山區(qū)型和田羊毛囊KAP1.1基因表達(dá)載體構(gòu)建及生物信息學(xué)分析

余路菲 趙 軍 李樹偉*

（1塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

（2新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

毛囊作為真皮的衍生物，是一個結(jié)構(gòu)和功能非常復(fù)雜的亞器官［1］，是皮膚的主要附屬器之一，具有高度自我更新能力，是機體內(nèi)獨特的可再生器官，毛囊細(xì)胞經(jīng)增殖分化最終形成毛發(fā)。羊毛和絨纖維的主要成分是角蛋白，同時角蛋白是構(gòu)成毛纖維的骨架［2］，毛纖維角蛋白中間絲蛋白（keratin intermediate filament protein，KIF）和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（keratin-associated protein，KAP）占羊毛纖維的90%［2］，具有高度的規(guī)律化組織結(jié)構(gòu)［3-4］。角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白是組成羊毛纖維的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一［5］，根據(jù)其蛋白質(zhì)序列中的氨基酸含量，主要分為三大類型［6］。其中，高硫（high sulphur，HS）蛋白則為角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白超家族中的一個類型，包括KAP1、KAP2和KAP3三個家族，且大小約為151-181個氨基酸，Cys含量約為22%。據(jù)研究，角蛋白對毛纖維的理化性質(zhì)（細(xì)度、長度、密度、顏色和光澤、氨基酸含量等）具有一定影響［7］。由于KAP是編碼毛囊毛纖維結(jié)構(gòu)蛋白的主要基因，因此，探索其對綿羊羊毛性狀遺傳變異的影響,對利用該基因改善羊毛密度、毛纖維直徑、長度等品質(zhì)性狀有著非常重要的意義。

近年來，隨著分子生物學(xué)、基因工程等技術(shù)的不斷提升，對綿羊羊毛性狀和品質(zhì)的研究吸引了越來越多專家學(xué)者。利用基因技術(shù)探究角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白對羊毛纖維品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)羊毛的角蛋白組成與羊毛纖維結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系［8］，由于遺傳、生理、生活環(huán)境等因素，導(dǎo)致不同地區(qū)品種綿羊羊毛品質(zhì)有較明顯差異。朱建勛［9］在KAP11-1對5個中國綿羊群體的遺傳變異的影響研究中，認(rèn)為KAP11-1基因作為羊毛經(jīng)濟性狀的主要候選基因之一,其核苷酸序列的變異導(dǎo)致其相應(yīng)氨基酸的改變,最終可能會影響羊毛纖維的結(jié)構(gòu)；徐從祥等［10］研究KAP6.1基因的多態(tài)性及其與羊毛性狀的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)KAP6.1基因可作為綿羊污毛產(chǎn)量的候選基因之一,其中BB基因型可作為分子標(biāo)記用于選擇污毛產(chǎn)量高的個體；依明·蘇來曼［11］研究了和田羊KAP7、KAP8基因遺傳多樣性及其與羊毛長度的關(guān)聯(lián)性分析，其結(jié)果顯示和田羊KAP8基因沒有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，KAP7基因具有多態(tài)性,關(guān)聯(lián)分析表明,和田羊不同基因型之間羊毛長度差異顯著；劉曉軍等［12］用綿羊KAP2基因?qū)τ绊懷蛎誀畹谋硇筒町愡M行了研究，推測出KAP2基因可能是影響羊毛性狀的差異基因；李志剛等［13］用山區(qū)型和田羊毛囊KAP6.1、KAP7與KAP8基因進行克隆分析，成功在原核細(xì)胞中表達(dá)對山區(qū)型和田羊毛囊HGT蛋白3個家族的主要基因；武振輝等［14］探究了毛囊KIF2.9基因?qū)Π氪置偷胤狡贩N綿羊羊毛品質(zhì)和性狀的影響，成功克隆出山區(qū)型和田羊毛囊KIF2.9基因；高建軍等［15］研究了綿羊毛囊角蛋白基因?qū)Ξ愘|(zhì)毛綿羊羊毛性狀、品質(zhì)的影響，并成功構(gòu)建了和田羊毛囊角蛋白原核表達(dá)載體。

