基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的多囊卵巢綜合征患者卵泡液研究

高丹丹，孫振高，馬英杰，王欣磊，張祎，李麗

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250014；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，濟(jì)南 250014)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女常見的內(nèi)分泌及代謝紊亂性疾病，作為無排卵性不孕的主要原因，其卵泡微環(huán)境的分子多樣性尚未完全闡明[1]。PCOS約占女性無排卵性不孕的80%[2]，臨床表現(xiàn)有高度的異質(zhì)性[3]，主要表現(xiàn)為高雄激素血癥、排卵功能障礙、多囊卵巢、不孕癥、胰島素抵抗、肥胖、脂代謝異常、慢性低度炎癥等[4]，有約6%～20%的育齡期婦女生活受到影響[5]，且長(zhǎng)期并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)高，目前認(rèn)為調(diào)整生活方式是治療PCOS的方法之一[6]。相關(guān)研究表明，PCOS可能涉及到的發(fā)病機(jī)制有下丘腦-垂體-卵巢軸功能異常、腎上腺內(nèi)分泌功能異常、胰島素抵抗和高胰島素血癥，同時(shí)還與環(huán)境及遺傳因素有關(guān)[7]。

PCOS病理發(fā)展的分子機(jī)制尚不清楚[8]，現(xiàn)研究者試圖利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找突破。蛋白質(zhì)組學(xué)是指一個(gè)細(xì)胞所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的總和[9]，以蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，彌補(bǔ)了基因組學(xué)的局限性，提供了蛋白質(zhì)作為細(xì)胞功能的額外信息，其主要研究細(xì)胞、組織、器官、機(jī)體等蛋白質(zhì)的表達(dá)、翻譯后的修飾以及蛋白質(zhì)間的相互作用。在疾病研究中，蛋白質(zhì)組學(xué)具有多種功能，主要包括新標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，某些疾病相關(guān)蛋白的篩選和鑒定，發(fā)病機(jī)制的研究和探索，早期臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)現(xiàn)，尋求新的治療方法等。

卵泡液是由血漿滲出液和顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞的分泌物組成，為卵母細(xì)胞提供了生長(zhǎng)發(fā)育的微環(huán)境，其主要成分為蛋白質(zhì)、類固醇激素、多糖、代謝物、活性氧(ROS)以及抗氧化物等，這些成分在卵泡發(fā)育、成熟及排卵過程中起著重要作用[10]。卵泡液成分可反映卵巢細(xì)胞分泌過程的細(xì)微變化，以及病理?xiàng)l件下血漿成分的變化；同時(shí)利用蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定卵泡液成分彌補(bǔ)了通過觀察卵母細(xì)胞發(fā)育階段和形態(tài)來評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞質(zhì)量的不足。

一、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展

蛋白質(zhì)組(proteome)概念最早于1994年提出，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的誕生為生命科學(xué)的發(fā)展提供了更廣闊的前景[11]。蛋白質(zhì)組是一個(gè)在時(shí)間和空間上動(dòng)態(tài)變化的整體[12]，近年來蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在疾病研究方面越來越受到重視，其在闡明疾病病理機(jī)制方面有重要作用，可以篩選出差異蛋白，找到疾病治療靶點(diǎn)[13]。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要分為兩種，一種是基于雙向凝膠電泳(2-DE)定量技術(shù)，主要是熒光差異凝膠電泳，該技術(shù)在傳統(tǒng)2-DE技術(shù)基礎(chǔ)上與熒光染技術(shù)相結(jié)合，避免了傳統(tǒng)2-DE重復(fù)性差，提高了敏感度[14]。另一種是基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)定量技術(shù)，該技術(shù)主要包括非標(biāo)記定量技術(shù)、同位素標(biāo)記定量技術(shù)兩種，LC-MS/MS在大規(guī)模檢測(cè)、鑒定和定量方面具有巨大的潛力[15]，其中絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ)是目前研究中應(yīng)用最多的，其樣本可以是經(jīng)胰蛋白酶酶切的多肽，該技術(shù)可以絕對(duì)定量蛋白質(zhì)，具有靈敏度高、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、蛋白質(zhì)覆蓋率高、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)[16]。

