酪蛋白對(duì)乳清濃縮蛋白自組裝形成納米纖維的影響

徐紅華 王 欣 鞠婷婷 馬彩虹 關(guān) 琛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

在非常規(guī)條件下，蛋白質(zhì)分子通過(guò)疏水相互作用而形成的線狀聚合物被稱作納米纖維[1-3]，這種聚合結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)單體及其常規(guī)聚合形態(tài)賦予了高級(jí)功能性質(zhì)，不但具有更好的粘度、持水性、乳化性和起泡性等常規(guī)功能性質(zhì)[4]，還具有酸可逆性、導(dǎo)電性[5]，可作為超分子材料用于生物傳感器。研究發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白在pH值2.0和低離子強(qiáng)度下高溫加熱，可形成納米纖維[6]，且形成的纖維具有共同的結(jié)構(gòu)特征，即有支鏈或無(wú)支鏈的絲狀結(jié)構(gòu)，直徑為5～15 nm，長(zhǎng)度為幾微米[7-8]。文獻(xiàn)[9]研究發(fā)現(xiàn)，被胰蛋白酶修飾過(guò)的乳清濃縮蛋白(WPC)在加熱過(guò)程中聚合得更多，且纖維形成速率高于未修飾的WPC。酪蛋白(CN)是牛乳中的主要蛋白質(zhì)(約占蛋白質(zhì)總量80%)，常以酪蛋白膠束形式存在[10]。不同于其他蛋白質(zhì)，CN帶有相對(duì)較高的電荷，具有較高的疏水性和松散的卷曲結(jié)構(gòu)，且所有的CN均無(wú)游離巰基，但CN中的成分αs2-CN和κ-CN分子均有半胱氨酸殘基，分子間可以形成分子間二硫鍵而發(fā)生交聯(lián)[11-12]。目前，關(guān)于乳蛋白纖維的研究主要集中在乳清蛋白聚合條件及形成機(jī)理方面，缺乏復(fù)雜蛋白組分干擾的研究。CN作為主要乳蛋白基料成分，對(duì)乳清蛋白纖維結(jié)構(gòu)的形成至關(guān)重要。本文以WPC、CN為原料，在非常規(guī)條件下和WPC纖維形成的不同時(shí)期混入酪蛋白，觀察酪蛋白介入對(duì)纖維形成的影響，探究形成的WPC-CN纖維與非纖維聚合物的主要作用力和聚合動(dòng)力學(xué)過(guò)程，以期為拓展乳蛋白納米纖維聚合物在食品工業(yè)中的應(yīng)用以及不同乳蛋白基料的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳粉(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)34.67%、CN質(zhì)量分?jǐn)?shù)27.92%、乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.75%)來(lái)自新西蘭恒天然公司；乳清濃縮蛋白粉WPC-80(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)76.93%)購(gòu)自美國(guó)HILMAR公司；大豆色拉油(九三集團(tuán)哈爾濱惠康食品有限公司)；丙烯酰胺(美國(guó)Amersco公司)；TEMED(美國(guó)Sigma公司)；8-苯氨基-1-奈酚-碘酸(ANS)(美國(guó)Sigma公司)；硫黃素T(ThT)(美國(guó)Sigma公司)；考馬斯亮藍(lán)R250(美國(guó)Amresco公司)；甲叉雙丙烯酰胺(北京Solarbio公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS)(美國(guó)Sigma公司)，所用其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

GL-21M型離心機(jī)(上海精密儀器研究所)，KDN-102C型半自動(dòng)定氮儀(上海纖檢儀器有限公司)，F(xiàn)-4500型熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)，JEM-1200EX型透射電子顯微鏡(日本日立公司)，DELTA320型pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1CN的制備

參照文獻(xiàn)[13]的方法并加以改進(jìn)。用去離子水溶解脫脂乳粉，攪拌1.5 h，使其充分水合，7 000g離心15 min，取上清液，調(diào)其pH值至4.6(6 mol/L HCl和0.1 mol/L HCl)，1 000g離心15 min(室溫)，棄上清液，用去離子水洗沉淀，1 000g離心10 min，棄上清液，再用去離子水溶解沉淀，并調(diào)pH值至2.0(6 mol/L HCl和0.1 mol/L HCl)或6.5(2 mol/L NaOH和0.1 mol/L NaOH)，攪拌1.5 h，使其充分溶解，7 000g離心15 min，取上清液并測(cè)定蛋白質(zhì)含量，溶液4℃保存。