綜上所述，盡管對于羊毛毛囊角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因有一些研究，但對高硫蛋白家族中的KAP1.1基因在粗毛羊、半粗毛羊羊毛品質(zhì)方面的影響研究較少，對新疆南疆山區(qū)型和田羊品種（系）的羊毛毛囊發(fā)育相關(guān)基因的報道更少。因此，本試驗對山區(qū)型和田羊毛囊KAP1.1基因進行克隆及其生物信息學(xué)分析，為進一步探討角蛋白基因?qū)ρ蛎誀畹挠绊懱峁├碚撘罁?jù)，對研究新疆南疆地方特色綿羊品種遺傳資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 和田羊毛囊樣品采集及組織保存

山區(qū)型和田羊來自新疆和田地區(qū)策勒縣恩尼里克鄉(xiāng)，于塔里木大學(xué)動物試驗站飼養(yǎng)。將綿羊皮膚局部麻醉，體側(cè)羊毛去除一部分，用直徑為1 cm的取樣器采集樣品,保存于液氮中備用，后期對綿羊進行護理以至痊愈，手術(shù)程序嚴(yán)格遵循動物倫理福利要求。

1.1.2 主要試劑與儀器

真核表達(dá)載體pEGFP-N1購于上海迪奧生物科技有限公司，T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶HindIII、PstI均為寶生物工程有限公司產(chǎn)品;SanPrep‘柱式’質(zhì)粒DNA小提抽提試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司；梯度PCR儀（Veriti）購自ABI公司；低速臺式離心機（TDL-80-2B）購自上海安亭科學(xué)儀器廠；凝膠分析系統(tǒng)（GELDOC 2000）購自Bio-Rad公司；Motic顯微鏡（CX21）購自上海團結(jié)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

參照GenBank中的綿羊KAP1.1基因組序列（登錄號：HQ110109.1），利用DNAstar軟件設(shè)計引物，引物序列如下：F：5′-AAGCTTATGGCCTGCTGTTCC ACC-3′（下劃線為HindIII的酶切位點），R：5′-CTG CAGTCAGCAGGTGGGCTC-3′（下劃線為PstI的酶切位點）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 總RNA提取及cDNA的合成

用Trizol法提取山區(qū)型和田羊皮膚組織總RNA，利用分光光度計檢測樣品濃度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，以O(shè)ligo d（T）為引物，反轉(zhuǎn)錄獲得樣品的cDNA。

1.2.3 PCR擴增

以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系共20 μL：10×Ex PCR 緩沖液（無Mg2+）2.5 μL，25 mM MgCl23 μL，dNTP 1 μL，DMSO 0.3 μL，Ex Taq 酶 0.1 mL，Bio-H2O 11.9 μL，上、下游引物各 0.5 μL，cDNA模板0.2 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性11 min；94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃總延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.4 重組質(zhì)粒pMD18-T-KAP1.1的構(gòu)建與鑒定

將電泳檢測分析正確的綿羊毛囊KAP1.1基因用膠回收試劑盒回收目的片段連接pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-KAP1.1，將重組質(zhì)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)過夜，利用藍(lán)白斑挑選陽性菌，接種到氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，取菌液，按質(zhì)粒提取試劑盒操作步驟提取質(zhì)粒pMD18-T-KAP1.1。對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定及PstI、HindIII雙酶切鑒定，同時將鑒定正確的陽性菌送至公司進行測序。

1.2.5 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-KAP1.1的構(gòu)建與鑒定

將pMD18-T-KAP1.1重組質(zhì)粒和真核表達(dá)載體pEGFP-Nl分別用HindIII和PstI雙酶切，37℃恒溫水浴過夜，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果并拍照保存。利用膠回收試劑盒回收KAP1.1基因目的片段和真核表達(dá)載體pEGFP-N1片段，將兩者用T4 DNA連接酶16℃金屬浴連接過夜，構(gòu)建真核表達(dá)pEGFP-N1-KAP1.1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃恒溫培養(yǎng)在含卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基上并過夜，挑選陽性菌，接種到卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中，取菌液用質(zhì)粒提取試劑盒提取真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP-N1-KAP1.1，對真核表達(dá)重組質(zhì)粒進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，將鑒定正確的陽性菌送至公司測序。

