納米鉭對成骨細胞增殖能力及相關基因表達的影響

盧 波， 劉炳昊

（新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院口腔二科，河南 新鄉(xiāng)453000）

良好的口腔種植體對修復缺損、促進種植體-骨組織界面骨細胞長入具有重要作用。種植體材料不僅要耐磨損，有較好的生物相容性[1]，還應有較好的細胞增殖和分化的誘導作用，從而減少細胞凋亡，維持骨形成和吸收的動態(tài)平衡[2]。傳統(tǒng)口腔種植體材料以鈦和鈦合金為主，優(yōu)點是生物相容性好、強度高[3]，缺點是誘導成骨細胞長入時間長，材料彈性模量與骨組織匹配度較差，易導致應力集中性損壞，種植體松動、移位、不愈合等問題，從而影響了種植體的穩(wěn)定性[4]。鉭金屬同樣有較好的生物相容性和理化性質，表面有不同直徑的孔隙，能夠較好地誘導細胞長入，促進骨整合[5]。納米級別的鉭涂層應用于種植體表面可以適應牙齒正常咬合和咀嚼的需要，其應力分散、強度大、穩(wěn)定性好[6]；骨愈合時間短，種植體與骨組織易融合，并發(fā)癥較少，是理想的種植體材料[7]。本研究旨在評價納米鉭種植體顆粒對成骨細胞增殖能力，以及對ALP、BMP-2、OCN基因表達的影響，為口腔種植材料的選擇提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料來源

鉭顆粒（美國Sigma公司）、成骨細胞系MC3T3-E1（美國R&D公司）在含10%胎牛血清（北京中杉金橋生物有限公司）+1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基上接種，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細胞融合達85%時進行消化，傳代培養(yǎng)。

1.2 實驗分組和方法

鉭顆粒經(jīng)鈷60-γ射線輻照消毒、超聲乳化制成1 mg/mL納米鉭母液，經(jīng)透射電鏡和掃描電鏡進行顆粒形態(tài)和粒徑大小的表征。然后將納米鉭母液配制成3種質量濃度的溶液，即10 ng/mL、10μg/mL和100μg/mL。分別將其與成骨細胞系MC3T3-E1共培養(yǎng)。采用CCK8法檢測不同培養(yǎng)時間的細胞增殖 率，PCR法 檢 測 細 胞 分 泌ALP、BMP-2和OCN mRNAs的表達水平。

CCK8法：調 整 細 胞 濃 度 為1×103個/孔，將MC3T3-E1細胞接種于96孔板中，每組設6個復孔，設置空白對照，分別與3種質量濃度的納米鉭溶液共培養(yǎng)6、12、24 h。根據(jù)CCK8試劑說明書，用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值，換算成細胞增殖率（與空白對照組的比值）。

PCR法：設計各目標基因序列。ALP：正向5′-CCAAGTAGTTAGGCTTATTG-3′，反 向5′-TTACCATTCCCATTTCTTCAA-3′，123 bp；BMP-2：正向5′-CAATTCCGTGCTCTTCTTAA-3′，反 向5′-AACCCACTCAAATCTGAAAGTTAA-3′，96 bp；OCN：正向5′-TTCAGGCGCAACCTGTATCTT，反向5′-GGTCTT CCAACTAATCACAGTT-3′，253 bp；GAPDH:正向5′-TGGTTAACAGCCCAATGCC，反向5′-CTAAGTCAT AGTTTGTTTAGCCGAA，63 bp。根據(jù)TRIzol試劑盒提示采用一步法提取細胞總RNA，檢測濃度和純度，經(jīng)反轉錄合成cDNA，為PCR擴增模板。參照Takara Ex Taq試劑盒說明書制備反應液，為TaqⅡ（10μL）+上、下游引物（各0.8μL）+cDNA（2.5μL）+反應水至總體積為20μL。反應條件為95℃30 s預變形，95℃5 s、20℃/s變性，40次循環(huán)擴增，60℃20 s、20℃/s退火，72℃30 s延伸。電泳鑒定產(chǎn)物行半定量分析。

