塔里木馬鹿茸HGF基因部分外顯子克隆及表達(dá)特征

王 淼 芮 雪 羅慧麗 韓春梅*

（1塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

鹿茸是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能夠再生的哺乳動物器官［1］，而器官再生為人類研究提供完美的哺乳動物模型［2］。鹿茸的生長與再生能力是基于干細(xì)胞的分裂［3］。在創(chuàng)傷條件下，其微環(huán)境變化對鹿茸干細(xì)胞的影響可能是促進(jìn)鹿茸再生及快速生長發(fā)育的重要原因。肝細(xì)胞生長因子（Hepatocyte growth factor,HGF）是最早發(fā)現(xiàn)能夠使創(chuàng)傷后肝臟再生的細(xì)胞因子［4］，后續(xù)研究表明，HGF在細(xì)胞、組織修復(fù)和再生中起著重要作用。Li等［5-6］對增殖區(qū)不同類型組織進(jìn)行研究，在分子水平揭示了鹿茸快速生長的機(jī)制。因此，研究鹿茸組織中的HGF基因及表達(dá)特征，為了解HGF基因在鹿茸組織中的調(diào)控作用和生長發(fā)育機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物與樣品采集

選取2～3歲健康的雄性塔里木馬鹿3頭，使用陸眠寧（1.0 mL/100 kg）麻醉馬鹿采用鋸割法采集新鮮鹿茸頂端組織，用75%的乙醇消毒后，垂直于鹿茸生長軸切取約4～6 cm的鹿茸組織，分離出茸皮、間充質(zhì)、軟骨、骨組織各100 mg/每塊，放入液氮罐備用。

1.1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、大腸桿菌DH5α、pMD19-T載體、凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa；Trizol、IPTG 均購自 Thermo Fisher；一抗 Anti-HGF（QC45570）購自SIGMA有限公司；二抗（PV-6001）購自中衫金橋；山羊血清封閉液（SL038）、DAB染色劑試劑盒（DA1010）均購自Solarbio；PBS緩沖液購自TBA公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇、氨芐青霉素、NaOH、NaCl等試劑產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank上公布的牛的HGF（AB110822.1）和 GAPDH（NM_001034034.2）基因 mRNA 序列，用Primer5軟件設(shè)計(jì)塔里木馬鹿HGF5基因和GAPDH基因引物，引物序列分別為F:TACCTAATTATGGGTGCACAATTC，R:TCCATTTTGCATAATATGCCACTC；F:TGTTTGTGATGGGCGTGAACCA，R:ATGGCGTGGACAGTGGTCATAA。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成

液氮罐中取出備用鹿茸組織，放入裝有液氮的研缽中研碎，轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管中，利用Trizol法提取四個(gè)組織的總RNA。用RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，操作方法按說明書進(jìn)行。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及克隆

以1.2.2獲得的4個(gè)組織的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL：Prime STAR Max Premix（2×）25 μL，cDNA 3 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 20 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃ 3 min預(yù)變性；94℃ 30 s變性、55℃ 15 s退火、72℃ 30 s延伸，共35個(gè)循環(huán)；72℃5 min總延伸。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后，pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中［7-10］，涂板于含有Amp+（100 mg/ml）的LB培養(yǎng)基上，37℃過夜。進(jìn)行菌落PCR，選擇陽性菌落搖菌，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4 塔里木馬鹿鹿茸HGF基因序列分析及比對

對獲得的塔里木馬鹿鹿茸HGF部分基因編碼序列進(jìn)行BLAST分析。

1.2.5 免疫組化

首先將割取鹿茸進(jìn)行消毒切至0.5～1 cm組織塊，放入倒有Otc的包埋支撐盒中切至6 μL厚度存放-80℃待用。然后將切片放入冷丙酮中固定10 min（溫度4℃），PBS沖洗三次；每張切片加入適量內(nèi)源性過氧化氫物酶阻斷劑，室溫孵育10 min，使用PBS緩沖液沖洗3次；每張切片滴加50 μL的10%山羊血清（PBS稀釋）在濕盒中進(jìn)行密封10分鐘，以防止切片變干；傾去山羊血清，不需要沖洗干凈，滴加一抗后在4℃冰箱里過夜；使用PBS緩沖液沖洗3次（1次/3 min）；滴加酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物，室溫孵育20 min；使用PBS緩沖液沖洗3次（1次/3 min）；加入適量新鮮配制的DAB染色劑，室溫孵育5～8 min，自來水沖洗；蘇木素染色液孵育20 s，自來水沖洗；使用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 鹿茸RNA提取

塔里木馬鹿鹿茸不同組織的總RNA瓊脂凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示。檢測結(jié)果顯示，4個(gè)組織均出現(xiàn)3條電泳條帶，分別為RNA的28S、18S和5S。從亮度上可見28S/18S約為2倍，所提取的RNA較完整，符合本實(shí)驗(yàn)要求，可以進(jìn)行下一步的操作。分別將四種RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，得到的cDNA溶液于-20℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物可以直接作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