1.2.6 生物信息學(xué)分析

采用MEGA6.0軟件對KAP1.1基因序列進行分析；采用ProtParam在線軟件對KAP1.1基因編碼蛋白基本理化性質(zhì)進行分析；采用SOPMA對KAP1.1蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；用ExPASy在線軟件中的TMpred對KAP1.1基因編碼蛋白跨膜區(qū)域及方向進行預(yù)測；利用ProtScate在線軟件對KAP1.1基因編碼蛋白親疏水性進行分析；利用MEGA6.0軟件對KAP1.1基因的同源性進行分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 和田羊毛囊KAP1.1基因PCR擴增結(jié)果

以山區(qū)型和田羊皮膚組織毛囊的cDNA為模板進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在519 bp處出現(xiàn)目的條帶（圖1），與預(yù)期片段大小一致。

圖1 山區(qū)型和田羊毛囊KAP1.1基因PCR擴增結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒pMD18-T-KAP1.1的鑒定

對重組質(zhì)粒pMD18-T-KAP1.1進行HindIII、PstI雙酶切鑒定，結(jié)果見圖2。由圖2可知，約在2 692 bp和519 bp處均出現(xiàn)目的條帶，與理論條帶大小相符，表明重組質(zhì)粒pMD18-T-KAP1.1構(gòu)建成功。

圖2 pMD18-T-KAP1.1克隆質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP-Nl-KAP1.1的鑒定

對重組質(zhì)粒pEGFP-Nl-KAP1.1進行PCR和HindIII、PstI雙酶切鑒定，結(jié)果見圖3和圖4。由圖3可知，在約519 bp處出現(xiàn)目的條帶，與KAP1.1基因大小相符；由圖4可知，約在4 700 bp和519 bp處均出現(xiàn)目的條帶，與理論條帶大小相符。

圖3 pEGFP-Nl-KAP1.1真核表達(dá)重組質(zhì)粒的PCR鑒定

圖4 pEGFP-Nl-KAP1.1真核表達(dá)重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.4 毛囊KAP1.1基因序列比對及分析

2.4.1 核苷酸序列比對

對山區(qū)型和田羊毛囊KAP1.1基因序列與Gen-Bank中KAP1.1基因序列進行比對，結(jié)果表明，山區(qū)型和田羊毛囊KAP1.1基因與GenBank中的美利奴羊KAP1.1基因序列同源性可達(dá)98.65%。第38位堿基T變?yōu)镃、第39位堿基C變?yōu)門、第42位堿基T變?yōu)镃、第394位堿基T變?yōu)镃、第441位堿基C變?yōu)門、第461位堿基G變?yōu)門、第484位堿基A變?yōu)镚（圖5），說明KAP1.1基因表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.4.2 氨基酸序列比對

與美利奴羊?qū)Ρ?，山區(qū)型和田羊毛囊KAP1.1蛋白第13位Ile突變?yōu)門hr；第132位Tyr突變?yōu)镠is；第154位Cys突變?yōu)镻he、第162位Ile突變?yōu)閂al。其氨基酸比對結(jié)果（圖6）。

圖5 美利奴羊和山區(qū)型和田羊毛囊KAP1.1基因序列比對結(jié)果（僅列出有差異的片段）

圖6 美利奴羊和山區(qū)型和田羊毛囊KAP1.1基因氨基酸序列比對結(jié)果（僅列出有差異的片段）

2.5 KAP1.1基因編碼蛋白的性質(zhì)分析

2.5.1 基本理化性質(zhì)分析

用在線ProtParam軟件對綿羊KAP1.1基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果顯示：與Gen-Bank中美利奴羊?qū)Ρ?，山區(qū)型和田羊KAP1.1基因編碼蛋白的原子總數(shù)，平均疏水性和脂肪酸系數(shù)略低于美利奴羊。其中，山區(qū)型和田羊KAP1.1蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為71.73（＞40），說明該蛋白不穩(wěn)定；脂肪族氨基酸系數(shù)為35.70，理論等電點為7.13，為典型的中性蛋白。

