血清CCL4水平和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥嚴(yán)重程度相關(guān)性研究

楊劍 李清雪 仝瑞曉 陳景偉

1.河北省優(yōu)撫醫(yī)院康復(fù)科，河北 石家莊 050051 2.石家莊市第四醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050011 3.邯鄲市中醫(yī)院婦科，河北 邯鄲 056000 4.河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合婦產(chǎn)科學(xué)教研室，河北 邯鄲 050200

骨質(zhì)疏松是人類骨骼的一種極其常見的疾病，其特點(diǎn)是骨強(qiáng)度下降，脆性骨折風(fēng)險顯著增加[1]。女性比男性更常見，由于絕經(jīng)后雌激素水平下降，其發(fā)病率顯著增加[2]。骨質(zhì)疏松被認(rèn)為是一種涉及內(nèi)分泌和遺傳因素的多因素疾病。骨質(zhì)疏松的主要診斷依據(jù)是骨密度以及腰痛[3]。然而，骨密度降低和影像學(xué)改變，如骨小梁減少或骨折，通常被解釋為中晚期骨質(zhì)疏松的指征。為了早期發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者骨代謝的變化，必須采用更新、更有效、更可靠的疾病監(jiān)測手段。CCL4，又稱巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1β，與破骨細(xì)胞活性和骨代謝疾病的病理進(jìn)程有關(guān)[4]。CCL4對多種細(xì)胞具有潛在的趨化作用，包括對冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等不同類型的細(xì)胞具有趨化作用。破骨細(xì)胞的遷移已被確定是包括骨質(zhì)疏松在內(nèi)的一些病理條件下的一個關(guān)鍵過程[5]。一項橫斷面臨床研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松患者的血清CCL4水平顯著高于健康對照組[6]。目前關(guān)于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血清CCL4水平和骨質(zhì)疏松癥嚴(yán)重程度目前研究有限，本研究的旨在探索絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血清CCL4水平和骨密度之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

2017年4月至2019年4月，66例絕經(jīng)后女性患者(包括32例腰椎骨折)診斷為PMOP。骨質(zhì)疏松定義為T值<-2.5。本研究的納入標(biāo)準(zhǔn)：50歲或以上絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者。排除標(biāo)準(zhǔn)包括有骨骼系統(tǒng)疾病、癌癥、腎臟疾病、心力衰竭、缺血性心臟病和糖尿病的患者。此外，在2個月內(nèi)接受了破骨細(xì)胞抑制劑和/或有機(jī)鈣治療的患者也被排除在外。同時選擇68例骨密度正常的絕經(jīng)后婦女[絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松婦女(PMNOP)]和67例育齡健康婦女作為對照組。本研究方案都得到醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有受試者都簽署書面知情同意書。

1.2 指標(biāo)評估

采用Oswestry殘疾指數(shù)(ODI)和視覺模擬評分法(VAS)評價PMOP患者的功能狀態(tài)和癥狀嚴(yán)重程度。ODI是對10種日常生活活動能力的評估，包括疼痛強(qiáng)度、旅行、社會活動、性活動、睡眠、站立、坐姿、步行、舉重和個人衛(wèi)生。嚴(yán)重程度評分越高，表示殘疾程度越高。采用10 cm水平VAS量表評價下肢和腰痛的程度。研究方案將中度至重度疼痛定義為VAS>3，而輕度疼痛由VAS<3表示。

脊柱骨折的影像學(xué)評估基于脊柱成像的Genant半定量法[7]。骨折分為3級，椎體高度降低20%～25%、降低26%～40%、降低>40%分別為1級、2級和3級。

所有受試者在禁食過夜后進(jìn)行靜脈采血。血液被收集到空置管中，然后立即離心以減少糖酵解。血清樣本在-80 ℃保存，直到檢測為止。用定量雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(Quantikine；R&D Systems，MN)對PMOP、PMNOP女性和健康對照者的CCL4水平進(jìn)行盲法分析。CCL4批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為4.36 %和3.25%。檢測范圍為31.2～2 000pg/mL。檢測炎癥標(biāo)志物IL-6和血清Ⅰ型膠原C端末端肽(CTX-I)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

