生物工程（上海）股份有限公司；羥乙基哌嗪乙硫磺酸（N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulphonic acid，HEPES）緩沖液、結(jié)晶紫 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Synergy 2多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek儀器有限公司；Q-150T ES plus高真空離子濺射鍍膜儀 英國(guó)QUORUM有限公司；MIRA FE-SEMs分析型高分辨掃描電子顯微鏡 捷克TESCAN公司；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；LDZM-40KCS-Ⅲ型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；QYC-200型全溫培養(yǎng)搖床、DNP-9162BS-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；CP4202C型電子分析天平 奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液與植物精油溶液制備

菌懸液制備：將Staphylococcus saprophyticus菌株從-80 ℃冰箱中取出，在TSA平板上劃線，30 ℃培養(yǎng)24 h。挑單菌落于10 mL TSB中，37 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床活化培養(yǎng)18 h；再以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接入10 mL的TSB中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，5 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集菌體后棄去上清液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水重懸，調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×106CFU/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

植物精油溶液制備：參考Bla?ekovi?等[15]的方法，并略作修改。將精油分別溶于DMSO至不同質(zhì)量濃度，通過(guò)0.22 μm PTFE膜過(guò)濾器過(guò)濾滅菌待用。

1.3.2 10 種植物精油對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌圈直徑測(cè)定

吸取制備好的1×106CFU/mL菌懸液100 μL，將其均勻涂布在TSA培養(yǎng)基表面上。在超凈工作臺(tái)中使用6 mm×10 mm無(wú)菌不銹鋼圓管于瓊脂上打孔，用瓊脂密封孔底。將100 μL不同質(zhì)量濃度精油溶液用移液槍移至每個(gè)孔中。平板置于4 ℃下2 h進(jìn)行預(yù)擴(kuò)散，然后在30 ℃下孵育24 h，以DMSO為陰性對(duì)照。使用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，評(píng)估抑菌活性。其中，抑菌圈直徑小于8.0 mm被認(rèn)為是“無(wú)抑制區(qū)”[16]。

1.3.3 最小抑菌濃度與最小殺菌濃度測(cè)定

采用Amini等[17]的微量肉湯稀釋法測(cè)定肉桂精油對(duì)腐生葡萄球菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）與最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC），略作修改。將不同植物精油分別通過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，隨后在DMSO中稀釋至64 mg/mL并移至96 孔板中，采用二倍稀釋法將植物精油分別稀釋至32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL與0.125 mg/mL。吸取制備好的1×106CFU/mL菌懸液100 μL依次加入到96 孔板中，30 ℃溫育24 h后測(cè)定OD600nm值，以僅添加DMSO的TSB培養(yǎng)基作為對(duì)照。其中，MIC為明顯抑制腐生葡萄球菌生長(zhǎng)的最低質(zhì)量濃度。MBC為細(xì)菌兩次培養(yǎng)中均不能生長(zhǎng)的最低質(zhì)量濃度[14]。所有操作重復(fù)6 次。

1.3.4 肉桂精油處理后腐生葡萄球菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

參考Chimnoi等[18]的方法測(cè)定腐生葡萄球菌的微生物生長(zhǎng)曲線，研究肉桂精油對(duì)其正常生長(zhǎng)的影響。將過(guò)濾除菌后的肉桂精油溶解于DMSO中至終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC與2 MIC，加入制備好的菌懸液100 μL到相應(yīng)試管中。以僅含DMSO的TSB為空白對(duì)照（CK）組。將接種后的各管置于搖床中37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。每隔2 h離心收集菌體。在每個(gè)時(shí)間段結(jié)束時(shí)，用無(wú)菌生理鹽水制備10 倍系列稀釋液備用。隨后，將100 μL樣品涂布于TSA培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.3.5 肉桂精油處理的腐生葡萄球菌細(xì)胞膜完整性測(cè)定

