宮頸液基細胞塊制備法的對比研究

張雪梅，黃靈泉

廣西醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院病理科，廣西 柳州 545005

宮頸液基細胞學檢查是目前宮頸病變篩查最常用的方法[1]，其中未能明確意義的非典型鱗狀細胞(ASC-US)是最常見的細胞學診斷，也是宮頸細胞學診斷的難點[2-3]。細胞包埋術(shù)的出現(xiàn)大大緩解了細胞學診斷的壓力，提高了細胞病理診斷的準確性[4]。尤其是胸腹水細胞蠟塊的制作，為胸腹水細胞病理診斷及后續(xù)相關(guān)免疫組織化學及分子病理檢測提供了機會，并且制作技術(shù)成熟，已廣泛用于臨床病理診斷。目前對于宮頸細胞蠟塊的制作報道較少，不同方法制片質(zhì)量存在一定差異。本實驗擬通過對不同的宮頸細胞蠟塊制作方法進行對比研究，探討不同方法對制片質(zhì)量的影響，以探索宮頸細胞蠟塊制作較為理想的方法，為宮頸細胞病理診斷提供幫助。

1 資料與方法

1.1 病例資料 收集廣西醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院病理科2017年10月至2018年6月經(jīng)宮頸液基細胞學檢測的剩余標本45例，其中細胞學診斷陽性、陰性、可疑陽性各15 例。每種方法均選取陽性、陰性、可疑陽性標本各5例。

1.2 主要試劑 95%酒精、瓊脂、細胞蠟塊制備試劑盒(安必平)。

1.3 實驗方法

1.3.1 方法1 采用直接取細胞沉渣法。將宮頸液基細胞保存瓶中的剩余標本倒入離心管內(nèi)，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，往離心管內(nèi)加入8 mL 95%酒精，2 000 r/min離心10 min，靜置4 h后倒去酒精，沉渣聚集成團，將沉渣物取出直接放至包埋紙內(nèi)包好，按常規(guī)石蠟包埋制備蠟塊。

1.3.2 方法2 采用瓊脂包裹法。(1)將宮頸液基細胞保存瓶中的剩余標本倒入離心管內(nèi)，2 500 r/min離心5 min，用吸管吸去大部分液體，保留高于沉渣1～2 cm的液體；(2)用10 mL吸管吸取60℃3%瓊脂一滴，滴于胃鏡小標本包埋盒的小槽內(nèi)，使其鋪滿包埋盒底部，并放至冰箱冷凍2 min 使瓊脂凝固成形；(3)用吸管反復(fù)抽吸將離心管內(nèi)的沉渣與液體混勻，置于鋪滿瓊脂的包埋盒槽內(nèi)，放置恒溫箱至細胞沉渣平面由凸面轉(zhuǎn)變?yōu)榘济妫?4)在包埋盒內(nèi)再次加入瓊脂，直至覆蓋沉渣表面，將包埋盒置于冰箱冷凍5 min；(5)取出包埋盒內(nèi)的瓊脂以及細胞沉淀物，用包埋紙包好，按常規(guī)石蠟包埋制備蠟塊。

1.3.3 方法3 采用試劑盒制備法。(1)將宮頸液基細胞保存瓶中的剩余標本倒入離心管內(nèi)，800 r/min離心5 min，去上清液；(2)滴入1～3滴細胞蠟塊制備試劑盒試劑A，震蕩，使細胞與試劑A充分混合，800 r/min離心2 min，棄去多余上清液；(3)滴入2～3滴試劑B，靜置30 s，輕輕搖晃試管，使細胞團與離心管底部分離，用軟吸管將細胞團吸起，轉(zhuǎn)移到包埋紙上，輕壓細胞團，使細胞團變得扁平，包埋紙包好后后放入包埋盒中，按常規(guī)石蠟包埋制備蠟塊。三種細胞蠟塊制備完成后均進行常規(guī)切片，HE染色，由兩位高年資病理診斷醫(yī)師共同閱片。

2 結(jié)果

2.1 細胞蠟塊及切片制作效果

2.1.1 肉眼觀察 將宮頸液基細胞學檢測后的剩余標本離心，使細胞沉渣沉積于離心管底部，沉渣量基本相同(圖1A)。利用上述三種方法分別收集細胞沉渣，其中方法1取得的細胞沉渣量相對較少，部分呈渾濁半固體狀，較分散，離心管底部仍有少量細胞沉渣不易取出；方法2取得的細胞沉渣基本都平鋪于瓊脂中央，較集中；方法3取得的細胞沉渣呈白色塊狀，聚集較緊密(圖1B)。三種方法收集的細胞沉渣經(jīng)脫水包埋切片染色，其中方法1所得HE切片肉眼觀細胞沉渣較集中，細胞量相對較少；方法2所得細胞沉渣在切片上較均勻地平鋪分布，切面較大，可觀察的細胞較多；方法3 所得HE 切片細胞沉渣較集中，細胞量相對較多(圖1C)。

2.1.2 顯微鏡下觀察 方法1制備的細胞蠟塊切片染色后細胞較集中，呈片狀聚集或堆疊，細胞之間不易分散，有時會影響觀察；方法2制備的細胞蠟塊切片染色后細胞均勻平鋪，可觀察面較大，仍有部分細胞間分散不徹底，呈片狀，細胞之間可見少量淡藍色瓊脂無定型物；方法3 制備的細胞蠟塊切片染色后細胞較集中，細胞之間易分散，較均勻平鋪，背景干凈(圖2)。