1.3 觀察指標

比較3種質量濃度的細胞在培養(yǎng)6、12、24 h后的細胞增殖率，ALP、BMP-2和OCN mRNAs表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

以SPSS 20.0軟件對不同時間點的計量資料作重復測量的方差分析，兩兩比較采用LSD-t法檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 電鏡表征結果

對納米鉭母液中的顆粒表面進行電鏡表征，結果顯示，納米鉭形狀較規(guī)則，呈圓球形，粒徑為8～15 nm，平均水合粒徑為（286.5±13.6）nm，見圖1。

圖1電鏡表征納米鉭母液中的顆粒表面Figure 1 TEM and SEM images showing particle surface in nano-tantalum mother liquor

2.2 各組不同培養(yǎng)時間的細胞增殖率

組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，3組培養(yǎng)12 h后的細胞增殖率較培養(yǎng)6 h后明顯升高（P＜0.05），培養(yǎng)24 h后較培養(yǎng)12 h后減少（P＜0.05），但仍高于培養(yǎng)6 h后（P＜0.05）；組間比較發(fā)現(xiàn)，10μg/mL組3個時間點的細胞增殖率均明顯高于其他2組（P＜0.05）。詳見表1。

表1各組不同培養(yǎng)時間的細胞增殖率（%）Table 1 Cell proliferation rate of different culture time in each group(%)

2.3 各組不同培養(yǎng)時間ALP、BMP-2和OCN mRNAs表達水平

培養(yǎng)12 h后，3組ALP、BMP-2及OCN mRNAs的表達水平明顯高于6 h（P＜0.001），培養(yǎng)24 h后下降，但仍高培養(yǎng)6 h后（P＜0.001）；組間比較發(fā)現(xiàn)，10μg/mL組 不 同 時 間 點ALP、BMP-2及OCN的mRNAs水平明顯高于其他兩組（P＜0.001）。詳見圖2。

3 討論

3.1 鉭種植體的理化特性研究

種植體材料的機械性能和生物相容性是影響種植效果的主要因素[8-9]。鉭金屬具有很強的耐蝕性能，生物相容性佳，生物組織易在鉭表面生長，并能夠誘導成骨細胞增殖、分化和礦化等行為。成骨細胞是種植體界面較活躍的細胞，對實現(xiàn)骨組織重建發(fā)揮重要作用[10-11]。

目前，關于鉭種植體在臨床中應用的經(jīng)驗較少。美國杰美系統(tǒng)前期研究證實，普通種植體需要3個月才能夠受力，而鉭種植體只需2～4周[12]。應用鉭種植體2周可以負重，種植后2個月可以戴牙，時間大大縮短[13]，具有良好的應用前景。

3.2 納米鉭的基礎研究

實驗研究中多采用化學氣相滲透沉積法和粉末冶金法制備鉭金屬。鉭的彈性模量（1.3～10.0 GPa）與人體正常骨質相近，能夠有效降低應力遮擋，減少種植體松動、移位的風險，促進周圍骨組織生長，減少骨質流失[14]；鉭的孔隙率較高，約為75%～85%，高于鈦金屬網(wǎng)（40%～50%），能夠較好地促進營養(yǎng)物質交換，增加骨細胞長入，促進骨整合效率，提高種植體穩(wěn)定性[15]；鉭涂層摩擦系數(shù)較高，約為40%～75%，提高了種植體的耐用性[16]。