1.3.2纖維與常規(guī)WPC聚合物的制備

纖維聚合物的制備參照文獻(xiàn)[14]的方法并加以改進(jìn)。用去離子水溶解WPC-80粉，2 mol/L和0.1 mol/L鹽酸將溶液pH值調(diào)至2.0，在19 000g、4℃條件下離心30 min，吸其中層清液，測(cè)定清液蛋白質(zhì)含量，并用去離子水將溶液的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)稀釋為3.0%，再用鹽酸將溶液pH值調(diào)至2.0，90℃水浴10 h，每間隔1 h取樣并立即冷卻，于4℃保存。

常規(guī)WPC聚合物的制備是在上述過(guò)程中去除調(diào)節(jié)pH值的步驟，其他部分同上。

1.3.3WPC-CN聚合物的制備

在WPC溶液不同的熱處理時(shí)間混入CN，混合均勻，即在纖維(或常規(guī)WPC)聚合物形成的過(guò)程中混入CN，繼續(xù)90℃水浴至10 h，每間隔1 h取樣并立即冷卻，于4℃保存。

1.3.4CN混雜對(duì)WPC纖維形成的影響因素

(1)CN混入時(shí)間點(diǎn)

在固定WPC、CN溶液濃度的條件下，研究CN的混入時(shí)間點(diǎn)對(duì)WPC納米纖維形成的影響。試驗(yàn)條件確定為：pH值2.0、90℃條件下熱處理蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%的WPC溶液，在不同熱處理時(shí)間點(diǎn)(0、0.5、1.5、2、3、4、5、7、9 h)時(shí)與蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.5%的CN溶液以體積比2∶1的比例混合，并繼續(xù)加熱至10 h，每間隔1 h取樣后立即冷卻，于4℃保存。

(2)CN質(zhì)量分?jǐn)?shù)

選擇4種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CN：1.5%、2.0%、3.5%、6.0%。試驗(yàn)條件確定為：將pH值2.0、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%的WPC溶液，在90℃條件下熱處理至不同時(shí)間點(diǎn)(0、0.5、1.5、2、3、4、5、7、9 h)時(shí)與pH值2.0、不同蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)CN以體積比2∶1的比例混合(以質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%的WPC與pH值2.0的去離子水以2∶1的比例混合，即質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的WPC為對(duì)照)，并繼續(xù)加熱至10 h，每間隔1 h取樣后立即冷卻，于4℃保存。

1.3.5硫黃素T熒光強(qiáng)度

根據(jù)文獻(xiàn)[15]的方法并加以改進(jìn)，取400 μL待測(cè)樣品加入10 mL質(zhì)量濃度16 mg/L的ThT工作液中，混勻，用熒光分光光度計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng)為460 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為490 nm，狹縫寬度分別設(shè)為5 nm和10 nm)進(jìn)行測(cè)量。

1.3.6透射電子顯微鏡

根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法并加以改進(jìn)，用透射電子顯微鏡(Transmission electron microscopy, TEM)(采用80 kV電壓處理)觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.7表面疏水性

參照文獻(xiàn)[17]的方法并加以改進(jìn)，利用ANS熒光探針?lè)y(cè)定蛋白質(zhì)的表面疏水性。用0.01 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.0)將樣品溶液稀釋至蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.01%、0.005%、0.002 5%和0.001 25%，然后向6 mL稀釋液中加入16 μL濃度8 mmol/L的ANS溶液，混勻，避光15 min，后用熒光分光光度計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別設(shè)為390 nm和470 nm，狹縫5 nm)測(cè)量，利用熒光強(qiáng)度對(duì)稀釋液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作圖，將斜率作為蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)。

1.3.8游離巰基

參照文獻(xiàn)[17]的方法并稍加改進(jìn)。將10.4 g Tris(氨基丁三醇)、6.9 g甘氨酸、1.2 g EDTA(乙二胺四乙酸)、480 g脲素用水溶解，并定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至8.0，得到Tris-Gly(氨基丁三醇-甘氨酸)緩沖溶液。將待測(cè)樣品稀釋到蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%，取0.25 mL稀釋液加入到5 mL的Tris-Gly緩沖溶液中，向其加入20 μL的DTNB(二硫代二硝基苯甲酸)試劑，混勻，靜止15 min，并在412 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，以不加樣品的溶液用于空白。巰基質(zhì)量摩爾濃度計(jì)算公式為