二、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在卵泡液研究中的應(yīng)用

卵泡液提供了卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的微環(huán)境，因此，PCOS患者卵泡液蛋白表達(dá)譜可以反映PCOS患者卵泡微環(huán)境的改變和卵泡發(fā)育相關(guān)的獨(dú)特病理生理學(xué)信息。1996年Spitze等[17]開啟了對(duì)人類卵泡液蛋白質(zhì)組的研究。

1.卵泡液中差異蛋白的篩選：Ambekar等[18]采用LC-MS/MS分析PCOS患者卵泡液蛋白質(zhì)組成，鑒定出186種蛋白質(zhì)存在差異豐度。差異蛋白主要包括雙向調(diào)節(jié)蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖2、腫瘤壞死因子(TNF)、α誘導(dǎo)蛋白6、纖溶酶原和淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體1等，這些蛋白參與卵泡成熟和排卵過程。卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)基質(zhì)的形成、擴(kuò)張和粘液化是排卵、受精的關(guān)鍵，雙向調(diào)節(jié)蛋白的差異表達(dá)使得COC基質(zhì)的擴(kuò)張出現(xiàn)缺陷；還有部分蛋白質(zhì)與血管生成及纖溶系統(tǒng)相關(guān)。另外還從卵泡液中鑒定出了一些新的蛋白質(zhì)，包括超盆地蛋白(suprabasin)、S100鈣結(jié)合蛋白A7(S100-A7)、鋅指2螺旋酶、轉(zhuǎn)錄輔助激活劑，但這些蛋白質(zhì)在卵巢中的功能還尚未明確。

Li等[19]使用串聯(lián)質(zhì)譜(TMT)標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)識(shí)別PCOS患者卵泡液外泌體中的蛋白質(zhì)組特征，鑒定出86種差異蛋白，其中S100-A9蛋白通過激活核因子kappa B(NF-κB)信號(hào)途徑顯著增強(qiáng)炎癥反應(yīng)并影響類固醇生成。Domingues等[20]使用液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(LCMS-IT-TOF)分析PCOS患者的卵泡液蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)胎球蛋白A和維生素D配體蛋白只在PCOS組中表達(dá)，補(bǔ)體C3在PCOS組中過度表達(dá)。Patil等[21]利用LC-MS/MS鑒定出PCOS患者卵泡液中10種差異表達(dá)的糖蛋白，其中蛋白酶抑制劑SERPINA1和ITIH4上調(diào)、下調(diào)尤為明顯，SERPINA1能夠抑制組織重塑和促血管生成的蛋白酶，ITIH4可以維持細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的穩(wěn)定。Zhang等[1]使用LC-MS/MS的定量技術(shù)對(duì)肥胖、超重的PCOS患者和正常體重的PCOS患者進(jìn)行卵泡液蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)炎癥、免疫、代謝相關(guān)的生物過程在PCOS的兩個(gè)亞群中都有富集，且肥胖會(huì)加劇卵泡微環(huán)境的異常。

在Ambekar等[18]和Patil等[21]的研究中均提到關(guān)于卵泡血管生成蛋白質(zhì)的改變，血管生成改變可能導(dǎo)致卵泡發(fā)育停止、卵母細(xì)胞生長(zhǎng)受損以及PCOS患者常見的黃體形成缺陷；而且均發(fā)現(xiàn)與ECM相關(guān)，這些蛋白可能導(dǎo)致ECM不穩(wěn)定，影響COC的擴(kuò)增，繼而導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量和受精能力下降。Li等[19]和Zhang等[1]研究發(fā)現(xiàn)差異蛋白與炎癥反應(yīng)相關(guān)，這些蛋白能觸發(fā)炎癥相關(guān)的信號(hào)通路，在諸多細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。上述觀點(diǎn)提示在卵泡液的研究中差異蛋白多與血管生成、COC基質(zhì)的擴(kuò)增、ECM的穩(wěn)定以及炎癥反應(yīng)等相關(guān)，而這些過程與卵泡發(fā)育密切相關(guān)。