圖1 鹿茸不同組織總RNA檢測結(jié)果

2.2 鹿茸HGF基因克隆

取2.1獲得的RNA樣品通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到一條約349 bp的目的條帶，與預(yù)期片段大小相符，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。結(jié)果圖2所示：

圖2 塔里木馬鹿鹿茸HGF基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 測序結(jié)果與序列分析

HGF基因RNA的測序結(jié)果將PCR獲得的HGF部分序列，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，獲得349 bp，以下為測序拼接結(jié)果如下：

ACCTAATTATGGGTGCACAATTCCTGAAAAAA CCACTTGCAGTGTTTATGGCTGGGGCTACACTGGAT TGATCAACTCAGACGGTCTACTACGAGTAGCACAT CTCTATATTATGGGGAATGAGAAATGCAGCCAATA CCATCAAGGGAAGGTGACTCTCAATGAGTCTGAAA TATGTGCTGGGGCTGAAAATATTGTATCAGGACCA TGTGAGGGAGATTATGGTGGCCCACTTGTTTGTGA ACAACATAAAATGAGAATGGTTCTTGGTGTCATTG TTCCTGGTCGTGGCTGTGCCATTCCAAACCGTCCTG GCATTTTTGTCCGAGTGGCATATTATGCAAAATGG

本試驗(yàn)擴(kuò)增出HGF的RNA序列為349 bp，編碼116個(gè)氨基酸。通過比對塔里木馬鹿HGF部分基因與瘤牛（基因序列號XM027539811.1）、普通牛（NM001031751.2）、白尾鹿（XM020876600.1）、山羊（XM013963237.2）、綿羊（XM027968556.1）、野 豬（XM021063486.1）、野駱 駝（XM006194336.2）、馬（XM023639072.1）、野驢（XM014855377.1）、野 馬（XM008538444.1）相應(yīng)的同源性分別為98.57%、98.57%、97.99%、97.71%、97.42%、96.56%、95.70%、95.42%、95.42%、95.42%。HGF基因在物種間的高同源性表明它們在進(jìn)化過程中非常保守，即在不同物種中的功能具有相似性。

2.4 HGF基因在塔里木馬鹿鹿茸不同組織中的表達(dá)

經(jīng)過免疫組化檢測，HGF基因在鹿茸茸皮、間充質(zhì)、軟骨和骨組織中均有陽性反應(yīng)，且茸皮組織和軟骨組織中陽性反應(yīng)表達(dá)明顯，間充質(zhì)組織和骨組織中陽性反應(yīng)表達(dá)微弱。

HGF在塔里木馬鹿鹿茸皮層的表達(dá)免疫組化結(jié)果見圖3。

圖3 鹿茸茸皮組織免疫組化結(jié)果

在倒置顯微鏡下可以看到，茸皮是由表皮、真皮和皮下結(jié)締組織組成，真皮由網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成，并且存在大量毛囊和皮脂腺，皮下結(jié)締組織中由許多血管和纖維的分布（見圖3中A、B、C和D）。從圖片中觀察到鹿茸茸皮組織免疫組化實(shí)驗(yàn)組有黃褐色陽性反應(yīng)出現(xiàn)，主要分布在鹿茸茸皮組織真皮表皮中間基底層和毛囊周圍的皮脂腺上（見圖3中B、C和D），對照組為陰性反應(yīng)（見圖3中A），說明鹿茸茸皮組織中存在肝細(xì)胞生長因子的表達(dá)，且表達(dá)明顯。

塔里木馬鹿鹿茸HGF基因在間充質(zhì)組織中也有表達(dá)，但表達(dá)微弱如圖4。

通過倒置顯微鏡下觀察，可以明顯看到鹿茸間充質(zhì)層組織中細(xì)胞排列緊密，大部分細(xì)胞核細(xì)長呈梭形，排列方向與生長軸垂直，少數(shù)與生長軸平行，存在血管結(jié)構(gòu)（見圖4中E、F、G和H）。從圖片中觀察到鹿茸間充質(zhì)組織免疫組化實(shí)驗(yàn)組中間充質(zhì)細(xì)胞和基質(zhì)中有少量的黃褐色弱陽性反應(yīng)出現(xiàn)（見圖4中F、G和H），對照組為陰性反應(yīng)（見圖4中E），說明鹿茸間充質(zhì)組織中存在肝細(xì)胞生長因子的表達(dá)，但表達(dá)微弱。