本研究重點分析納米鉭種植體顆粒對成骨細胞的增殖能力，對ALP、BMP-2及OCN基因表達的影響。結果發(fā)現(xiàn)，電鏡表征粒徑約為8～15 nm，平均水合粒徑為（286.5±13.6）nm，證實成功制備納米鉭。部分研究推測，納米材料的大小可能與人體骨組織的形貌和化學特性更加接近，可以直接調控細胞外基質蛋白的組成、構象和細胞行為，影響成骨和破骨細胞的生物學功能[17-18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，3組培養(yǎng)12 h后的細胞增殖率，ALP、BMP-2和OCN mRNAs水平最高，且10μg/mL組的水平明顯高于其他2組，提示納米鉭種植體與成骨細胞接觸后有較好的增殖誘導作用，且與其顆粒大小及濃度有關。納米鉭和微米鉭都有較好的促進成骨細胞增殖的特性，納米鉭有介導細胞自噬的作用[19]，而微米鉭則可能通過其他途徑來完成。鉭涂層種植體比鈦種植體的骨整合能力更強，在促進成骨細胞黏附和聚集，誘導細胞增殖和分化，降低細胞凋亡等微觀生理行為方面表現(xiàn)更突出[20]。長期牙齒應力負荷會增加涂層顆粒的磨損，導致表面鉭顆粒脫離，與界面骨細胞直接接觸，進而影響成骨和破骨細胞的功能活躍程度[21]。

圖2各組不同培養(yǎng)時間ALP、BMP-2及OCN mRNAs的表達水平Figure 2 Expression levels of ALP,BMP-2 and OCN mRNAs in three groups at different culture time

隨著培養(yǎng)時間的延長，各組的細胞增殖能力逐漸增強，ALP、BMP-2和OCN mRNAs表達水平也逐漸升高，提示成骨細胞活性增強。既往研究多探討多孔鉭、鉭薄膜、鉭涂層等對成骨細胞生物學行為的影響，未直接涉及鉭顆粒與細胞接觸的機制[22-23]。細胞培養(yǎng)至12 h時可達增殖峰值和分化峰值，之后逐漸降低，但仍高于6 h，提示細胞與鉭種植體直接接觸需要一定的適應時間。峰值的到達時間可能與細胞間抑制、培養(yǎng)液容量或鉭種植體-骨組織界面負荷受限有關[24]，其中鉭表面孔徑數(shù)量、孔徑大小也可能限制細胞的持續(xù)增殖[25]。納米大小的鉭顆?？赡苤苯佑绊懠毎墓羌軓埩椭亟M能力，黏附于納米鉭表面的細胞成分，尤其是成骨細胞，其內(nèi)部應力經(jīng)整合素傳遞給細胞骨架，觸發(fā)一系列的級聯(lián)反應，可改變多種影響細胞增殖和分化的基因、蛋白的表達，如ALP、BMP-2和OCN[26-27]。此外，鉭直徑的大小，納米鉭溶液的濃度都會對細胞增殖和分化行為產(chǎn)生影響。本研究顯示，10μg/mL組較10 ng/mL、100μg/mL組細胞增殖明顯，可能與納米鉭種植體與細胞的總接觸面積大小有關。10μg/mL的質量濃度可能已達到最大負荷，繼續(xù)增加質量濃度可能會誘導納米鉭材料之間、納米鉭與細胞間，以及細胞之間的相互排斥作用[28]。具體機制有待進一步分析。

本研究以ALP、BMP-2和OCN mRNAs為定量指標反映成骨細胞的增殖能力。ALP的分泌來源主要在骨和肝臟細胞，通常作為衡量成骨細胞早期分化的特異性指標，也是影響骨骼礦化程度的重要活性因子，其表達水平與成骨細胞的增殖和分化能力密切相關[29]。BMP-2屬于轉化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）的家族成員，是影響骨髓間充質干細胞定向分化，調節(jié)成骨細胞增殖活性的重要細胞因子，同時也參與組織器官的形成和發(fā)育[30]。OCN是成骨細胞分化的特異性產(chǎn)物，可維持骨的正常礦化，反映成骨細胞活性和骨轉換水平[31]。

綜上所述，納米鉭種植體對成骨細胞有較好的增殖誘導作用，且呈一定的濃度依賴性。本研究的意義提示了鉭金屬在口腔種植體材料中的應用特性，其機械性能和生物活性較傳統(tǒng)鈦金屬表現(xiàn)更佳；且納米鉭在促進成骨細胞增殖和分化方面可能與鉭金屬孔徑的大小及濃度有關。本研究的不足在于未能深入證實納米鉭對成骨細胞的長入和融合的情況。宏觀上講，納米鉭能促進種植體的穩(wěn)定和骨愈合，下一步可采用動物模型進行進一步驗證。