不同產(chǎn)地廣藿香的揮發(fā)油主成分分析及其遺傳多態(tài)性的RAPD分析

高 靜，趙智龍，唐莎莎，宮海燕*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆塔城市人民醫(yī)院藥劑科，新疆 塔城 834700；3.達(dá)州中醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，四川 達(dá)州 635000)

廣藿香(Pogostemoncablin(Blanco) Benth.)是唇形科刺蕊草屬植物，作為重要的藥材和香料，具有芳香化濕、和胃止嘔、祛暑解表的功效，成方制劑有藿香正氣水、霍膽丸等[1]。藿香正氣水作為《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》中醫(yī)治療中推薦的中成藥，其主藥藿香[2-3]多指廣藿香，產(chǎn)于廣東、海南、臺(tái)灣等。現(xiàn)代藥效學(xué)研究表明，揮發(fā)油是廣藿香的主要活性成分，具有抑菌[4-5]、抗真菌[6]、抗氧化[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]等作用，廣藿香醇是廣藿香揮發(fā)油的質(zhì)量控制指標(biāo)[9]。不同產(chǎn)地的廣藿香揮發(fā)油的成分存在一定差異，如何進(jìn)行質(zhì)量控制和客觀評(píng)價(jià)值得關(guān)注。

為有效控制廣藿香揮發(fā)油的品質(zhì)和明確地域特征，作者采用GC-MS方法對(duì)不同產(chǎn)地廣藿香揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行定性和定量分析，運(yùn)用SIMCA+P統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)，采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地廣藿香的多態(tài)性和品種親緣關(guān)系進(jìn)行分析，探究不同產(chǎn)地廣藿香揮發(fā)油含量和種質(zhì)資源的分子學(xué)差異。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

廣藿香，2017年7月分別采自云南曲靖縣、廣東化州市，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中藥鑒定教研室徐海燕副教授鑒定均為唇形科刺蕊草屬植物廣藿香(Pogostemoncablin(Blanco) Benth.)的干燥地上部分。

C7～C40正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品(CDGG-110219-06)，美國(guó)o2si公司；無水硫酸鈉(分析純)，天津永晟精細(xì)化工有限公司；正己烷(優(yōu)級(jí)純)，天津大茂化學(xué)試劑廠。

Agilent 7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；索氏提取器；FA2004N型電子天平，常州幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；KDM型可調(diào)控溫電熱套，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司。

1.2 廣藿香揮發(fā)油的提取

將干燥的廣藿香全草粉碎，過60目篩；稱取廣藿香粉末約50 g，置于1 000 mL燒瓶中，加500 mL水和數(shù)粒玻璃珠，振搖混合；采用水蒸氣蒸餾法提取，直至觀察揮發(fā)油的含量不再增加為止；停止加熱，靜置冷卻，收集揮發(fā)油，無水硫酸鈉干燥，稱重，計(jì)算揮發(fā)油提取率，密封保存于4 ℃冰箱中，備用。

1.3 廣藿香揮發(fā)油的化學(xué)成分分析

采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)，通過保留時(shí)間和對(duì)應(yīng)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物(C8～C17)的比對(duì)，對(duì)揮發(fā)油的化學(xué)成分和色譜峰進(jìn)行鑒定。在國(guó)際統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)條件下，采用NIST 14.L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜譜庫(kù)，對(duì)每個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜進(jìn)行檢索得到其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

色譜條件：色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為高純氦氣，起始柱溫50 ℃，以5 ℃·min-1的速率升溫至300 ℃并保持20 min，進(jìn)樣量1 μL，分流比50∶1。

質(zhì)譜條件：使用EI電離源，電離能量70 eV，離子源發(fā)生器溫度230 ℃，進(jìn)樣口溫度300 ℃，輔助加熱器溫度280 ℃，掃描范圍40～800 amu，溶劑延遲3 min。

1.3.1 定性分析

通過比較各物質(zhì)的質(zhì)譜與NIST 14.L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜譜庫(kù)中相應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)譜的相似度匹配程度，結(jié)合正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜程序升溫保留指數(shù)(programmed temperature retention index,PTRI)，計(jì)算廣藿香揮發(fā)油中各成分的保留指數(shù)(retention index,RI)，對(duì)揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。

1.3.2 定量分析

采用峰面積歸一化法，計(jì)算廣藿香揮發(fā)油中各化學(xué)成分的相對(duì)含量(%)，對(duì)揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行定量分析。