參考Liu Guorong等[19]的方法，通過(guò)紫外線吸收測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞膜完整性。將過(guò)濾除菌后的肉桂精油溶解于DMSO中至終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC與2 MIC，將菌液加入其中。以僅含DMSO的TSB為對(duì)照組。將接種后的各管置于搖床中37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取2 mL菌液，4 ℃、4 000 r/min離心收集菌體并將之重懸于2.5 mmol/L的HEPES緩沖液（pH 7.0）中，再分別加入1/2 MIC、MIC與2 MIC肉桂精油溶液，以不含肉桂精油的TSB培養(yǎng)基為空白對(duì)照（CK）組。每30 min取樣2 mL，4 ℃、5 000 r/min離心10 min后用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾上清液，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，吸光度越大，表明細(xì)胞膜破壞程度越嚴(yán)重。

1.3.6 肉桂精油處理的腐生葡萄球菌胞外AKP活力測(cè)定

將過(guò)濾除菌后的肉桂精油溶解于DMSO中至終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC與2 MIC，將100 μL菌液加入其中。以僅含DMSO的TSB為對(duì)照（CK）組。將接種后的各管置于搖床中37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 h。分別在0 h與5 h時(shí)，取2 mL菌液于4 ℃、4 000 r/min離心收集菌體，根據(jù)AKP測(cè)試盒說(shuō)明書測(cè)定胞外AKP活力。

1.3.7 肉桂精油處理的腐生葡萄球菌微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參考藍(lán)蔚青等[20]的方法，取對(duì)數(shù)期菌種按體積分?jǐn)?shù)1%接種量分別接種至1/2 MIC、MIC與2 MIC的肉桂精油溶液中，以DMSO作為空白對(duì)照（CK）組，37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)5 h后，取1.5 mL菌液8 000 r/min、4 ℃離心5 min，收集沉淀，用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液對(duì)菌體重懸浮后于4 ℃固定10 h。然后用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）洗滌3 次后棄上清液，然后分別用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、90%與無(wú)水乙醇梯度脫水，凍干后均勻涂在金屬箔片上并固定噴金，置于掃描電子顯微鏡下觀察菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.8 肉桂精油處理的腐生葡萄球菌生物膜形成能力測(cè)定

參考Mizdal等[21]的方法，并略有修改。分別向96 孔板中加入1/2 MIC、MIC、2 MIC的肉桂精油溶液后，加入106CFU/mL菌液，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。孵育后，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 5.8）洗滌除去弱黏附于生物膜的細(xì)胞，將形成的生物膜在室溫下干燥15 min后，用0.1%結(jié)晶紫染色液將黏附在壁上的生物膜染色15 min，再用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，隨即用體積分?jǐn)?shù)33%冰醋酸進(jìn)行細(xì)胞脫色，在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定洗脫液吸光度。以DMSO溶劑為陰性對(duì)照[22]，無(wú)菌水處理菌液為陽(yáng)性對(duì)照，分析肉桂精油對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，多組間數(shù)據(jù)差異性比較使用單因素方差分析，Duncan’s檢驗(yàn)與LSD法進(jìn)行均值多重比較；P＜0.05表示存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異；使用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 10 種植物精油處理對(duì)腐生葡萄球菌的MIC與MBC

表1 10 種植物精油對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌效果Table 1 Inhibitory effects of 10 plant essential oils on Staphylococcus saprophyticus

從表1中可以看出，不同植物精油在抑菌活性上表現(xiàn)出較大差異，在10 種受試植物精油中，以肉桂精油的作用效果最佳，其對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌圈直徑為（24.10±2.55）mm，MIC和MBC均為1 mg/mL。姜精油與甜茴香精油的抑菌性較弱，可能由于其中活性物質(zhì)易揮發(fā)，使部分有效成分在培養(yǎng)基表面重新分配[23]。植物精油大多含有酚類物質(zhì)，如百里香酚、丁香酚與香芹酚等，并以此發(fā)揮抗菌作用[24]。在肉桂精油中，肉桂醛為發(fā)揮其抑菌作用的主要成分[25]。

