氮量子點的制備及應用研究進展

賴 幸 陰 強 呂家煒

(東華理工大學化學生物與材料科學學院，江西 南昌 330013)

0 引言

自1983年Brus等[1]發(fā)現(xiàn)CdS量子點以來，量子點憑借發(fā)射波長可調、吸收峰寬、熒光量子產率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點逐漸成為納米材料領域的研究熱點。之后，CdSe、CdTe量子點等[2]含重金屬量子點的研究也逐漸增加，但重金屬元素使量子點具有生物毒性，限制了其應用，開發(fā)無毒性的量子點成為新的研究方向。2004年，Xu等[3]在分離、提純單壁碳納米管時首次發(fā)現(xiàn)了C-dots，之后C-dots引起了廣泛關注，已被應用到催化、生物和光電等領域[4]。相比于傳統(tǒng)無機半導體量子點，C-dots的熒光量子產率低。為了解決這個問題，研究人員通過氮摻雜去增加C-dots的活性位點和量子產率[5]。然而，現(xiàn)有的摻雜方式條件苛刻，摻入的氮元素含量低且僅存在于C-dots表面，限制了其應用[6，7]。因此，研究人員致力于開發(fā)一種以氮元素為基礎的新型納米材料。2014年湯新景課題組首先提出N-dots，該量子點具有水溶性好、光穩(wěn)定性優(yōu)異和生物相容性好等優(yōu)點[8]，在分析檢測、熒光標記、生物醫(yī)學領域具有廣泛的應用前景。本文綜述了N-dots的制備方法以及在分析檢測、熒光標記、生物醫(yī)學領域的研究進展，展望了N-dots在未來的發(fā)展方向。

1 制備方法

目前，N-dots的制備方法主要有水熱法、微波法和光化學法三種方法。

1.1 水熱法

水熱法是一種簡便、低成本且環(huán)境友好的納米材料合成方法。Chen等[8]將2-疊氮咪唑在甲醇中以一定溫度加熱24h，制備了不同粒徑的N-dots，其氮含量最高可達34.48%。為了減少反應時間，Gu等[9]將氨水作為親核試劑引入甲苯、2-疊氮咪唑和芐基三甲基溴化銨體系混合加熱，在水熱反應過程中，氨水不僅參與了開環(huán)反應，還促使N-dots的合成、表面鈍化以及功能化三個過程同時完成，反應效率顯著提高，2小時即可制得平均粒徑5.5nm的N-dots。制備氮含量高的N-dots是研究人員一直致力于攻克的難題，Zheng等[10]以5-氨基四唑為原料，將其溶于水在200℃下加熱，獲得了粒徑范圍在2-5nm的N-dots。引人關注的是，該方法制備的N-dots氮元素含量高達57.27%，是碳元素含量的1.6倍，如此高的氮含量是之前從未報道過的。盡管水熱法被廣泛應用，但是水熱法制備周期長，制備的穩(wěn)定性和重復性較差，且關于晶體生長過程影響因素的控制缺乏深入研究。因此，尋找高效的N-dots制備方法迫在眉睫。

1.2 微波法

基于微波升溫迅速、溫度梯度小和穿透力強等優(yōu)勢[11]，2008年，Zhu等[12]首次提出利用微波法一步快速合成C-dots。Tang等[13]用微波對2-疊氮咪唑和氨水進行加熱，僅用8分鐘制得了表面富含氨基的N-dots。微波合成的N-dots性能優(yōu)異，熒光量子產率高達34%，氮含量達到40%。在N-dots生成的同時，氨水不僅參與了開環(huán)反應，同時也參與了N-dots的表面鈍化。雖然微波法方便、快捷，但是對溫度和時間的控制要求比較嚴格，量子點尺寸難以控制[14，15]。

圖1 微波法制備N-dots原理圖[13]

1.3 光化學法

光化學法具有反應時間短、綠色快捷、反應進程可控的優(yōu)勢，早在1980年被日本科學家用于制備熒光尿嘧啶[16]。之后，光化學法也廣泛應用于納米材料的制備，如納米銀顆粒[17]、石墨烯[18]和硫化鎘[19]等。2017年，Jin等[20]首次采用光化學法合成了N-dots，該方法將2-疊氮咪唑溶于甲醇，置于365nm的紫外燈下進行反應，制得了2～4nm的N-dots，產率高達92.7%，遠高于水熱反應的產率33%。光化學法制備N-dots具有產率高、時間短、所得樣品水溶性好的優(yōu)點，是一種極具應用前景的合成方法。

2 N-dots的應用

N-dots具有優(yōu)異的光學性質、良好的生物相容性、響應性熒光淬滅/增強性質，以及易于修飾和功能化。這些特性使其在分析檢測、熒光標記和基因與藥物投遞領域有著廣泛應用。

