水飛薊賓通過(guò)PI3K/AKT/FoxO1通路改善骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝和骨量

付濤 吳曉東 阿力·艾拜

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院關(guān)節(jié)脊柱科，新疆 烏魯木齊 830002

骨質(zhì)疏松是一種以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)受損、骨脆性增加、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征的代謝性骨病。據(jù)估計(jì)，在全世界老年婦女中，與骨質(zhì)疏松有關(guān)的骨折發(fā)病率約為40 %，在男子中約為13 %[1]。糖皮質(zhì)激素由于其抗炎和免疫抑制作用，在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。激素治療期間骨保護(hù)素與核因子受體激活劑κB配體比值的變化導(dǎo)致前3～6個(gè)月骨吸收增加，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的不良反應(yīng)，骨折風(fēng)險(xiǎn)也明顯增加[2]。糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松(GIOP)在繼發(fā)性骨質(zhì)疏松中居首位。有一些證據(jù)顯示氧化應(yīng)激與絕經(jīng)后骨密度喪失之間的相關(guān)性；絕經(jīng)期雌激素缺乏會(huì)增加氧化應(yīng)激和骨量流失[3]。水飛薊素(Silibinin, SIL)是一種抗氧化劑，具有保肝、抗癌、神經(jīng)保護(hù)和心臟保護(hù)作用[4]。此外，據(jù)報(bào)道，水飛薊賓通過(guò)抑制鼠MC3T3-E1中的破骨細(xì)胞生成并增強(qiáng)成骨細(xì)胞的生成，有可能在體外預(yù)防骨量丟失[5]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可通過(guò)刺激骨髓干細(xì)胞(hBMSCs)中堿性磷酸酶、I型膠原和骨鈣素表達(dá)的成骨生物標(biāo)志物來(lái)增強(qiáng)成骨作用[4]。由于氧化應(yīng)激在OP中發(fā)揮重要作用，水飛薊素具有抗氧化作用，然而，其對(duì)GIOP的研究目前有限。因此，本研究旨在探討水飛薊素對(duì)GIOP大鼠骨量和骨代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

12周齡雌性Sprague Dawley(SD)大鼠30只，體質(zhì)量(230±15)g，購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。水飛薊素[Silymarin capsules (Ligalong)，批號(hào)： 20190021]、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽(CTX-I)、堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒和骨鈣素(OC)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海源業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組和治療

動(dòng)物分組造模，自適應(yīng)喂養(yǎng)雄性SD大鼠1周，測(cè)定空腹血糖(FBG)。將大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只：對(duì)照組(CON組)，肌肉注射生理鹽水0.1 mL；地塞米松組(DEX組)10只，肌肉注射地塞米松溶液0.1 mL，1 mg/kg(每周2次)；連續(xù)干預(yù)3個(gè)月建立GIOP大鼠模型[6]。地塞米松+水飛薊素組(SIL組)10例，給予地塞米松溶液0.1 mL，每周2次；同時(shí)給予水飛薊素100 mg/(d·kg)灌胃，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。處死前集外周血清和雙側(cè)股骨。雙側(cè)股骨用生理鹽水紗布包裹，置于-20 ℃的冰箱中備用。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

將左側(cè)股骨在室溫下解凍并固定在樣品架中，使用SCANCOuCT80進(jìn)行微計(jì)算機(jī)斷層掃描(micro computed tomography，Micro-CT)掃描。該掃描儀的電壓為50 kVp，電流為200 μA，分辨率為15 μm/像素。骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)包括骨密度(BMD)、組織骨密度(TMD)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨體積/總體積(BV/TV)、相對(duì)骨表面(BS/TV)、骨小梁分離度(TBsp)和連接密度(Conn.D)，通過(guò)使用內(nèi)置軟件進(jìn)行定量分析來(lái)確定連接密度(connection density，Conn.D)。

待影像學(xué)檢測(cè)完畢后，進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)。在進(jìn)行測(cè)試時(shí)，股骨水平放置在機(jī)器的表面上，探頭慢慢地放下。加載方向垂直于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，作用在骨的中心軸上，加載速度為2 mm/min。通過(guò)與試驗(yàn)機(jī)連接的計(jì)算機(jī)專用軟件自動(dòng)記錄載荷-位移曲線，得到最大載荷和彈性模量。

使用試劑盒檢測(cè)大鼠血清TRACP、CTX-I、ALP和OC水平，并嚴(yán)格按照生產(chǎn)廠家試劑盒上的說(shuō)明進(jìn)行操作。ELISA試劑盒檢測(cè)血清TRACP、CTX-I、ALP和OC水平。