通過SPSS 21.0軟件分析所有研究的數(shù)據(jù)。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)(四分位數(shù)范圍)表示。 通過Kolmogorov Smirnov檢驗評估數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性。使用Mann WhitneyU檢驗或?qū)W生t檢驗分析兩組之間血清CCL4水平的差異。通過單因素方差分析或Kruskal Wallis分析，然后進(jìn)行Tukey Posthoc分析，確定三組之間的差異。行Spearman或Pearson相關(guān)分析以評估CCL4血清水平與疾病嚴(yán)重性相關(guān)性。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1描述了本研究的所有參與者的基線臨床特征?；颊哧犃邪?6名PMOP女性，平均年齡(62.4±5.1)歲；68名年齡匹配的PMNOP女性，平均年齡(60.7±4.4)歲和67名健康育齡婦女，平均年齡(42.7±4.1)歲。一般人體特征參數(shù)(包括BMI和年齡)在PMOP和PMNOP組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與PMNOP和對照組相比，PMOP中IL-6和CTX-1標(biāo)志物顯著升高。此外，觀察到PMOP組患者的股骨頸和L1-L4BMD顯著低于PMNOP和健康對照組。

與PMNOP和對照相比，PMOP中血清CCL4水平增加(P<0.05)，見表1和圖1。PMNOP與健康對照組血清CCL4水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，與PMOP中的非骨折組相比，骨折組血清CCL4水平顯著升高(P<0.05)，見圖1。

表1 受試者的基線臨床特征參數(shù)及骨密度

圖1 血清CCL4水平比較Fig.1 Comparison of serum CCL4 levels

使用Genant分級系統(tǒng)，PMOP相關(guān)骨折患者被分為3個不同的組。12名患者被分為1級，11名被分為2級，9名被分為3級。Genant 3級血清CCL4水平顯著高于Genant1級(P<0.05)。雖然Genant 3級與Genant 2級、Genant 2級與Genant 1級的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；但是呈現(xiàn)一種趨勢，具有較高Genant等級的患者表現(xiàn)出較高的血清CCL4水平。血清CCL4水平與Genant等級呈正相關(guān)(r=0.580，P<0.05)。見圖2。

圖2 血清CCL4水平與Genant分級和BMD之間的相關(guān)性Fig.2 Associations between serum CCL4 level and Genant grade and BMD

進(jìn)一步檢測血清CCL4水平以探討其與PMOP患者的BMD和Genant分級的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)較高的CCL4水平與較低的股骨頸BMD(r=-0.396，P=0.001)和較低的腰椎(L1-L4)BMD相關(guān)(r=-0.364，P=0.003)，見圖2。然而，PMNOP與健康對照組比較，血清CCL4水平與股骨頸和腰椎BMD無顯著相關(guān)性。為了說明CCL4水平是否與PMOP的癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)，進(jìn)一步探討了血清CCL4水平和VAS以及ODI之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)CCL4水平與VAS(r=0.455，P<0.001)和ODI(r=0.499，P<0.001)呈正相關(guān)，見圖3。另外血清CCL4水平與CTX-1(r=0.432，P<0.001)和IL-6(r=0.437，P<0.001)也呈正相關(guān)，見圖3。但血清CCL4水平與PMNOP和健康對照組的CTX-1和IL-6水平無顯著相關(guān)性。

圖3 血清CCL4水平與VAS評分、Oswestry指數(shù)、血清I型膠原和IL-6水平的相關(guān)性Fig.3 Association of serum CCL4 levels with VAS scores, Oswestry indices, serum type I collagen and IL-6 levels

3 討論

本研究旨在確定PMOP患者血清CCL4水平與疾病嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)和健康對照組相比，PMOP血清CCL4水平顯著升高。此外，血清CCL4水平與PMOP女性中較低的BMD、骨折、臨床嚴(yán)重程度和骨質(zhì)疏松相關(guān)標(biāo)志物呈相關(guān)性。在調(diào)整年齡和BMI后，這些差異仍然很大。

