PCR技術(shù)在麥哲倫企鵝性別鑒定上的應(yīng)用

王玉英 徐翊軒 靳 鵬 王云忠 黃大鵬 李 超

(1.青島水族館，青島，266003；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島，266032)

企鵝，屬于鳥綱(Aves)，是企鵝目(Sphenisciformes)中所有鳥類的通稱，目前已知共有6屬18種。麥哲倫企鵝(Spheniscusmagellanicus)又稱為麥氏環(huán)企鵝，是溫帶企鵝中最大的物種，主要分布在南美洲秘魯、阿根廷、智利等，主要的外形特征是有一條白色的寬帶從眼后過耳朵一直延伸至下頜附近，一般身高約70 cm，體重約4 kg[1]。麥哲倫企鵝屬群居性動物，與非洲企鵝(Spheniscusdemersus)及洪氏環(huán)企鵝(Penguinhumboldt)親緣關(guān)系近。麥哲倫企鵝是一種單態(tài)性鳥類，無論是幼體還是成體都很難從外觀或行為上進行性別鑒定，所以給人工繁殖造成了很大的困難。為了提高本館飼養(yǎng)的麥哲倫企鵝的人工繁殖率，采取一定的措施對其進行性別鑒定是必要的。鳥類的性別由性染色體決定，其CHD基因就位于性染色體上[2]，雄性為ZZ型，雌性為ZW型。傳統(tǒng)的鳥類性別鑒定方法有形態(tài)學(xué)、細胞生物學(xué)以及分子生物學(xué)。分子生物學(xué)是在分子水平上研究生命現(xiàn)象的科學(xué)，PCR擴增技術(shù)是分子生物學(xué)方法之一，是近些年發(fā)展起來的用來鑒定單態(tài)性鳥類性別的一種比較簡單快速的方法。CHD基因在非平胸鳥類中有兩個同源性拷貝，為CHD-W和CHD-Z[3]，CHD基因非常保守，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于非平胸鳥類如雁形目(Anseriformes)、雞形目(Galliformes)、雀形目(Passeriformes)等的性別鑒定中，但在企鵝目中的應(yīng)用較少。

為了進一步研究不同性別麥哲倫企鵝的行為差異性和提高館養(yǎng)麥哲倫企鵝的繁殖率，本研究對青島水族館的編號分別為29、36、1572、1573、1574、1575、1577的麥哲倫企鵝進行了采血，基于CHD基因測序法對這7只麥哲倫企鵝進行了性別鑒定，為麥哲倫企鵝的人工繁殖奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

血液樣本取自青島水族館的7只麥哲倫企鵝，編號分別為29、36、1572、1573、1574、1575、1577號，樣本放置-20 ℃冰箱短時間保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 血液基因組DNA的提取

采用苯酚/氯仿抽提法進行麥哲倫企鵝的血液基因組DNA的提取，操作步驟如下：將凍存的血液于室溫下解凍，轉(zhuǎn)入離心管中，加入1 mL PBS混勻，3 500 rpm離心15 min，棄掉上清液。重復(fù)1次。向白細胞沉淀中加入0.7 mL DNA提取液，37 ℃水浴1 h。加入1 mg/mL蛋白酶K 0.2 mL，至終濃度為100—200 μg/mL，上下轉(zhuǎn)動混勻后50 ℃水浴3 h。反應(yīng)液冷卻至室溫后，加入等體積的飽和酚溶液，溫和地上下轉(zhuǎn)動離心管5—10 min，直至水相與酚相混勻成乳狀液。5 000 rpm離心15 min，用大口吸管小心吸取上層黏稠水相移至另一離心管中。重復(fù)酚抽提1次。加等體積的氯仿：異戊醇(24∶1)上下轉(zhuǎn)動混勻。5 000 rpm離心15 min，用大口吸管小心吸取上層黏稠水相移至另一離心管中。重復(fù)1次。加入1/5體積的3 mol/L NaAc及2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，室溫下慢慢搖動離心管，即有乳白色云絮狀DNA出現(xiàn)。用玻璃棒小心挑取云絮狀的DNA轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，加70%乙醇0.2 mL，以5 000 rpm離心5 min。洗滌DNA棄上清，去除殘留的鹽。重復(fù)1次。置于室溫下?lián)]發(fā)殘留的乙醇，但不要讓DNA完全干燥。最后加TE液20 μL溶解DNA，置于搖床平臺緩慢搖動。DNA完全溶解通常需12—24 h。制成的DNA液-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR反應(yīng)