隨后對(duì)大鼠股骨進(jìn)行蛋白印跡分析。取自右側(cè)股骨的骨標(biāo)本放入RIPA緩沖液中溶解。在4℃下以12 000 r/min離心20 min后收集上清液，并用改進(jìn)的Bradford法(Bio-Rad Laboratory Inc.，Hercules，CA，USA)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。裂解物(20～30 g)用10 %十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素印跡膜上。在室溫下用5 %脫脂牛奶(用牛血清白蛋白檢測(cè)磷酸化蛋白)封閉1 h后，用抗β-肌動(dòng)蛋白(1∶5 000；ab6276)、抗akt(1∶500；ab28422)、抗p-akt(1∶500；ab8932)、抗foxO1(1∶1 000；ab52857)孵育膜和抗p-FoxO1(1∶500；ab131339)抗體(均來(lái)自英國(guó)劍橋的Abcam)在4 ℃過(guò)夜，然后與二抗(1∶1 000；Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA，USA)在37 ℃孵育1 h。用Image J軟件測(cè)量各蛋白條帶的總和密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重比較

治療12周后，大鼠的體重發(fā)生變化，DEX組大鼠體重明顯低于CON組(P<0.05)；而SIL組與CON組相比，體重?zé)o顯著變化(P>0.05)，見(jiàn)表1。其中CON組2只大鼠死亡，而SIL組與DEX組各有3只大鼠死亡。

表1 大鼠的體重變化Table 1 The changes of body weight of

2.2 Micro-CT分析結(jié)果

股骨干骺端三維重建結(jié)果如圖1所示。股骨的微觀參數(shù)如表2所示。DEX組左側(cè)股骨BMD、TMD、Conn.D、Tb.N、Tb.Th、Tb.p、BS/TV較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)；SIL組左側(cè)股骨BMD、Conn.D、Tb.Th均明顯高于DEX組(P<0.05)。

圖1 各組大鼠治療12周后左股骨干骺端三維重建結(jié)果Fig.1 Three-dimensional reconstruction of the left femoral metaphysis after 12 weeks of treatment in each group of rats

表2 大鼠左股骨的Micro-CT檢測(cè)結(jié)果Table 2 Micro-CT results of the left femur of

2.3 股骨的生物力學(xué)變化

股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)表明，SIL組的最大載荷和彈性模量均高于DEX組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 右股骨的三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Three-point bending test results of the right femur of

2.4 血清ALP、OCTRACP和CTX-I的變化

與CON組比較，DEX組血清骨形成指標(biāo)(ALP、OC)顯著降低(P<0.05)，骨吸收指標(biāo)TRACP、CTX-I顯著升高(P<0.05)。與DEX組比較，SIL組血清骨形成指標(biāo)ALP和OC顯著升高(P<0.05)，骨吸收指標(biāo)TRACP和CTX-I顯著降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 大鼠的ALP，CTX-1，OC和ACP的結(jié)果Table 4 Results of ALP, CTX-I, OC, and ACP of

2.5 SIL對(duì)PI3K/AKT/FoxO1信號(hào)通路影響

通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)AKT、磷酸化的AKT(p-AKT)、FoxO1和p-FoxO1水平。與CON組相比，地塞米松提高了p-AKT/AKT的比例和p-FoxO1的蛋白質(zhì)含量，但FoxO1的蛋白質(zhì)水平卻有降低(P<0.05和P<0.01)(圖2)。根據(jù)這些結(jié)果，地塞米松抑制了FoxO1的轉(zhuǎn)錄活性。用大蒜素處理后，部分消除了地塞米松的上述作用(P<0.05和P<0.01)。這些數(shù)據(jù)表明，大蒜素通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路能夠上調(diào)FoxO1轉(zhuǎn)錄活性?？偟膩?lái)說(shuō)大蒜素上調(diào)FoxO1轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控骨代謝。

圖2 SIL促進(jìn)FoxO1蛋白質(zhì)表達(dá)注：A 通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析確定p-AKT、AKT、p-FoxO1和FoxO1的蛋白質(zhì)水平；B 和DEX組相比，SIL組顯著降低組織中p-AKT/AKT的比率。與CON組比較，**P<0.01；與DEX組比較，##P<0.01。Fig.2 FoxO1 protein expression promoted by SIL

3 討論

在本研究中，使用Micro-CT發(fā)現(xiàn)DEX組大鼠股骨的骨密度顯著下降，表明建模是成功的。用SIL治療GIOP大鼠后，BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Conn.D與DEX組相比呈增加趨勢(shì)，表明骨小梁的微觀結(jié)構(gòu)得到改善。