2.子宮內(nèi)膜、卵巢、血液中差異蛋白的篩選：有研究使用電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜方法，發(fā)現(xiàn)PCOS患者子宮內(nèi)膜上差異表達(dá)蛋白與細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥以及細(xì)胞骨架、凝血功能相關(guān)，參與細(xì)胞重塑的幾種蛋白如微管調(diào)節(jié)因子(Stathmin)、蛋白二硫化物異構(gòu)酶(PDI)、酶調(diào)節(jié)劑(SERPINA1)、甲狀腺素運(yùn)載蛋白(Transthyretin)、熱休克蛋白、載脂蛋白A1和膜聯(lián)蛋白A4在PCOS中的代謝功能均發(fā)生顯著改變，從而影響子宮內(nèi)膜的容受性，降低妊娠率[22]。差異凝膠電泳(DIGE)和質(zhì)譜技術(shù)分析顯示了PCOS患者卵巢中膜相關(guān)孕激素受體組分1(PGRMC1)、視黃醇結(jié)合蛋白1(RBP1)、熱休克蛋白90B1、鈣調(diào)蛋白1、膜聯(lián)蛋白A6和原肌球蛋白2的差異表達(dá)；這些差異蛋白與胰島素抵抗、類固醇的生成、纖溶、凝血以及細(xì)胞凋亡等有關(guān)[23]。其中PGRMC1可激活細(xì)胞色素P450，在類固醇合成中起重要作用；熱休克蛋白90B1與多種細(xì)胞內(nèi)受體和轉(zhuǎn)錄因子相互作用，在PCOS發(fā)病機(jī)制中可能具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。最近Rashid等[24]利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)生、DNA修復(fù)、蛻膜細(xì)胞倍性、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和降解過程的蛋白質(zhì)在PCOS患者的血清蛋白質(zhì)譜中差異表達(dá)。

3.診療策略：通過對(duì)PCOS患者卵泡液、卵巢、子宮內(nèi)膜和血清蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)在這些生物液和組織中有相似的差異蛋白和發(fā)病機(jī)制，主要涉及類固醇的生成、COC基質(zhì)的擴(kuò)增、ECM的穩(wěn)定、血管生成、細(xì)胞凋亡、炎癥及凝血等。陳莉等[25]在綜述中也發(fā)現(xiàn)PCOS患者不同組織的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果存在不同，但仍存在一定的聯(lián)系。相較于之前對(duì)PCOS的研究中更多集中在炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)使PCOS的治療得到更多方面和維度的思考。

PCOS是一種非特異性的慢性炎癥性疾病，被認(rèn)為是卵巢功能障礙的原因之一[26]。TNF是由巨噬細(xì)胞分泌的一種小分子蛋白，有炎癥介質(zhì)的作用，屬于炎癥因子的一種。之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃酮類芹菜素可以顯著降低TNF-α、白介素-6和總氧化狀態(tài)[27]。Wu等[28]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白與TNF、白介素-6、C反應(yīng)蛋白呈現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，熱休克蛋白可以作為PCOS炎癥指標(biāo)檢測(cè)的一項(xiàng)。Alivandi等[29]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮苷可以改善PCOS的炎癥及氧化狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)糖基化終產(chǎn)物可溶性受體(sRAGE)對(duì)PCOS產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)具有一定的保護(hù)作用，認(rèn)為sRAGE具有一定的抗炎效果[30]。有文獻(xiàn)報(bào)道維生素D可以拮抗晚期糖基化產(chǎn)物(AGEs)，認(rèn)為PCOS尤其伴有糖代謝異常的患者在治療上可以選擇應(yīng)用維生素D[31]。還有研究發(fā)現(xiàn)AGEs是一種促炎分子，可與細(xì)胞表面受體相互作用，介導(dǎo)促炎通路和氧化應(yīng)激的觸發(fā)[32]。