圖1 細胞蠟塊及切片肉眼觀察

圖2 三種細胞蠟塊制備法HE切片顯微鏡下形態(tài)

2.2 操作過程及時間 方法1操作步驟簡單，實驗過程需要4～5 h；方法2 操作步驟較繁瑣，且需要提前配置3%瓊脂，操作時長約0.5 h；方法3 操作簡單，用時約10余min。

3 討論

宮頸液基細胞學是目前宮頸病變篩查最主要的檢測方法，陽性或可疑陽性的病例會分流至宮頸活檢以及后續(xù)的免疫組化檢查。然而，宮頸活檢取材局限，對于病變較少的病例容易造成漏診。細胞蠟塊制備技術(shù)是對薄層液基細胞學有力的補充，將宮頸液基細胞學檢測剩余的標本經(jīng)離心固定，制作成細胞蠟塊，可以連續(xù)切片并永久保存，彌補了細胞學標本利用不充分以及活檢取材局限的缺點[5]。較多學者對細胞蠟塊聯(lián)合免疫組化檢測及分子病理檢查進行了研究，提示聯(lián)合檢查可以提高宮頸細胞學診斷的準確率[6-9]。

然而，宮頸液基細胞學檢查因其刷取的特點，相對其他脫落細胞標本細胞數(shù)量較少，因此對于有限的標本量，提高其利用率是宮頸細胞蠟塊制備的關(guān)鍵。本研究采取三種不同方法對細胞沉渣進行收集，擬探討一種較好的宮頸細胞蠟塊制備方法，將其便捷有效地用于宮頸細胞學的診斷中。

直接取細胞沉渣法是較為簡單的一種方法，主要步驟為離心和固定，其中固定對于細胞沉渣的轉(zhuǎn)移及取出尤為重要。實驗結(jié)果顯示固定時間過短，則細胞不易聚集，呈渾濁半固態(tài)，仍有部分細胞沉渣貼附于試管壁，不易取出，這樣制成的細胞蠟塊，往往細胞量較少，沉渣利用不充分，與文獻報道的結(jié)論一致[10]。結(jié)果提示，95%酒精固定4 h 能夠較好地使細胞聚集成形，便于轉(zhuǎn)移細胞沉渣以及后續(xù)的細胞塊包埋。其優(yōu)點：方法簡單易行，成本較低；其缺點：制備時間最長，整體流程大于4 h；靜置4 h后細胞雖能聚集呈團，但因沉渣位于離心管底部，在吸取沉渣時常導致沉渣碎落，吸管及離心管附著較多細胞，脫水后包埋紙中仍貼附有部分細胞，導致標本的收集效果不理想，標本利用率降低。制片后細胞之間不易分散，容易成片聚集，細胞堆疊嚴重，影響觀察。

瓊脂包裹法是文獻報道中使用較多的方法，該方法采用小號胃鏡標本包埋框進行細胞收集，這樣易使細胞集中，在包埋框底部加一層瓊脂，使細胞沉渣得到一定的支撐和依托，細胞與瓊脂融合后再次加入瓊脂，以瓊脂為依托，包裹細胞沉渣便于沉渣的取出。本研究發(fā)現(xiàn)，采用文獻報道[11]中的溫箱凝固瓊脂法，細胞沉渣容易受固定液揮發(fā)時間及瓊脂凝固時間的影響而沉積于瓊脂中深淺不一，致使細胞在切片時難以處于同一平面；同時實驗時間較長。本研究在顧維娜等研究的基礎(chǔ)上，采用冰箱冷凍法對瓊脂進行凝固，相比較文獻中置入溫箱凝固瓊脂的方法，冰箱冷凍凝固能夠使瓊脂快速成型，使細胞沉渣平鋪于同一層面，同時縮短了瓊脂凝固時間。瓊脂包裹法的優(yōu)點：瓊脂作為細胞沉渣的支撐物并將細胞包裹于內(nèi)，使得細胞得到較大程度的利用，制片后細胞均勻平鋪，可觀察面大；缺點：鏡下背景中可見淡藍色瓊脂無定型物存在，有時影響觀察，該方法制備時間較長，從離心管中吸取細胞時也有部分細胞殘留于吸管內(nèi)，同時，每次操作均需溶解瓊脂，配置的3%瓊脂亦不能長期保存，操作步驟繁瑣。

試劑盒制備法采用試劑盒AB 試劑，其中試劑A是一種特殊的分散體系，在試劑B的催化作用下其中的膠體顆粒會相互連接，搭成架子，形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使液體和細胞充滿在結(jié)構(gòu)空隙中，將細胞緊密地網(wǎng)在其中，讓細胞成團且不破壞結(jié)構(gòu)。該方法在離心試管內(nèi)加入AB液，使細胞形成團塊，避免了轉(zhuǎn)移時離心管及吸管內(nèi)的細胞殘留問題，細胞損失少，且細胞團呈果凍狀，易與管壁分離，從而提高標本利用率。其優(yōu)點：操作簡單，用時最短，收集效果最好，缺點：該試劑價格相對昂貴，標本量大時需要的試劑較多，因此該方法更適用于量少且難收集的標本。

綜上所述，直接取細胞沉渣法操作簡單，成本低，易于推廣，但標本利用率不高，制備時間長；瓊脂包裹法制片效果良好，但操作步驟繁瑣；試劑盒制備法操作簡單，用時短，標本利用率高，但其成本較高。前兩種方法適合基層醫(yī)院推廣，其中瓊脂包裹法更勝一籌。對于經(jīng)濟條件較好的地區(qū)，推薦使用試劑盒制備法，大大節(jié)約時間和人力，制片效果好。