2.1 分析檢測

2.1.1 重金屬離子檢測

環(huán)境中的重金屬離子不僅破壞自然環(huán)境，也對人體健康造成嚴重影響[21]。盡管C-dots作為熒光探針對重金屬離子進行檢測已經(jīng)實現(xiàn)，但是C-dots苛刻的制備條件限制了它的應用[22]。N-dots因其制備條件溫和，表面基團豐富且易功能化引起了研究人員廣泛關注。Wu等[23]將N-dots用于水溶液中銀離子和汞離子的檢測。銀離子和汞離子都能使N-dots的熒光迅速淬滅，但是汞離子使N-dots的熒光淬滅速度更快，兩者的檢測極限分別為0.48μM和0.63μM。熒光淬滅后往體系中加入乙二胺四乙酸，汞離子體系熒光恢復，這是由于汞離子與EDTA的親和力大于汞離子和N-dots的親和力，如圖2所示。張[24]采用聚乙烯亞胺修飾的N-dots對銅離子進行檢測，研究發(fā)現(xiàn)在一定范圍內，N-dots溶液的熒光強度隨著銅離子含量的增加而降低。在pH=3時，熒光淬滅效果最好，對銅離子的檢測極限為51nM。

圖2 N-dots檢測Hg2+和Ag+示意圖[23]

2.1.2 分子檢測

人體內半胱氨酸的含量預示著人體健康水平，因此將量子點設計成熒光探針對半胱氨酸含量的檢測意義重大[25，26]。2017年，Tang等[13]將N-dots與金納米粒子設計成熒光探針，對半胱氨酸含量進行檢測，如圖3所示。研究表明，N-dots與金納米粒子比例為4：1，體系pH=7.4時，探針效果最好，檢測范圍0.3～3μmol/L。在此基礎上，N-dots熒光探針成功用于血清和血漿中的半胱氨酸檢測，恢復范圍為90～106.7%?；谠撎结樍己玫募毎ねㄍ感院蜕锵嗳菪裕渤晒糜谌祟惙蜗侔┘毎械陌腚装彼岢上?。2018年，Gu等[9]將N-dots與銅離子設計成半胱氨酸探針，成功應用于人體血清和血漿中的半胱氨酸檢測，檢測極限5.3nM，恢復范圍97.2～105.7%，且成功應用于活體細胞中的半胱氨酸成像，在臨床診斷上具有廣闊應用前景。

圖3 N-dots與金納米粒子作為探針檢測半胱氨酸示意圖[13]

以N-dots為基礎的熒光探針除了應用在生物體內分子檢測外，對生物體外分子探測亦具有強烈的選擇性和高的靈敏度。Nie等[27]首次將N-dots與聚多巴胺組裝成熒光探針并負載在濾紙條上，實現(xiàn)了溶液中對硝基苯胺的檢測。該探針能夠精準識別并捕獲對硝基苯胺，當對硝基苯胺濃度范圍在5nmol/L～1μmol/L時，探針的熒光強度與對硝基苯胺的濃度呈線性關系，最低的探測極限1.65nmol/L。Zou等[28]用N-dots作為熒光分子，氧化石墨烯作為控制器，構建了以氫鍵為基礎的納米熒光探針，并應用于焦磷酸鹽的檢測。基于共振能量轉移機制，N-dots與氧化石墨烯結合后，N-dots熒光發(fā)生淬滅，當焦磷酸鹽存在時，熒光效應恢復。當焦磷酸鹽濃度在0～400μm范圍時，熒光強度與焦磷酸鹽濃度呈線性關系，其最低檢測極限為8.3nM。

N-dots作為熒光探針用于分析檢測已被廣泛應用，而作為表面增強拉曼散射增強劑對物質進行檢測卻少有報道。近年來，表面增強拉曼散射技術因其靈敏度高、選擇性強、對樣品無損以及對表界面原位分析檢測的能力等優(yōu)點成為了重要的分析手段之一，在分析檢測領域得到了廣泛應用[29，30]。Lin等[31]將N-dots與銀納米離子復合并作為增強劑，以硅為基底，利用表面增強拉曼散射檢測水溶液中的孔雀石綠和龍膽紫。值得注意的是，在復合的過程中，N-dots因其表面富含氧與氮的官能團作為還原劑使得反應短時間內在溫和的條件下得以完成。與此同時，N-dots也作為穩(wěn)定劑使銀納米粒子的水溶液中穩(wěn)定存在?；贜-dots修飾的銀納米粒子，表面增強拉曼散射能對水中的孔雀石綠和龍膽紫實驗高精度、高靈敏度探測。對于孔雀石綠，濃度在10～1000nmol/L范圍內，散射強度與濃度成線性關系，最低檢測極限為2.7nM；對于龍膽紫，濃度在5～100nmol/L范圍內，散射強度與濃度成線性關系，最低檢測極限為2nM。