卵泡中褪黑色素是在卵泡發(fā)育后期從顆粒細(xì)胞中釋放出來的，在卵母細(xì)胞成熟過程中起積極作用[33]。褪黑色素的主要作用包括抗氧化和清除自由基[34]。有研究證實(shí)在臨床試驗(yàn)中使用褪黑色素可明顯改善PCOS患者未成熟卵泡的質(zhì)量，顯著提高IVF-ET的妊娠率[35]。2009年的一篇綜述詳述了褪黑色素可能成為改善卵巢功能和卵母細(xì)胞質(zhì)量的藥物[36]。之后有文獻(xiàn)論述了褪黑色素可能通過改善卵泡代謝提高卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量[37]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)氯化血紅素和L-精氨酸能改善多囊卵巢(PCO)大鼠的氧化狀態(tài)、炎癥反應(yīng)、激素失衡和代謝紊亂等，提示氯化血紅素和L-精氨酸對(duì)PCOS均有保護(hù)作用[38]。有學(xué)者認(rèn)為酪蛋白激酶2α可能是PCOS一個(gè)有前途的臨床治療靶點(diǎn)[39]。最新的動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)microRNA-135a可能通過血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C信號(hào)途徑促進(jìn)PCOS中顆粒細(xì)胞的凋亡和DNA損傷反應(yīng)，提示microRNA-135a是PCOS的一個(gè)治療靶點(diǎn)[40]。

目前對(duì)于PCOS的治療沒有特效藥，臨床醫(yī)生的主要目標(biāo)是解決PCOS患者的生育要求，保證月經(jīng)定期來潮和避免并發(fā)癥的發(fā)生，比如克羅米芬、醋酸環(huán)丙孕酮炔雌醇片、二甲雙胍等藥物的應(yīng)用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用抗炎、抗氧化、改善信號(hào)途徑等的藥物可以對(duì)PCOS產(chǎn)生一定效果。近年來，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一些新的差異蛋白，并對(duì)這些蛋白參與PCOS疾病的發(fā)生發(fā)展做出了一些假設(shè)并得到驗(yàn)證；但關(guān)于卵泡液的蛋白質(zhì)組學(xué)研究尚處于起步階段，一些新的治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，將對(duì)未來藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)，但具體的治療途徑等還需進(jìn)一步的研究探討。

三、結(jié)語

PCOS是一種常見的生殖內(nèi)分泌代謝性疾病。近年來隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，尤其是差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的提高，科研人員利用該技術(shù)對(duì)PCOS的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究，通過對(duì)卵泡液的研究，篩選出了新的差異蛋白，這些差異蛋白揭示了PCOS發(fā)病的相關(guān)機(jī)制。PCOS患者卵泡液蛋白質(zhì)組學(xué)的改變多與類固醇的生成、COC基質(zhì)的擴(kuò)增、ECM的穩(wěn)定、血管生成、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及凝血功能等有關(guān)。對(duì)卵巢、子宮內(nèi)膜及血清的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)PCOS還與氧化反應(yīng)有密切聯(lián)系。關(guān)于PCOS炎癥反應(yīng)的治療有較多研究，且已經(jīng)有了一些具體的治療措施，如使用黃酮類芹菜素、熱休克蛋白、大豆異黃酮苷、糖基化終產(chǎn)物可溶性受體以及褪黑色素等。關(guān)于PCOS治療不能忽視的一點(diǎn)是生活方式的調(diào)節(jié)?，F(xiàn)階段利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)卵泡液的研究尚處于起步階段，篩選出的差異蛋白并不能完全掌握其在疾病中的具體發(fā)病機(jī)制，需要更加深入的研究，找到疾病有效且安全的治療靶點(diǎn)，以期促進(jìn)新藥物研發(fā)，給PCOS患者提供有效、便捷、經(jīng)濟(jì)的治療手段。