由MIC結(jié)果可知，肉桂精油在10 種精油中的抑菌性最強(qiáng)，因此后期將以DMSO為對(duì)照組，1/2 MIC、MIC、2 MIC肉桂精油為處理組，進(jìn)一步研究肉桂精油對(duì)腐生葡萄球菌的作用效果。

2.2 肉桂精油處理對(duì)腐生葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響

圖1 肉桂精油對(duì)腐生葡萄球菌生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effect of cinnamon essential oil on growth of Staphylococcus saprophyticus

正常情況下，微生物數(shù)量會(huì)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)受到外界不良因素影響，其生長(zhǎng)速率與生長(zhǎng)能力就會(huì)受到抑制，菌落總數(shù)相應(yīng)減少。因此，可通過(guò)菌落總數(shù)的變化來(lái)判定抑菌劑的作用效果。由圖1可知，CK組菌體生長(zhǎng)正常，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，其菌落總數(shù)呈上升趨勢(shì)，而不同質(zhì)量濃度肉桂精油處理組作用效果明顯，在2 h內(nèi)菌體數(shù)明顯降低。其中，1/2 MIC肉桂精油組菌體生長(zhǎng)在14 h時(shí)被完全抑制；MIC肉桂精油組與2 MIC肉桂精油組在5 h時(shí)被完全抑制，未有活菌檢出。結(jié)果表明，肉桂精油對(duì)抑制腐生葡萄球菌生長(zhǎng)有明顯效果。

2.3 肉桂精油處理對(duì)腐生葡萄球菌細(xì)胞膜完整性的影響

若在胞外介質(zhì)環(huán)境中檢測(cè)到細(xì)菌胞內(nèi)在260 nm波長(zhǎng)處具有強(qiáng)吸收作用的物質(zhì)（如嘌呤、嘧啶、戊糖以及無(wú)機(jī)磷酸鹽等）以及在280 nm波長(zhǎng)處有最大吸收波長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，可表示細(xì)菌的細(xì)胞膜遭到一定程度破壞[26-27]。同時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中重要組分的泄漏也表明菌體細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生不可逆損傷[28]。

圖2 肉桂精油對(duì)腐生葡萄球菌在260 nm（A）和280 nm（B）波長(zhǎng)處紫外吸收的影響Fig. 2 Effect of cinnamon essential oil on absorbance of Staphylococcussaprophyticus suspension at 260 (A) and 280 nm (B)

由圖2可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，不同質(zhì)量濃度處理組在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處的吸光度總體呈上升趨勢(shì)，表明肉桂精油對(duì)腐生葡萄球菌的作用效果具有一定的時(shí)間依賴性。其中，MIC組與2 MIC肉桂精油處理組的吸光度相比于CK組上升迅速；其均在0.5 h時(shí)升高，處理1 h后，吸光度達(dá)到最大，2 MIC處理組的吸光度上升速度明顯快于MIC處理組，由此表明肉桂精油對(duì)腐生葡萄球菌的細(xì)胞膜完整性有較強(qiáng)破壞性，其能使菌體胞內(nèi)物質(zhì)大量滲出，作用強(qiáng)度與質(zhì)量濃度正相關(guān)。

部分學(xué)者通過(guò)對(duì)植物精油進(jìn)行化學(xué)氣相分析，結(jié)果表明植物精油中的主要抗菌組分是酚、萜烯、醛與酮類，認(rèn)為其可作用于細(xì)菌細(xì)胞膜[29]。同時(shí)，植物精油及其組分的疏水性在破壞菌體細(xì)胞膜過(guò)程中同樣有著關(guān)鍵作用，這一特征使精油的有效成分能透過(guò)細(xì)胞膜或在細(xì)胞膜中積累、破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜通透性增加、胞內(nèi)物質(zhì)溶出，造成位于細(xì)胞膜上的微生物能量代謝系統(tǒng)及其關(guān)鍵酶類的損傷與破壞，關(guān)鍵生理活性物質(zhì)的大量流失，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[30-31]。植物精油及組分在對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜造成破壞的同時(shí)，還會(huì)作用于細(xì)胞內(nèi)部的多種關(guān)鍵酶類，使其能量及代謝系統(tǒng)被破壞，導(dǎo)致菌體細(xì)胞對(duì)抗菌藥物的耐受性大大降低[32]。