X=(73.53A412D)/C

(1)

式中A412——在412 nm的吸光度

C——固形物質(zhì)量濃度，mg/mL

D——稀釋系數(shù)

X——巰基質(zhì)量摩爾濃度，μmol/g

1.3.9未聚合乳清蛋白含量

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%的WPC與3.5%的CN混合進(jìn)行熱處理，將15 mL不同熱處理時(shí)間(0～10 h)下的樣品溶液pH值調(diào)至4.6(使用2 mol/L HCl和0.1 mol/L HCl)，然后1 000g離心15 min，取上清液，并定容至25 mL，利用凱氏定氮方法測(cè)定：不同熱處理時(shí)間下未聚合WPC的含量；單位時(shí)間內(nèi)與CN聚合的WPC占總聚合WPC的百分比；時(shí)間t時(shí)混入CN熱處理1 h內(nèi)形成的不同聚合物的聚合速率常數(shù)k。計(jì)算公式分別為

Y1=Ct/C0

(2)

Y2=1-Ct/C0

(3)

M=(Ct-1-C1)/(1-C10)×100%

(4)

k=(Ct-Ct+1)/(1-Ct)

(5)

式中Y1——WPC未聚合率

Y2——WPC聚合率

M——單位時(shí)間聚合WPC百分比，%

k——聚合速率常數(shù)

C0、C1、C10——0、1、10 h時(shí)WPC質(zhì)量濃度，mg/mL

Ct-1、Ct、Ct+1——t-1 h、t、t+1 h時(shí)未聚合WPC質(zhì)量濃度，mg/mL

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

使用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中每組試驗(yàn)有3個(gè)重復(fù)(n=3)，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 CN對(duì)WPC纖維形成的干擾

2.1.1形貌分析

pH值2.0、90℃加熱10 h的條件下，CN單獨(dú)存在不能形成纖維，如圖1a所示，其形成的是較大的不規(guī)則聚合物。而此條件下WPC單獨(dú)存在形成的纖維如圖1b所示，其形成桿狀細(xì)長(zhǎng)的纖維。

圖1 CN和WPC熱聚合后的TEM結(jié)果Fig.1 TEM results after thermal polymerization of CN and WPC

WPC纖維化過(guò)程主要有3個(gè)階段，成核期、生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期對(duì)應(yīng)的時(shí)間段可分別劃為0～2 h、2～5 h、5～10 h[18]。CN混入WPC后形成纖維的微觀結(jié)構(gòu)如圖2所示，在5、9 h混入CN對(duì)WPC纖維的形成影響不大，在0、0.5 h混入CN破壞了WPC纖維的結(jié)構(gòu)，對(duì)WPC纖維的形成影響較大。CN混入的時(shí)間越晚，纖維結(jié)構(gòu)越清晰，大量的CN附著在纖維表面上，因此，在WPC纖維形成的不同時(shí)期混入CN對(duì)其結(jié)構(gòu)的影響有很大不同，成核期混入CN，嚴(yán)重破壞了WPC纖維的結(jié)構(gòu)；生長(zhǎng)期混入CN，纖維形態(tài)已經(jīng)初步形成，CN對(duì)其有一定影響，但是纖維結(jié)構(gòu)的總體結(jié)構(gòu)框架沒(méi)有被破壞；穩(wěn)定期混入CN，纖維形態(tài)良好，大量CN附著在纖維表面上。

圖2 WPC纖維形成不同時(shí)期CN混雜共聚的TEM結(jié)果Fig.2 TEM images of aggregate solution by adding casein to WPC at different periods of heat-induced formation of WPC fibrils

圖3 CN混入時(shí)間對(duì)纖維形成的干擾Fig.3 Interference of mixing time of CN on fibril formation