以提取的基因組DNA為模板，利用引物P2/P8，引物P2：5′-TCTGCATCGCTAAATCCTTT-3′，引物P8：5′-CTCCCAAGGATGAGRAAYTG-3′，對7只麥哲倫企鵝的CHD基因進行擴增。反應(yīng)體系為25 μL，PCR擴增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)在PCR儀上進行，PCR產(chǎn)物置于4 ℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物克隆、測序及比對分析

按照 OMEGA 膠回收試劑盒說明書步驟進行操作，將PCR產(chǎn)物進行膠回收，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將PCR產(chǎn)物連接至T載體，然后轉(zhuǎn)至感受態(tài)細胞DH5a進行克隆，并將克隆后的菌液4 ℃分管保存，送去上海生工進行測序，然后將測序結(jié)果與NCBI上公布的短趾鷹(Circaetusgallicus)的CHD基因序列進行BlAST序列比對分析，通過基因進化樹來鑒定7只麥哲倫企鵝的性別。

2 結(jié)果

2.1 基因組的提取濃度與純度

利用試劑盒提取麥哲倫企鵝基因組DNA，用分光光度計檢測其濃度和純度。結(jié)果顯示，提取DNA的平均濃度在400 ng/μL左右；OD260/OD280在1.8—2.0，OD260/OD230在2.0—2.5，所提取的DNA純度較好，可用于后續(xù)的實驗。

2.2 麥哲倫企鵝CHD基因片段的擴增結(jié)果

利用引物P2/P8對7只麥哲倫企鵝的CHD基因片段進行了擴增，取5 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。從圖1的凝膠電泳圖發(fā)現(xiàn)，擴增的目的條帶大小約380 bp。從圖1中只能看出1條帶，而且片段大小差別不大，所以很難從瓊脂糖凝膠電泳條帶中將麥哲倫企鵝的雌雄區(qū)別開來。

2.3 PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果及與短趾鷹Blast比對分析

將PCR產(chǎn)物連接至T載體，然后轉(zhuǎn)至感受態(tài)細胞DH5a進行克隆，每只企鵝樣本分別挑選7個克隆，然后送去上海生工進行測序。將測序結(jié)果與GenBank中公布的短趾鷹的CHD基因序列進行Blast比對和同源性分析。對Blast結(jié)果進行分析，出現(xiàn)CHD-W，則可判定企鵝個體為雌性(ZW型)，若僅出現(xiàn)CHD-Z，則可判定該個體為雄性(ZZ型)。從表1中可以看出，編號為36、1572、1573、1574、1575號的麥哲倫企鵝為雄性。編號29與1577號的企鵝個體為雌性。

表1 7只麥哲倫企鵝CHD基因序列比對與性別鑒定結(jié)果

3 討論

鳥類的羽毛、血液、肌肉以及胚胎的尿囊液都可以提取基因組DNA。微量血PCR、血液、羽毛、肌肉和雞胚組織等材料提取DNA后的PCR方法均可準確快速鑒定雞和雞胚的性別[4]。新生鳥類翅靜脈和頸靜脈小，采血困難，通過心臟采血法可以采集到足夠的血液，但采血方法對動物的傷害極大。羽毛的再生能力強，可以通過非傷害性采樣獲得，動物的應(yīng)激和傷害較小，適合規(guī)?；b定。本試驗采用7只企鵝的年齡與編號：29、36號企鵝為11歲左右，1572、1573、1574、1575與1577號企鵝為7歲左右，人工采血前期對這7只企鵝進行了人工保定與采血的脫敏訓(xùn)練，減少采血的應(yīng)激性，并在企鵝狀態(tài)非常好的情況下在企鵝的翼下靜脈進行了采血，將獲得的新鮮血液立即置于-20 ℃冰箱保存或用于試驗。

提前鑒定動物性別，不僅能夠為飼養(yǎng)提供合理指導(dǎo)，提高經(jīng)濟價值，也能滿足科研領(lǐng)域區(qū)分性別的需求，提前規(guī)劃珍稀動物的繁育。董忠典等[5]通過對弓背青鳉(Oryziascurvinotus)基因組數(shù)據(jù)分析、性別特異引物設(shè)計、DNA 提取、PCR 擴增，利用瓊脂糖凝膠電泳在雌性弓背青鳉基因組DNA 中可擴增出單一條帶，在雄性基因組DNA 中可擴增出雙條帶，從而快速、準確鑒定弓背青鳉遺傳性別。