2.4 肉桂精油處理對(duì)腐生葡萄球菌胞外AKP活力的影響

圖3 肉桂精油處理后腐生葡萄球菌胞外AKP活力變化Fig. 3 Effect of cinnamon essential oil on extracellular AKP activity of Staphylococcus saprophyticus

AKP與細(xì)菌細(xì)胞膜上的能量產(chǎn)生密切相關(guān)，通常存在于細(xì)菌的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜間隙中[33]。因此，正常情況下在胞外無(wú)法檢出；然而，當(dāng)菌體細(xì)胞壁受到損傷時(shí)，AKP則會(huì)泄漏到胞外的環(huán)境介質(zhì)中[34]。如圖3所示，經(jīng)過(guò)不同質(zhì)量濃度的肉桂精油處理5 h后，CK組AKP活力無(wú)顯著變化，各處理組的AKP活力均有所上升，AKP活力與肉桂精油質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，其中2 MIC肉桂精油組增長(zhǎng)最為明顯，在培養(yǎng)5 h時(shí)達(dá)6.52 U/mL。表明肉桂精油對(duì)腐生葡萄球菌的細(xì)胞壁有破壞作用，同時(shí)還可能使細(xì)胞膜遭到破壞，胞內(nèi)重要生理物質(zhì)泄漏，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。陳夢(mèng)玲等[30]研究得出牛至精油可使腐生葡萄球菌菌體細(xì)胞壁完整性遭到破壞，與本研究結(jié)果相似。

2.5 肉桂精油處理對(duì)腐生葡萄球菌微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖4中顯示了肉桂精油處理5 h后，其對(duì)腐生葡萄球菌的微觀形貌影響。在CK組中，菌體保持原有完整的球狀結(jié)構(gòu)，菌體表面致密、光滑而飽滿；而經(jīng)不同質(zhì)量濃度的肉桂精油處理后，菌體表面出現(xiàn)明顯皺縮，部分菌體表面不再致密，出現(xiàn)溶解與黏聚現(xiàn)象。同時(shí)，經(jīng)MIC與2 MIC肉桂精油處理后，部分菌體已破裂并有內(nèi)容物流出，表明肉桂精油對(duì)腐生葡萄球菌的菌體細(xì)胞壁與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞作用明顯，使細(xì)胞膜受到不同程度的損傷，胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，最終導(dǎo)致菌體死亡。陳夢(mèng)玲等[30]研究得出，牛至精油能使菌體變形，導(dǎo)致其表面破裂，外膜脫落。

圖4 肉桂精油對(duì)腐生葡萄球菌微觀結(jié)構(gòu)影響Fig. 4 Effect of cinnamon essential oil on microstructure of Staphylococcus saprophyticus

經(jīng)不同質(zhì)量濃度肉桂精油處理后，菌體細(xì)胞發(fā)生變化同A260nm和A280nm紫外吸收物質(zhì)測(cè)定的結(jié)果相符，表明細(xì)菌細(xì)胞膜受到不同程度損傷，得出肉桂精油對(duì)菌體細(xì)胞完整性存在破壞作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與AKP分析結(jié)果相符，表明肉桂精油對(duì)菌體的破壞作用可能先引起細(xì)胞壁損傷，隨后導(dǎo)致菌體細(xì)胞膜受損，使AKP發(fā)生泄漏。

2.6 肉桂精油處理對(duì)腐生葡萄球菌生物膜形成的影響

細(xì)菌生物膜是指細(xì)菌黏附于接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等，將其自身包繞其中而形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物[35-36]。生物膜的形成是細(xì)菌的一種保護(hù)機(jī)制，可通過(guò)觀察細(xì)菌生物膜的形成來(lái)觀察其是否受到抑制[37]。菌體經(jīng)結(jié)晶紫染色后，一般情況下，其生物膜密度越高，在570 nm波長(zhǎng)處的吸光度越大[38]。因此，可通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度來(lái)判定菌體生物膜的形成能力。