2.5.2 KAP1.1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA在線軟件工具預(yù)測KAP1.1蛋白的二級結(jié)構(gòu)，與GenBank中美利奴羊?qū)?，結(jié)果表明，和田羊與美利奴羊KAP1.1蛋白二級結(jié)構(gòu)基本相同，其中無規(guī)則卷曲占大部分，α-螺旋、延伸鏈較少，無β-轉(zhuǎn)角（表1）。無規(guī)則卷曲受側(cè)鏈相互作用的影響很大，α-螺旋是手性結(jié)構(gòu)，具有旋光能力，其穩(wěn)定性與它的氨基酸組成和序列有極大關(guān)系。

表1 毛囊KAP1.1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5.3 KAP1.1蛋白的跨膜區(qū)分析

利用在線TMpred工具對KAP1.1基因編碼蛋白跨膜區(qū)和方向進行預(yù)測，結(jié)果顯示，山區(qū)型和田羊KAP1.1基因編碼蛋白由膜內(nèi)向膜外可能存在3個跨膜區(qū)域，主要集中在第9、88、121位氨基酸處，由膜外向膜內(nèi)可能存在3個跨膜區(qū)域，主要集中在第10、90、121位氨基酸處（圖7）。由此可見，KAP1.1基因編碼蛋白視為跨膜蛋白。

圖7 KAP1.1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5.4 KAP1.1蛋白的親疏水性分析

利用在線ProtScate工具對KAP1.1基因編碼蛋白親疏水性進行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，KAP1.1基因編碼序列存在較多親水性和疏水性區(qū)域，說明KAP1.1基因編碼蛋白序列一部分蛋白表現(xiàn)為疏水性，一部分表現(xiàn)為親水性（圖8）。

圖8 KAP1.1蛋白的親疏水性分析

2.5.5KAP1.1基因的聚類分析

利用MEGA6.0軟件對不同物種KAP1.1基因序列進行聚類分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖9）。結(jié)果表明，山區(qū)型和田羊與美利奴羊最先聚集在一起，表明其親緣關(guān)系較近。

圖9 KAP1.1基因與其他物種間聚類分析

3 討論與結(jié)論

隨著我國紡織行業(yè)的不斷發(fā)展,羊毛在現(xiàn)代紡織工業(yè)中的作用日益顯著。細(xì)毛羊在草食畜動物牧業(yè)發(fā)展中占有重要地位［16］，是畜牧業(yè)重要的經(jīng)濟來源。新疆是我國綿羊主要生產(chǎn)地之一，和田羊作為南疆地方品種，獨特的地理環(huán)境使和田羊具有被毛兩型毛多，長且均勻的特點，羊毛富有彈性，且光澤和潔白度良好，是紡織工業(yè)的優(yōu)質(zhì)原料。但也存在體型較小、產(chǎn)毛量、產(chǎn)肉率和繁殖率低等缺點。

試驗選取和田羊毛囊作為材料，通過基因克隆等分子生物學(xué)手段獲得和田羊毛囊KAP1.1基因序列大小為519 bp,可編碼172個氨基酸。利用BLAST軟件將GenBank中美利奴羊（HQ110109.1）與山區(qū)型和田羊的KAP1.1基因測序結(jié)果進行序列比對。結(jié)果表明:山區(qū)型和田羊與GenBank中美利奴羊序列堿基同源性高達(dá)98.65%，氨基酸同源性達(dá)97.09%。其中有7個堿基發(fā)生突變，由于遺傳密碼的簡并性，只是引起了4處氨基酸發(fā)生變異，其中，第162位Ile突變?yōu)閂al，但對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能影響不大，至于第13位的Ile變異為Thr、第132位Tyr變異為His、第154位Cys突變?yōu)镻he，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能造成的影響需要進一步的生物試驗支持。