1.4 廣藿香的RAPD分析

1.4.1 引物的篩選

基于相關(guān)文獻(xiàn)[10-13]，隨機(jī)選擇25個(gè)穩(wěn)定性好、條帶清晰的引物進(jìn)行RAPD分析，分別是：S224、OPB11、OD603、S43、S208、S351、OPD08、OPD10、OPD07、S358、S359、S443、OPG19、S227、OPD13、OPB04、OPD70、OPD19、S42、OPA04、S202、OPD02、OPD18、OPD10、OPA07。

1.4.2 DNA的提取

取廣藿香干重組織約60 mg，加入液氮充分研磨成粉末，迅速置于裝有700 μL 65 ℃預(yù)熱緩沖液GP1的離心管中(實(shí)驗(yàn)前在預(yù)熱的GP1中加入疏基乙醇，使其終濃度為0.1%)，迅速顛倒混勻后于65 ℃水浴20 min，期間顛倒離心管數(shù)次以充分混合。加入700 μL氯仿，充分混勻，于12 000 r·min-1(約13 400×g，下同)離心5 min。小心地將上層水相轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管中，加入700 μL緩沖液GP2，充分混勻，轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，于12 000 r·min-1離心30 s，棄掉廢液。向吸附柱CB3中加入500 μL緩沖液GD(使用前先檢查是否已加入無水乙醇)，于12 000 r·min-1離心30 s，棄掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW(使用前先檢查是否已加入無水乙醇)，于12 000 r·min-1離心30 s，棄掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。重復(fù)上一步操作，將吸附柱CB3放回收集管中，于12 000 r·min-1離心2 min，棄掉廢液。將吸附柱CB3于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加70 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，于12 000 r·min-1離心2 min，將溶液收集到離心管中，即得廣藿香DNA。

1.4.3 DNA純度檢測(cè)

通過微量核酸測(cè)定儀測(cè)定不同產(chǎn)地廣藿香的DNA純度，結(jié)果見表1。

1.4.4 PCR反應(yīng)

1.4.4.1 PCR體系的配制

反應(yīng)體系：2×Taq PCR Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，引物1 μL，廣藿香DNA 2 μL。

反應(yīng)條件：88 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，38 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫10 min。

表1 不同產(chǎn)地廣藿香的DNA純度

1.4.4.2 瓊脂糖凝膠的配制

稱取0.6 g瓊脂糖，溶于40 mL 1×1TBE電泳緩沖液中，微波加熱2 min，邊加熱邊混勻直至透明，室溫靜置10 min，加入2 μL核酸染料，倒膠，待其在室溫下凝固，即得。

1.4.4.3 電泳點(diǎn)樣

取擴(kuò)增后的產(chǎn)物6 μL點(diǎn)于凝膠電泳孔中，在78 V、65 mA條件下電泳60 min，電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀下觀察，拍照。

1.4.4.4 數(shù)據(jù)處理

利用RAPD技術(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。凝膠電泳圖譜中的條帶代表一個(gè)分子標(biāo)記，代表一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)；遷移率相同的條帶作為同源條帶，有帶(顯性)記為1，無帶(隱性)記為0，強(qiáng)帶和弱帶都記為1；多態(tài)位點(diǎn)僅對(duì)在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中能穩(wěn)定出現(xiàn)的差異帶進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 廣藿香揮發(fā)油的化學(xué)成分分析

采用GC-MS方法，得到不同產(chǎn)地(云南、廣東)廣藿香的揮發(fā)油總離子流圖，如圖1所示。

圖1 不同產(chǎn)地(云南、廣東)廣藿香的揮發(fā)油總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile oil of Pogostemon cablin from different habitats(Yunnan,Guangdong)

由圖1可以看出，云南廣藿香和廣東廣藿香的揮發(fā)油成分均得到很好的分離，分離時(shí)間適中，峰形良好。

利用NIST 14.L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜譜庫(kù)結(jié)合保留指數(shù)法、峰面積歸一化法對(duì)分離的揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行鑒別歸屬并測(cè)定其相對(duì)含量，結(jié)果見表2。

表2

不同產(chǎn)地廣藿香揮發(fā)油的化學(xué)成分及其相對(duì)含量

Tab.2 Chemical constituents of volatile oil of Pogostemon cablin from different habitats and their relative contents