圖4 鹿茸間充質(zhì)組織免疫組化結(jié)果

塔里木馬鹿鹿茸HGF基因在軟骨層中也有表達(dá)，陽性信號特征鮮明，如圖5。

圖5 鹿茸軟骨組織免疫組化結(jié)果

通過倒置顯微鏡下觀察，可以明顯看到鹿茸軟骨組織是由軟骨細(xì)胞、軟骨基質(zhì)和膠原纖維組成，軟骨細(xì)胞形態(tài)極不規(guī)則，細(xì)胞核仁不明顯，圍繞著管道呈螺旋狀排列，有一定的規(guī)律，基質(zhì)內(nèi)具有明顯的隱窩可以將基質(zhì)和軟骨細(xì)胞隔開，軟骨組織中存在大量血管（見圖5中I、J、K和L）。從圖片中觀察到鹿茸軟骨組織免疫組化實(shí)驗(yàn)組中軟骨細(xì)胞和基質(zhì)有陽性反應(yīng)出現(xiàn)（見圖5中J、K和L），對照組為陰性反應(yīng)（見圖5中I），說明鹿茸軟骨組織中存在肝細(xì)胞生長因子的表達(dá)，且非常明顯。

塔里木馬鹿鹿茸HGF基因在骨組織中表達(dá)微弱，如圖6。試驗(yàn)組骨細(xì)胞及其周圍有黃褐色陽性反應(yīng)出現(xiàn)（N、O和P）對照組M陰性反應(yīng)。

圖6 鹿茸骨組織免疫組化結(jié)果

在倒置顯微鏡下可以看到，骨組織是由細(xì)胞、纖維和基質(zhì)組成，分布大量排列不規(guī)則的骨小梁，骨小梁附近分布著大量血管（見圖6中M、N、O和P）。從圖片觀察到鹿茸骨組織免疫組化200X實(shí)驗(yàn)組骨細(xì)胞及其周圍有黃褐色陽性反應(yīng)出現(xiàn)（見圖6中P），對照組為陰性反應(yīng)（見圖6中M），說明鹿茸骨組織中存在肝細(xì)胞生長因子的表達(dá)，但是表達(dá)微弱。

3 討論

肝細(xì)胞生長因子（HGF）發(fā)現(xiàn)于上個(gè)世紀(jì)，從肝細(xì)胞中鑒定并克隆得到。隨著后期研究發(fā)現(xiàn)HGF系統(tǒng)廣泛表達(dá)于多種組織并參與復(fù)雜的生物學(xué)過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、運(yùn)動以及組織形態(tài)發(fā)生，對多種組織器官的發(fā)生發(fā)育、修復(fù)再生有著至關(guān)重要的作用［11］。Liu等［12］發(fā)現(xiàn)HGF上調(diào)MSCs的c-Met和磷酸化Met的表達(dá)，增強(qiáng)其肝保護(hù)作用。Transwell檢測顯示HGF能夠促進(jìn)MSCs遷移，而且介導(dǎo)了BMSCs誘導(dǎo)的肝修復(fù)。Bai L［13］發(fā)現(xiàn)該信號促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖并和神經(jīng)元的發(fā)育密切相關(guān)。Wen Q等［14］發(fā)現(xiàn)HGF濃度的連續(xù)變化對體內(nèi)MSCs的增殖和成骨分化有明顯的作用。

現(xiàn)階段研究中，大多學(xué)者把鹿茸再生作為再生醫(yī)學(xué)熱點(diǎn)研究模型［15-16］。因此，本研究以塔里木馬鹿鹿茸HGF基因?yàn)楹蜻x基因。將塔里木馬鹿鹿茸HGF與其他物種進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)與瘤牛、普通牛、白尾鹿、藏羚羊和綿羊的HGF核苷酸序列同源性較高，分別為 98.57%、98.57%、97.99%、97.71%、97.42%。本研究利用免疫組化試驗(yàn)檢測塔里木馬鹿鹿茸頂端茸皮組織、間充質(zhì)組織、軟骨組織和骨組織HGF基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，HGF在茸皮組織和軟骨組織中表達(dá)明顯，在骨組織和間充質(zhì)組織中微弱。說明HGF基因?qū)β谷醉敹松L發(fā)育有調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步研究HGF的功能和鹿茸快速生長的調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。目前，關(guān)于塔里木馬鹿HGF基因在分子水平上研究的報(bào)道較少，其具體生長調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過PCR方法擴(kuò)增、克隆塔里木馬鹿鹿茸中HGF部分外顯子序列349 bp，與其他物種序列比對結(jié)果表明，塔里木馬鹿鹿茸中HGF基因序列與瘤牛、普通牛、白尾鹿、藏羚羊和綿羊等同源性較高，分別為 98.57%、98.57%、97.99%、97.71%、97.42%。免疫組化檢測結(jié)果顯示，HGF在茸皮組織和軟骨組織中表達(dá)明顯，在骨組織和間充質(zhì)組織中微弱。