全世界絕大部分鳥類是單態(tài)性，即雌雄同型，它們的個體無論是處在幼體還是成體時期，都很難從外觀上和行為上將其區(qū)分開來，因此性別早期鑒定對鳥類的人工飼養(yǎng)管理、繁育、疾病防治等方面存在重要的意義。目前鳥類的性別鑒定方法有很多，其中傳統(tǒng)的方法主要有目測性器官或?qū)π韵龠M行直接造影的內(nèi)窺鏡及超聲波檢查等形態(tài)學(xué)方法[6]，其精確度不高。后來發(fā)展了染色體組型方法[7]和激素分析法[8]。分子生物學(xué)方法是近年來發(fā)展起來的一種利用PCR擴增技術(shù)來對鳥類進行性別鑒定的一種新的方法。鳥類的基因型為ZW型，雄性為ZZ型，雌性為ZW型。染色體螺旋蛋白基因(chromo-helicase-DNA-binding gene，CHD基因)是性染色體上編碼調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性蛋白的一個功能性基因，在非平胸鳥類有兩個同源性拷貝，即CHD-W和CHD-Z。由于雌性基因型為ZW，因此其擴增電泳圖出現(xiàn)2條帶，雄性基因型為ZZ，則擴增電泳圖僅能擴增出1條帶[9]。徐麗晶等[10]合成了通用引物gCHD，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分析后，準確鑒定了85只SPF金定鴨(Anasplatyrhynchos)的性別。江彬等[11]利用引物P2 和P8從鷺類Z染色體上擴增出380 bp和390 bp 2條長度不同的片段，從W 染色體上擴增出380 bp 1條片段，用于性別鑒定。

自1995 年CHD基因被應(yīng)用于鳥類性別的分子鑒定以來，平胸鳥類性別鑒定問題正逐步被解決，CHD基因已經(jīng)成為非平胸鳥類性別鑒定最重要的分子標記[12]。后來研究發(fā)現(xiàn)CHD基因并不是鳥類性別的決定性基因，但該基因在鳥類性別的分子鑒定方面發(fā)揮著巨大的作用。沈瑋等[13]對PCR產(chǎn)物進一步進行CHD基因序列分析，采用Blast序列比對分析，依據(jù)CHD-Z或CHD-W基因的同源性鑒定出帝企鵝(Aptenodytesforsteri)的性別。本研究利用PCR 擴增與同源性比對分析相結(jié)合的方法來對麥哲倫企鵝進行性別鑒定。選用引物P2/P8擴增出了麥哲倫企鵝的CHD基因，對擴增后的PCR產(chǎn)物進行CHD基因序列的Blast比對與同源性分析，成功鑒定了麥哲倫企鵝的性別。與其他鳥類性別鑒定方法相比，該方法采用PCR方法，利用穩(wěn)定遺傳的基因組DNA，解決了兩者基因大小差別不大造成難以準確判定的困難，從而不依賴于較難區(qū)別的外部形態(tài)，結(jié)果更可靠，而且對于剛出生的企鵝也同樣適用，這種方法可以實現(xiàn)對性別的早期鑒定，而且操作簡便，周期短，可以同時檢測大量的樣品，是到目前為止最為簡單快捷、準確可靠的鳥類性別鑒定的途徑。

近年來，由于環(huán)境污染，植被破壞等因素導(dǎo)致許多珍稀野生鳥類瀕臨滅絕。為了更好地保護鳥類，必須采取一定的措施來提高它們的繁殖率，所以對這些珍稀野生鳥類進行人工繁育和遷地保護將發(fā)揮非常重要的作用。全世界鳥類中絕大部分鳥類是單態(tài)性鳥類，即雌雄同型，它們的個體無論是處在幼體還是成體時期，都很難從外觀上和行為上將其區(qū)分開來，所以鳥類的性別早期鑒定對鳥類的人工飼養(yǎng)管理、繁育、疾病防治等方面存在重要的意義。本研究建立的基于CHD基因的分子生物學(xué)方法能夠較為準確快速地鑒定出麥哲倫企鵝的性別，對提高館養(yǎng)麥哲倫企鵝的人工繁殖率和飼養(yǎng)管理水平，以及進一步研究保護瀕危野生鳥類具有重要的意義。