由表2可知，從云南廣藿香揮發(fā)油中分析鑒定出了48種化學(xué)成分，占總揮發(fā)油的99.93%；從廣東廣藿香揮發(fā)油中分析鑒定出了33種化學(xué)成分，占總揮發(fā)油的99.96%。云南廣藿香揮發(fā)油中相對(duì)含量在5%以上的化學(xué)成分依次是：百秋李醇(28.53%)、蒼術(shù)素(11.34%)、反式石竹烯(9.81%)、(+)-喇叭烯(8.81%)、α-杜松醇(7.78%)、甲基丁香酚(6.00%)、白菖烯(5.77%)，其主要成分是百秋李醇、蒼術(shù)素、反式石竹烯；根據(jù)化合物分類，云南廣藿香揮發(fā)油化學(xué)成分中單萜0.08%、倍半萜88.17%、含氧倍半萜2.94%、芳香族7.53%、其它1.21%，主要是倍半萜和芳香族類化合物。廣東廣藿香揮發(fā)油中相對(duì)含量在5%以上的化學(xué)成分依次是：百秋李醇(42.28%)、蒼術(shù)素(10.59%)、反式石竹烯(8.08%)、(+)-喇叭烯(6.92%)、石竹素(6.07%)，其主要成分是百秋李醇、蒼術(shù)素、反式石竹烯；根據(jù)化合物分類，廣東廣藿香揮發(fā)油化學(xué)成分中單萜0.11%、倍半萜85.27%、含氧倍半萜10.20%、芳香族4.35%、其它0.03%，主要是倍半萜和含氧倍半萜類化合物。云南和廣東的廣藿香揮發(fā)油有30個(gè)共同成分，其主要成分均為百秋李醇、蒼術(shù)素、反式石竹烯。

百秋李醇具有鈣離子拮抗、促進(jìn)腸胃吸收和抗菌等藥理作用。《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)中廣藿香揮發(fā)油以百秋李醇作為質(zhì)量控制指標(biāo)，含量不得低于26%[9]，據(jù)此可判定，云南和廣東的廣藿香揮發(fā)油均達(dá)到質(zhì)量要求，但兩者的百秋李醇含量差異較明顯，云南廣藿香揮發(fā)油中百秋李醇含量為28.53%，廣東的為42.28%，相差13.75%。以百秋李醇含量為評(píng)估指標(biāo)，廣東廣藿香揮發(fā)油要優(yōu)于云南廣藿香揮發(fā)油。

本研究結(jié)果與其它研究結(jié)果存在差異：熊耀坤等[14]報(bào)道，廣藿香揮發(fā)油中百秋李醇(廣藿香醇)含量為19.43%，廣藿香酮含量為37.79%；蒲秀峰等[15]報(bào)道，廣藿香揮發(fā)油中百秋李醇最高含量為60.36%。

2.2 廣藿香揮發(fā)油的主成分分析

運(yùn)用SIMCA+P統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)云南和廣東的廣藿香揮發(fā)油的化學(xué)成分相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，得到不同產(chǎn)地廣藿香揮發(fā)油主成分分析載荷圖及得分圖，如圖2所示。

圖2 不同產(chǎn)地廣藿香揮發(fā)油主成分分析載荷圖(a)及得分圖(b)Fig.2 Load diagram(a) and score chart(b) of principal component analysis of volatile oil of Pogostemon cablin from different habitats

載荷圖顯示了不同產(chǎn)地廣藿香揮發(fā)油的化學(xué)成分在X軸方向和Y軸方向上的差別。由圖2a可以看出，云南廣藿香揮發(fā)油化學(xué)成分分布于2、3象限內(nèi)，廣東廣藿香揮發(fā)油化學(xué)成分分布于1、4象限內(nèi)，且未交叉重疊。說明云南和廣東的廣藿香揮發(fā)油的化學(xué)成分確實(shí)有明顯的差異。

得分圖顯示了不同產(chǎn)地廣藿香揮發(fā)油的化學(xué)成分在各象限的分布情況。由圖2b可以看出，兩個(gè)產(chǎn)地廣藿香揮發(fā)油化學(xué)成分具有差異性：18種成分在廣東廣藿香揮發(fā)油中含量較高，即在得分圖中1、4象限的是廣東廣藿香揮發(fā)油的差異性成分，而2、3象限屬于云南廣藿香揮發(fā)油的差異性成分。同時(shí)，主成分分析得到第一主成分占65.5%，第二主成分占17.4%，累計(jì)貢獻(xiàn)值為82.9%，可說明大部分的成分?jǐn)?shù)據(jù)。