2.1.2酪蛋白混入時(shí)間對(duì)纖維形成的干擾

纖維形成過(guò)程中，β-折疊數(shù)量不斷增加，ThT是一種能與β-折疊特異性結(jié)合的染料，結(jié)合后其熒光強(qiáng)度會(huì)隨折疊數(shù)量的增加而上升[19]，因此通常用此方法間接反映纖維形成的情況。以單一質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的WPC為對(duì)照，可將ThT結(jié)果分為3類，如圖3a所示，A類為T(mén)hT曲線明顯低于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的WPC，即其對(duì)纖維結(jié)構(gòu)形成有明顯的抑制作用，B類為T(mén)hT的曲線與質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的WPC相近；C類為T(mén)hT結(jié)果明顯高于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的WPC，即不抑制WPC纖維形成。故將A、B、C類混入CN的時(shí)間點(diǎn)歸納如下：A類：0、0.5、1.5 h混入CN；B類：2 h混入CN；C類：3、4、5、7、9 h混入CN。

如圖3b所示，三者的差異在加熱至5 h后愈發(fā)明顯，在A類時(shí)間點(diǎn)混入CN加熱至10 h時(shí)，熒光強(qiáng)度增加緩慢，B類的熒光強(qiáng)度增加量是A類的1.22倍，C類的熒光強(qiáng)度增加量分別是A類、B類的1.47、1.20倍。結(jié)果表明，CN在WPC纖維形成的不同時(shí)間點(diǎn)混入時(shí)，其熒光強(qiáng)度變化規(guī)律與TEM的纖維形貌結(jié)果一致，CN加入的時(shí)間越早，對(duì)應(yīng)纖維形成的抑制作用越明顯，在C類時(shí)間點(diǎn)(3～9 h)混入CN時(shí)，不影響WPC纖維形成，故認(rèn)為質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%的WPC與質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.5%的CN混合時(shí)，3 h為不影響纖維形成的CN混入時(shí)間點(diǎn)，此時(shí)形成的是WPC-CN纖維聚合物。

2.1.3酪蛋白混入質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)纖維形成的干擾

由于pH值2.0下的CN粘度很大，可以得到最大的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.0%，故選取4個(gè)CN質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.5%、2.0%、3.5%、6.0%，形成的不同聚合物的熒光強(qiáng)度均隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)至穩(wěn)定，熒光強(qiáng)度的變化情況如圖4所示。

圖4 混入CN質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)纖維形成的干擾Fig.4 Interference of CN concentration on fibril formation

在CN質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%～3.5%時(shí)，WPC熱處理2 h之前混入CN，皆可破壞WPC纖維的形成，3 h之后混入CN不會(huì)破壞WPC纖維的形成，此時(shí)形成的是WPC-CN纖維聚合物。而當(dāng)CN質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加到6.0%時(shí)，WPC熱處理4 h之前混入CN，皆破壞WPC纖維的形成，5 h之后混入CN不會(huì)破壞WPC纖維的形成，故ThT結(jié)果可劃分為：A類：0、0.5、1.5、3 h混入CN；B類：4 h混入CN；C類：5、7、9 h混入CN。故5 h是不影響纖維形成的CN混入時(shí)間點(diǎn)，此時(shí)形成的是WPC-CN纖維聚合物。在WPC熱處理2 h混入質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.0%的CN時(shí)，高于其他時(shí)間點(diǎn)混入CN的ThT結(jié)果。綜上，A、B類破壞纖維形成，C類不影響纖維形成，且隨著CN質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，形成WPC-CN纖維聚合物的CN混入時(shí)間點(diǎn)延后。

2.2 WPC-CN聚合物形成的主要作用力

圖5 不同pH值下WPC與CN混合共聚的表面疏水性變化曲線Fig.5 Changes in surface hydrophobicity of aggregate solution by adding casein to WPC at different periods of heat-induced WPC

在熱處理過(guò)程中，乳清蛋白與酪蛋白會(huì)發(fā)生變性，乳清蛋白自身或者與酪蛋白之間都會(huì)發(fā)生聚合，繼而導(dǎo)致聚合過(guò)程中作用力的變化，而聚合過(guò)程的主要作用力是表面疏水作用和游離巰基濃度變化導(dǎo)致的[20]，故試驗(yàn)繼續(xù)探究了不同條件下WPC-CN聚合物的表面疏水性、游離巰基之間的差異。試驗(yàn)選擇中間濃度CN(質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.5%)參與反應(yīng)，根據(jù)3.5%CN的3類CN混入時(shí)間點(diǎn)分別為：A類(0、0.5 h)、B類(2 h)、C類(3、5、9 h)。