化學發(fā)光是常見的分析檢測技術之一，與熒光探針分析相比，化學發(fā)光無需激發(fā)光，因此儀器結構更簡單且具有靈敏度高、信噪比高、檢出限低、線性范圍寬等優(yōu)點[32，33]。Zheng等[12]將N-dots溶液注入到NaIO4-H2O2化學發(fā)光體系中，使得溶液的化學發(fā)光強度增強了400倍。當N-dots加入到反應體系后，溶液顏色由無色變成了亮黃色，這表明N-dots改變了H2O2和NaIO4原來的反應。體系的發(fā)光機理為單線態(tài)的氧與N-dots之間的能量共振轉移和N-dots輻射電子-空穴對的湮滅。Fu等[34]用N-dots與高碘酸銀鉀組合成化學發(fā)光體系，并用于阿魏酸的檢測。阿魏酸能夠有效抑制N-dots-高碘酸銀鉀系統(tǒng)的化學發(fā)光強度，當阿魏酸濃度在3x10-7～1x10-5g/mL時，化學發(fā)光強度與阿魏酸濃度呈線性關系，最低檢測極限為8x10-8g/mL。這是N-dots首次基于化學發(fā)光對物質進行檢測，為N-dots在化學發(fā)光上的應用提供了極具參考性價值的信息。

圖4 N-dots-NaIO4-H2O2體系化學發(fā)光機理示意圖[12]

2.2 熒光標記

2.2.1 熒光墨水

熒光防偽技術具有成本低廉、操作方便且具有可調熒光強度和響應外部刺激等特點受到人們的普遍關注，其關鍵是尋找優(yōu)異的熒光墨水[35]。N-dots具有水溶性好、耐光漂白、熒光性能好、無毒和光穩(wěn)定性強等優(yōu)點，是一種優(yōu)秀的熒光墨水，對信息的加密和防偽具有重要意義。Chen等[8]用毛筆蘸取N-dots溶液在濾紙上書寫了N-dots和PKU字樣。該字樣在太陽光下是不可見的，只有在365nm紫外燈的照射下才能清晰可見。將書寫好字樣的濾紙浸入水中后再進行觀察，字樣仍清晰可見，這是常規(guī)的熒光墨水所不能達到的效果。除此之外，N-dots還可對棉線、絲綢、聚丙烯酰胺凝膠進行染色，染色后進行充分水洗，仍能在紫外燈和熒光顯微鏡下觀察到熒光。

2.2.2 細胞成像

細胞的熒光成像是深入了解癌細胞的病變發(fā)展的一種追蹤方式，為再生療法和免疫反應提供一定的基礎[36]。N-dots具有表面官能團豐富、低毒性、光穩(wěn)定性強、熒光可調等優(yōu)點，為其在細胞成像的應用提供了可能。2014年，Chen等[8]成功將N-dots用于線蟲細胞成像。將線蟲置于濃度為0.5mg/mL的N-dots溶液中培養(yǎng)之后，用熒光顯微鏡在不同激發(fā)波長下可觀察到線蟲呈藍綠色、綠色和紅色熒光。2017年，Jin等[20]將小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW264.7cells)與N-dots溶液培養(yǎng)6h后，當激發(fā)波長為770nm時，可在多光子共聚焦顯微鏡下觀察到細胞發(fā)出藍色和綠色熒光，而細胞在顯微鏡下的明場像是無色的。細胞的疊加圖像表明兩個通道中的光致發(fā)光來自相同的N-dots。與此同時，細胞的光致發(fā)光成像也說明N-dots是位于細胞的細胞質中，并不是細胞核，這與C-dots在細胞中的分布是一致的[37]。

2.3 基因與藥物投遞

借助量子點材料，實現(xiàn)基因與藥物在生物體內的靶向運輸和精準投遞是生物醫(yī)學的重大突破之一。N-dots制備條件更溫和、更易功能化，生物相容性更好，在基因與藥物投遞方面具有應用前景。Zhang[24]以聚乙烯亞胺修飾的N-dots為載體，成功將紅色熒光蛋白(REP)和Cy5-siRNA轉運到B16細胞中為了將聚乙烯亞胺修飾的N-dots更好應用于基因與藥物投遞，并對實驗條件進行了優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，無論是直鏈還是支鏈聚乙烯亞胺修飾的N-dots，其濃度越高，對B16細胞的傷害也越大，但總體來說，直鏈的毒性要小。直鏈聚乙烯亞胺修飾的N-dots半抑制濃度為100μg/mL，支鏈的為25μg/mL。然而，不管是REP還是Cy5-siRNA，支鏈聚乙烯亞胺修飾的N-dots投遞效率都比直鏈的高。

3 結論與展望

N-dots作為量子點家族的新成員，對其研究工作主要集中在開發(fā)不同的制備方法以及拓寬應用領域。在合成方法上，已有水熱法、微波法、光化學法三種。其中水熱法因制備工藝簡單、綠色環(huán)保被廣泛采用，但是，水熱法制備周期長限制了它的應用；微波法方便快捷，在短時間內即可獲得產物，但產物尺寸受功率和時間的影響，難以控制；光化學法綠色高效且反應進程控，應用潛力巨大。然而，現(xiàn)有制備方法都存在前驅體單一的缺點，因此，開發(fā)不同的氮量子點前驅體以及高效的制備方法是研究人員未來的主要研究方向。在應用方面，N-dots已被成功應用于分析檢測、熒光標記以及生物醫(yī)學領域?；贜-dots具有比C-dots更加優(yōu)異的光學特性、生物相容性和易功能化等優(yōu)點，相信在不久的將來，氮量子點在分析檢測、熒光標記、生物醫(yī)藥、光催化等領域將得到廣泛應用。