圖5 肉桂精油處理對(duì)腐生葡萄球菌生物膜形成的影響Fig. 5 Effect of cinnamon essential oil on biofilm formation of Staphylococcus saprophyticus

如圖5所示，不同質(zhì)量濃度的肉桂精油對(duì)腐生葡萄球菌生物膜的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，表明其對(duì)腐生葡萄球菌生物膜具有良好的清除效果，且抑制效果隨著肉桂精油質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。生物膜的形成機(jī)制較復(fù)雜，通常認(rèn)為受到胞間通訊系統(tǒng)在不同菌種間差異的影響，其常見(jiàn)的信號(hào)調(diào)節(jié)分子有脂肪?；呓z氨酸內(nèi)酯（acyl homoserine lactones，AHLs）、自誘導(dǎo)肽（autoinducter peptide，AIP）與自誘導(dǎo)分子-2（autoinducter-2，AI-2）等[39]；Kang Jiamu等[40]研究表明，沒(méi)食子酸在降低破壞福氏志賀氏菌細(xì)胞活力、破壞細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞膜完整性的基礎(chǔ)上，還能通過(guò)調(diào)節(jié)葡聚糖葡糖基轉(zhuǎn)移酶（mdoH）基因與骨橋蛋白（OpgH）來(lái)抑制生物膜形成。據(jù)報(bào)道，抗菌分子能與細(xì)菌細(xì)胞膜上羧基轉(zhuǎn)移酶的某些位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致乙酰輔酶A羧化酶活性降低或失效，阻斷脂肪酸和脂質(zhì)的生物合成過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞膜的破損[41]；同時(shí)，也使菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞。

3 討 論

通過(guò)比較10 種植物精油對(duì)腐生葡萄球菌的抗菌作用，并以抗菌作用最明顯的肉桂精油為研究對(duì)象，初步探究其對(duì)腐生葡萄球菌的作用機(jī)制。結(jié)果表明，肉桂精油對(duì)腐生葡萄球菌的MIC與MBC均為1 mg/mL；經(jīng)肉桂精油處理后，腐生葡萄球菌生長(zhǎng)明顯延緩，細(xì)胞膜通透性增加，其菌體完整性受到破壞，并對(duì)其生物膜的生成有明顯的抑制作用。

圖6 肉桂精油對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌機(jī)制示意圖[42]Fig. 6 Antimicrobial mechanism of cinnamon essential oil on Staphylococcus saprophyticus[42]

如圖6所示，植物精油的作用位點(diǎn)多樣，機(jī)制復(fù)雜，其對(duì)于細(xì)胞膜、信號(hào)分子的分泌與接收、能量代謝與物質(zhì)循環(huán)、增殖與傳代等研究還需要進(jìn)一步深入。同時(shí)，在菌體外部普遍存在的胞外基質(zhì)中，作為群體感應(yīng)系統(tǒng)中關(guān)鍵因素的AHLs等信號(hào)分子及胞外多糖在不同菌種的差異性可能也對(duì)不同菌株對(duì)植物精油的耐受力有一定影響[43]。

隨著相關(guān)技術(shù)進(jìn)步和研究不斷深入，植物精油及其主要成分作為一種天然、低毒、經(jīng)濟(jì)適用性高的生物活性物質(zhì)在抑制水產(chǎn)品特定腐敗菌生長(zhǎng)、延緩水產(chǎn)品氧化變質(zhì)、保持其品質(zhì)與延長(zhǎng)貨架期等方面具有較好潛力。后期課題組擬開(kāi)展對(duì)細(xì)菌細(xì)胞水平的能量代謝與物質(zhì)運(yùn)輸研究，從分子角度對(duì)胞間信息交流的各種特征信號(hào)分子影響進(jìn)行探討，以期為拓展植物精油的應(yīng)用范圍提供理論參考。