2.3 廣藿香的RAPD分析

基于前期研究，對(duì)25個(gè)隨機(jī)引物進(jìn)行篩選。分別以25個(gè)隨機(jī)引物對(duì)不同產(chǎn)地廣藿香基因組進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25個(gè)隨機(jī)引物均能擴(kuò)增出條帶，一共得到286條條帶：云南廣藿香擴(kuò)增得到134條條帶，廣東廣藿香擴(kuò)增得到152條條帶。擴(kuò)增條帶數(shù)最少的引物是S208、OPD07、OPD13、OPD19、OPD70，分別為3條；擴(kuò)增條帶數(shù)最多的引物是OPD19，為10條。每個(gè)引物能擴(kuò)增的多態(tài)性DNA片段為3～10條，平均可擴(kuò)增5.72條。

從25個(gè)隨機(jī)引物中篩選出能夠反映不同產(chǎn)地(云南、廣東)廣藿香多態(tài)性差異的特異性引物共6個(gè)，分別是：OPB11、S227、OPD13、OPD70、OPD19、OPA07，其RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜如圖3所示。

M:marker 1.云南廣藿香 2.廣東廣藿香

2.4 討論

采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)，測(cè)定不同產(chǎn)地廣藿香揮發(fā)油的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)云南和廣東的廣藿香揮發(fā)油中的百秋李醇含量差異較明顯，云南廣藿香揮發(fā)油中百秋李醇含量為28.53%，廣東的為42.28%，相差13.75%。

云南和廣東廣藿香的品種親緣關(guān)系較近，獲得了6個(gè)特異性RAPD引物：OPB11、S227、OPD13、OPD70、OPD19、OPA07，為廣藿香提供了分子學(xué)鑒定的依據(jù)。RAPD技術(shù)是評(píng)估不同產(chǎn)地廣藿香遺傳多樣性的一個(gè)可靠有效的方法。根據(jù)RAPD分子標(biāo)記多態(tài)性，可以估測(cè)不同產(chǎn)地廣藿香品種之間的遺傳關(guān)系。RAPD擴(kuò)增快速、簡(jiǎn)易、靈敏，而且具有多態(tài)性，技術(shù)成熟，經(jīng)濟(jì)可行，可以快速進(jìn)行分子學(xué)鑒定，為現(xiàn)有廣藿香的優(yōu)良種質(zhì)資源研究奠定基礎(chǔ)，有利于廣藿香資源的鑒別和合理開發(fā)應(yīng)用。

關(guān)于化學(xué)成分、分子學(xué)遺傳的差異所引起的藥效不同有待于進(jìn)一步研究，也可考慮根據(jù)不同產(chǎn)地廣藿香揮發(fā)油的主要成分及其對(duì)應(yīng)的藥理作用，進(jìn)行廣藿香的開發(fā)應(yīng)用，促進(jìn)中藥資源的可持續(xù)發(fā)展，提高治療效果。

3 結(jié)論

采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)，比較了不同產(chǎn)地廣藿香揮發(fā)油的化學(xué)成分。結(jié)果表明，云南和廣東的廣藿香揮發(fā)油化學(xué)成分相近，有30個(gè)共同成分；其主要成分基本一致，均為百秋李醇、蒼術(shù)素、反式石竹烯；但百秋李醇的含量差異較明顯，云南廣藿香揮發(fā)油中為28.53%，廣東廣藿香揮發(fā)油中為42.28%，相差13.75%；以百秋李醇含量為評(píng)估指標(biāo)，廣東廣藿香揮發(fā)油要優(yōu)于云南廣藿香揮發(fā)油。通過主成分分析，進(jìn)一步證實(shí)了云南廣藿香和廣東廣藿香揮發(fā)油化學(xué)成分的差異性。采用RAPD分析篩選出了能夠反映不同產(chǎn)地廣藿香多態(tài)性差異的特異性引物共6個(gè)，分別是：OPB11、S227、OPD13、OPD70、OPD19、OPA07，為遺傳相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)，為廣藿香的可持續(xù)開發(fā)提供了應(yīng)用基礎(chǔ)。