利用SOPMA在線軟件對二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測可知，KAP1.1蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲組成，此結(jié)構(gòu)常與酶活性部位和蛋白質(zhì)特異功能有關(guān)［17］，由此推測無規(guī)則卷曲是構(gòu)成該蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件。α-螺旋含量極少，α-碳是手性結(jié)構(gòu)，具有旋光能力，其穩(wěn)定性與它的氨基酸組成和序列有極大關(guān)系，脯氨酸是一個結(jié)構(gòu)比較特殊的氨基酸，脯氨酸的α-碳參與R基吡咯的形成，環(huán)內(nèi)的N-Cα建不能旋轉(zhuǎn)，且脯氨酸的肽鍵不具有酰胺氫，不能形成氫鍵,因此，多肽鏈中只要存在脯氨酸，α-螺旋即被中斷［18］。在水溶液中脯氨酸缺乏能與螺旋i-4位置［19］的羰基形成氫鍵的酰胺質(zhì)子并且影響其前一位置氨基酸殘基的扭轉(zhuǎn)角［19］，從而主要以伸展的構(gòu)象存在。因此，在水溶性蛋白中脯氨酸被認(rèn)為是螺旋結(jié)構(gòu)的破壞者［20］。由于脯氨酸是影響α-螺旋的主要原因之一，由氨基酸序列比對結(jié)果可知，氨基酸序列中脯氨酸含量并不少，推測氨基酸序列中脯氨酸含量會影響α-螺旋形成，至于脯氨酸含量是否為影響α-螺旋結(jié)構(gòu)的決定性因素，還需更進一步地試驗加以驗證。

跨膜區(qū)分析結(jié)果表明，KAP1.1基因編碼蛋白由膜內(nèi)向膜外、膜外向膜內(nèi)各有3個跨膜區(qū)域，由此可推測KAP1.1蛋白為跨膜蛋白。親疏水性分析結(jié)果顯示KAP1.1蛋白一部分蛋白表現(xiàn)為疏水性，一部分表現(xiàn)為親水性，結(jié)合跨膜區(qū)分析，KAP1.1蛋白為跨膜蛋白，跨膜蛋白包括外周蛋白和內(nèi)在蛋白。因此，外周蛋白則表現(xiàn)為親水性，內(nèi)在蛋白則表現(xiàn)為疏水性。

山區(qū)型和田羊與不同物種間KAP1.1基因系統(tǒng)發(fā)育樹［21］的結(jié)果反映了各物種間的親緣關(guān)系和進化關(guān)系，遺傳距離越小，親緣關(guān)系越接近，同源性越高［22］。山區(qū)型和田羊與美利奴羊最先聚集在一起，證明親緣關(guān)系最近，而野豬和犬與其他物種的差異特別大。

由于KAP含量可影響羊毛品質(zhì)［23］且KAP含量變化和數(shù)量有可能是決定羊毛品質(zhì)的一個重要因素，是編碼羊毛的結(jié)構(gòu)蛋白基因之一，對羊毛的細(xì)度，強度，長度，光澤等品質(zhì)有重要作用，KAP1.1基因成熟蛋白編碼序列高度保守，因此山區(qū)型和田羊KAP1.1基因可能是會影響羊毛的品質(zhì)的因素之一。

試驗以新疆特色動物山區(qū)型和田羊為研究對象，成功構(gòu)建了毛囊KAP1.1基因的表達(dá)載體，并對該基因的核苷酸和氨基酸序列進行了生物信息學(xué)分析。該研究將為探究南疆地方品種和田羊羊毛品質(zhì)提供一定的實驗數(shù)據(jù)，毛囊KAP1.1基因表達(dá)載體的構(gòu)建為進一步制備多克隆抗體提供了基礎(chǔ)材料，為深入探索綿羊功能性蛋白的表達(dá)提供理論依據(jù)。