現(xiàn)有研究[8]證實，免疫系統(tǒng)對骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制有重要作用，炎性趨化因子在骨質(zhì)疏松癥中起關(guān)鍵作用的是骨重建因子。通過參與刺激破骨細(xì)胞祖細(xì)胞的成熟和遷移，趨化因子信號與經(jīng)典M-CSF/RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化途徑有關(guān)[9]。以前的研究，包括小鼠和原代人類細(xì)胞培養(yǎng)的遺傳實驗，已經(jīng)證明趨化因子在生理條件下影響破骨細(xì)胞的分化和遷移[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)CCL4水平與股骨頸和L1-L4腰椎的BMD呈負(fù)相關(guān)。此外，CCL4水平與椎體骨折的影像學(xué)分級呈正相關(guān)。這兩項研究結(jié)果表明CCL4可能在破骨細(xì)胞活性中起重要作用。

破骨細(xì)胞來源于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞，后者又是造血祖細(xì)胞的后代。骨吸收是一個動態(tài)過程，需要破骨細(xì)胞分化，激活和遷移到再吸收部位[12]。在一項體外細(xì)胞研究中，在向培養(yǎng)基中加入特異性抗CCL4抗體后，RANKL誘導(dǎo)的遷移破骨細(xì)胞數(shù)量顯著下降[13]。在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中，CCL4可能是溶骨性病變發(fā)展中的主要破骨細(xì)胞激活因子[14]。所有這些發(fā)現(xiàn)都暗示CCL4是破骨細(xì)胞活性所必需的。本研究表明血清CCL4水平與疼痛和功能顯著相關(guān)。

研究認(rèn)為神經(jīng)系統(tǒng)通過控制骨重建和局部血流來調(diào)節(jié)骨組織生物學(xué)的性能[15]。實際上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)系統(tǒng)密切調(diào)控骨骼功能。高度支配骨骼系統(tǒng)的神經(jīng)纖維包括富含肽的降鈣素基因相關(guān)肽陽性纖維和受體激酶A中的A-δ原肌球蛋白等[16]。盡管年齡導(dǎo)致骨質(zhì)量減少，但支配骨骼的神經(jīng)元數(shù)量在整個人的生命周期內(nèi)保持相對靜止[17]。骨骼中神經(jīng)連接的存在直接影響骨重建，維持內(nèi)部動態(tài)平衡并控制合成代謝和分解代謝的骨代謝。一項涉及使用小鼠PSNL模型的研究調(diào)查了CCL4如何影響神經(jīng)性疼痛[18]。發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷坐骨神經(jīng)損傷的小鼠模型在施萬細(xì)胞和損傷部位的巨噬細(xì)胞中具有CCL4表達(dá)的增加。此外，CCL4抗體能夠減輕這些病理特征。

總之，這些發(fā)現(xiàn)表明CCL4可能是促進(jìn)PMOP患者疼痛感的重要因素。我們進(jìn)一步檢查了血清CCL4水平與骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物CTX-1以及骨質(zhì)疏松癥相關(guān)炎癥標(biāo)志物IL-6之間的關(guān)系。已經(jīng)證實血清CTX-1值在骨吸收加速的條件下升高；通過分析血清CTX-1水平，可以檢測到骨質(zhì)疏松癥中骨轉(zhuǎn)換增加以及繼發(fā)于絕經(jīng)后骨吸收增加[19]。IL-6已被確定為炎癥細(xì)胞因子，主要在絕經(jīng)后期刺激破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化[20]。本研究表明血清CCL4與血清CTX-1和IL-6之間的顯著相關(guān)性。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，與PMNOP和健康對照者相比，PMOP患者血清CCL4水平顯著升高。較高的CCL4水平與癥狀和影像學(xué)嚴(yán)重程度增加以及較低的BMD相關(guān)。目前的研究表明CCL4具有能夠預(yù)測PMOP疾病嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物的潛力。