骨質(zhì)疏松癥是一種發(fā)病率較高的骨代謝性疾病。GIOP在繼發(fā)性骨質(zhì)疏松中占首位。研究表明，糖皮質(zhì)激素治療開(kāi)始3個(gè)月內(nèi)，脊椎骨折的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，12個(gè)月時(shí)達(dá)到高峰。在連續(xù)接受糖皮質(zhì)激素治療的患者中，骨折風(fēng)險(xiǎn)與每日口服糖皮質(zhì)激素劑量密切相關(guān)[7]。因此，骨質(zhì)疏松癥越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。Milic等[8]總結(jié)了水飛薊賓的作用，并暗示水飛薊賓可能是預(yù)防或治療癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、肝炎和肝硬化有潛力藥物。此外，研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可通過(guò)抗氧化作用和PI3K/Akt途徑的調(diào)節(jié)來(lái)減輕高糖介導(dǎo)的hBMSCs功能障礙[4]。這些結(jié)果表明水飛薊素具有治療骨質(zhì)疏松的潛力。

作為重要的抗氧化應(yīng)激蛋白，F(xiàn)oxO調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)，其中FoxO1是FoxO家族的主要成員。通過(guò)細(xì)胞特異性缺失和分子分析，在4種FoxO蛋白中，F(xiàn)oxO1是成骨細(xì)胞增殖和氧化還原平衡所需的唯一因子，因此FoxO1控制骨形成[9]。FoxO1主要通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)，F(xiàn)oxO1蛋白通過(guò)PI3K/AKT途徑磷酸化，導(dǎo)致FoxO1依賴的轉(zhuǎn)錄抑制和DNA結(jié)合能力受損[10]。AKT已被證明直接磷酸化并使FoxO1失活，從而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)保留、失活和抑制FoxO1調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平，這些基因控制各種過(guò)程，如代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞死亡和氧化應(yīng)激[11]。相反，抑制PI3K/AKT途徑誘導(dǎo)活性FoxO1的去磷酸化和核轉(zhuǎn)位，然后這些過(guò)程增強(qiáng)FoxO1的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和凋亡[12。這一系列研究表明，F(xiàn)oxO1是破骨細(xì)胞生成和骨吸收的主要控制節(jié)點(diǎn)，無(wú)論在生理還是病理?xiàng)l件下都是如此。本研究通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)AKT、磷酸化的AKT(p-AKT)、FoxO1和p-FoxO1水平。發(fā)現(xiàn)地塞米松提高了p-AKT/AKT的比例和p-FoxO1的蛋白質(zhì)含量，但FoxO1的蛋白質(zhì)水平卻有下降；用SIL處理后，AKT、磷酸化的AKT(p-AKT)、FoxO1和p-FoxO1改善明顯。這些結(jié)果表明SIL通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路能夠上調(diào)FoxO1轉(zhuǎn)錄活性來(lái)調(diào)控骨代謝。

骨生物力學(xué)中的骨結(jié)構(gòu)力學(xué)指標(biāo)測(cè)試是了解骨質(zhì)疏松性骨折風(fēng)險(xiǎn)的最直接方法。它也是骨強(qiáng)度、骨骼結(jié)構(gòu)和骨量的綜合表現(xiàn)。然而，觀察骨組織形態(tài)學(xué)和單獨(dú)測(cè)量骨密度不能完全反映骨質(zhì)量。使用機(jī)械性質(zhì)的干預(yù)效果的評(píng)估是治療骨質(zhì)疏松癥的其他方法不可替代的。在本研究中，三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)表明，DEX組的最大載荷和彈性模量顯著低于CON組，SIL治療可顯著提高大鼠骨組織的抗折強(qiáng)度。血清CTX-I是骨骼中I型膠原的降解產(chǎn)物。檢測(cè)血清CTX-I水平可以特異性地反映破骨細(xì)胞的吸收活性。TRACP主要由破骨細(xì)胞釋放的非膠原蛋白產(chǎn)生，破骨細(xì)胞與膠原代謝物一起分泌在細(xì)胞外。因此，TRACP和CTX-1水平與骨吸收呈正相關(guān)。成骨細(xì)胞可以分泌骨特異性ALP，ALP是總ALP的重要組成部分，可以反映骨形成的狀態(tài)。OC是骨基質(zhì)中最豐富的標(biāo)志物，其由成骨細(xì)胞釋放到細(xì)胞外，反映骨形成的狀態(tài)。此外，骨形成標(biāo)志物，包括OC、ALP和膠原蛋白1的表達(dá)，也顯著增加。本研究的結(jié)果表明SIL可增加成骨細(xì)胞活性和抑制破骨活性來(lái)促進(jìn)GIOP大鼠的骨形成來(lái)保護(hù)骨組織。但是本研究有其不足之處如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較少且研究時(shí)間較短，需要進(jìn)一步探索。

總之，水飛薊素可以通過(guò)PI3K/AKT/FoxO1信號(hào)通路調(diào)控骨代謝來(lái)改善骨密度、骨微觀結(jié)構(gòu)和骨強(qiáng)度以及治療GIOP。