2.2.1表面疏水性

如圖5所示，pH值2.0的表面疏水性高于pH值6.5。這可能是由于在pH值2.0條件下，蛋白質(zhì)所帶電荷量較大，分子間斥力較大，疏水氨基酸暴露程度較大所致[21]。而在pH值2.0的環(huán)境下，混入CN形成聚合物的表面疏水性明顯低于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的WPC的表面疏水性，表明CN的介入整體上降低了聚合物的表面疏水性。表面疏水性從大到小依次為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的WPC、B類、C類、A類，WPC纖維表面疏水性的出峰時(shí)間是熱處理5 h，該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的表面疏水性指數(shù)提高率為195.61%。而CN的混入改變了聚合物表面疏水性的出峰時(shí)間，使出峰時(shí)間點(diǎn)前移。WPC-CN纖維聚合物(即C類)出峰時(shí)間對(duì)應(yīng)的表面疏水性指數(shù)提高率約為0 h混入的1.46倍，約是WPC纖維的44.77%，WPC-CN非纖維聚合物的表面疏水性指數(shù)是WPC纖維的38.64%。結(jié)果表明，CN混入得越早，其表面疏水性變化越低，即疏水相互作用越小，可能越抑制纖維的形成。

2.2.2游離巰基

如圖6所示，在WPC熱處理過(guò)程中，混入CN所形成的聚合物，隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，游離巰基含量呈下降趨勢(shì)，這可能是由于蛋白質(zhì)在熱處理過(guò)程中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，游離巰基暴露并向二硫鍵轉(zhuǎn)變所致[22-23]。不同pH值間游離巰基的差異如下：pH值6.5條件下，游離巰基在1～2 h迅速降低，之后變化平緩，加熱至10 h其游離巰基質(zhì)量摩爾濃度約降低了76.33%，而pH值2.0條件下的相應(yīng)值約降低了13.0%，前者降低幅度遠(yuǎn)高于后者，是后者的5.87倍；說(shuō)明pH值6.5乳蛋白熱聚合的主要作用力為二硫鍵。相反，在pH值2.0條件下，二硫鍵在乳蛋白熱聚合中起到的作用較弱，對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的WPC纖維而言，游離巰基質(zhì)量摩爾濃度僅降低了8.40%，而不同時(shí)間點(diǎn)混入CN，游離巰基質(zhì)量摩爾濃度變化量差異不大，約降低了13.76%，結(jié)果表明CN的加入提高了游離巰基質(zhì)量摩爾濃度的變化量，其是WPC纖維的1.64倍。由圖可知，不同時(shí)間點(diǎn)混入CN的游離巰基質(zhì)量摩爾濃度變化速率不同，從大到小依次為：A類(0、0.5 h)、B類(2 h)、C類(3、5、9 h)，A類和B類在熱處理0～5 h時(shí)，游離巰基含量下降明顯。

圖6 質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%的WPC與3.5%的CN混合共聚的游離巰基含量變化曲線Fig.6 Change of free sulfhydryl group by mixed copolymerization of 3.0%WPC and 3.5%CN

綜上所述，pH值2.0下，WPC與CN聚合的主要作用力為表面疏水性(見(jiàn)表1)，CN早期的混入，可以促進(jìn)二硫鍵的形成，降低表面疏水性的提高。兩種作用力的共同作用促進(jìn)了CN與WPC的聚合，弱化了WPC自身間的作用，繼而抑制WPC的纖維自組裝，這種抑制作用在纖維形成初期混入CN尤為明顯，而在纖維形成的中后期混入CN，這種抑制減弱，可能是聚合發(fā)生在CN與初具纖維形態(tài)的WPC聚集體之間的緣故。

表1 不同pH值下聚合物主要作用力的差異Tab.1 Differences among major force of aggregate solution with two pH values

2.3 聚合動(dòng)力學(xué)

為了定量比較WPC纖維形成不同時(shí)期混入CN的聚合量，試驗(yàn)研究了聚合動(dòng)力學(xué)過(guò)程。

2.3.1聚合量

如圖7所示，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的WPC未聚合率高于WPC與CN混合的。在pH值6.5時(shí)，熱處理1 h內(nèi)，WPC與CN聚合基本完成，并且不同時(shí)間點(diǎn)混入CN，WPC與CN聚合量差異不大；pH值2.0下，在WPC纖維形成過(guò)程中，WPC在熱處理1～5 h聚合逐漸增加，5 h以后聚合量很少；而在WPC纖維形成過(guò)程中混入CN時(shí)，WPC與CN在1～5 h內(nèi)緩慢發(fā)生聚合。

圖7 WPC未聚合率曲線Fig.7 WPC unpolymerization rate curves

2.3.2WPC纖維形成不同時(shí)期CN混雜聚合的動(dòng)力學(xué)差異

計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)混入CN后，單位時(shí)間內(nèi)參與聚合的WPC占總聚合WPC的百分比見(jiàn)表2，WPC與CN的聚合主要發(fā)生在混入CN后的1～2 h里，并且CN加入得越早，與CN聚合的WPC越多。這種聚合量的變化不同于單一WPC形成纖維的聚合，在纖維形成過(guò)程中，WPC的聚合主要發(fā)生在前1～5 h，隨后的聚合量非常低。

混入CN熱處理1 h后，形成了不同聚合物的聚合速率常數(shù)k，WPC與CN在pH值6.5熱處理的聚合速率常數(shù)是pH值2.0的3.83倍，而pH值2.0時(shí)不同時(shí)間混入CN間的聚合速率常數(shù)從大到小依次為：2 h、0 h、5 h、WPC+WPC、2.0%WPC、9 h，即WPC-CN纖維聚合物的聚合速率低于非纖維聚合物。0 h混入CN聚合速率常數(shù)是5、9 h混入的2.33、25.13倍，而2 h混入CN聚合速率常數(shù)是0 h混入的1.76倍，表明在與WPC熱聚合物過(guò)程中，CN混入越晚，WPC與CN聚合的速率越慢，這里2 h較為特殊，這可能與其表面疏水性有關(guān)[24-25]。

表2 單位時(shí)間內(nèi)參與聚合的WPC占總聚合WPC的百分比Tab.2 Percentage of aggregated WPC per hour of aggregate WPC %

綜上，CN在WPC纖維的成核期混入時(shí)，由透射電鏡可知愈加破壞纖維的微觀形態(tài)；由熒光強(qiáng)度可知愈加降低β-折疊結(jié)構(gòu)的形成；由作用力可知愈加促進(jìn)二硫鍵形成，愈加降低表面疏水性；而由聚合量可知，WPC與CN聚合速率快，CN競(jìng)爭(zhēng)性地與WPC結(jié)合，弱化了WPC的纖維化進(jìn)程，致使破壞混雜纖維的形成。CN在纖維的生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期混入時(shí)，WPC已經(jīng)初具纖維形態(tài)，此時(shí)發(fā)生的是CN與WPC纖維的聚合，CN大多聚合在纖維的表面，不影響混雜纖維的形成。

3 結(jié)論

(1)在纖維形成不同階段混入CN，決定了形成聚合物的結(jié)構(gòu)形態(tài)。在WPC纖維形成的成核期混入CN，嚴(yán)重破壞了WPC的纖維結(jié)構(gòu)；在生長(zhǎng)期混入CN，對(duì)纖維結(jié)構(gòu)有一定影響，但纖維結(jié)構(gòu)的總體結(jié)構(gòu)框架沒(méi)有破壞；在穩(wěn)定期混入CN，纖維形態(tài)良好，沒(méi)有破壞WPC的纖維結(jié)構(gòu)。

(2)WPC-CN聚合物的作用力主要為疏水相互作用，二者間二硫鍵的過(guò)多形成會(huì)破壞混雜共聚纖維結(jié)構(gòu)的形成。

(3)混入酪蛋白越晚(5 h以后混入)，聚合速率常數(shù)k越小，多數(shù)乳清蛋白已在前期初步形成纖維，酪蛋白只與少量的乳清蛋白發(fā)生聚合，而這種聚合也主要發(fā)生在纖維結(jié)構(gòu)表面；反之，混入酪蛋白越早，聚合速率常數(shù)k越大，乳清蛋白與酪蛋白的聚合量越多，破壞了纖維的構(gòu)架，減弱了WPC間的聚合，形成更多的WPC-CN纖維聚合物。