狐源大腸桿菌中氯霉素類(lèi)抗生素耐藥基因的檢測(cè)

馮 濤 富景寧 薛 原*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.隆化縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，承德，068150)

大腸桿菌(Escherichiacoli)廣泛存在于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)，在人畜共患的細(xì)菌中十分常見(jiàn)，可以通過(guò)糞便造成環(huán)境的細(xì)菌污染，大腸桿菌通過(guò)質(zhì)粒使其廣泛傳播，對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物的健康具有潛在的威脅[1]。近幾年，狐(Vulpesspp.)的飼養(yǎng)十分普遍，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和較大的養(yǎng)殖前景。

氯霉素類(lèi)藥物在臨床上較為常用的有氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，這類(lèi)藥物的抗菌譜廣，在體內(nèi)的分布也很廣泛，對(duì)大腸桿菌的抑菌效果明顯，在獸醫(yī)的臨床用藥中占有不可或缺的地位[2]。但是，隨著對(duì)氯霉素類(lèi)藥物的研究越來(lái)越深入，其毒性大，易產(chǎn)生耐藥性，并且殘留于動(dòng)物機(jī)體內(nèi)抑制某些蛋白質(zhì)合成等缺點(diǎn)也逐漸暴露出來(lái)，包括中國(guó)在內(nèi)的世界上很多的國(guó)家都已經(jīng)禁止氯霉素和甲砜霉素在獸醫(yī)臨床上的使用[3]。氟苯尼考作為氯霉素的衍生藥物，其在一定程度上具有較強(qiáng)的安全性和有效性，其在我國(guó)仍然被用作為獸藥和添加劑而廣泛使用[4]。由于臨床使用存在問(wèn)題，氟苯尼考的耐藥性也在逐年上升，對(duì)環(huán)境造成一定的選擇壓力。氯霉素類(lèi)耐藥基因中cmlA、cat和floR的研究比較廣泛，其中cmlA基因主要依賴(lài)外排泵機(jī)制使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[5]，cat基因與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的滅活有關(guān)[6]，而氟苯尼考的耐藥機(jī)制的研究主要集中在floR基因上[7]。

本試驗(yàn)檢測(cè)和分析了東北地區(qū)不同狐源養(yǎng)殖場(chǎng)中氯霉素類(lèi)耐藥基因分布情況，根據(jù)對(duì)氯霉素類(lèi)耐藥性的研究發(fā)現(xiàn)，狐源大腸桿菌對(duì)氯霉素的耐藥率高達(dá)67.41%，對(duì)氟苯尼考的耐藥性也達(dá)到了46.43%，因此調(diào)查狐源中耐氯霉素類(lèi)大腸桿菌的分子流行情況，旨在掌握耐藥基因的分布情況和流行規(guī)律，從而控制耐藥性的進(jìn)一步傳播，為氯霉素類(lèi)藥物的合理使用提供理論依據(jù)，并對(duì)東北地區(qū)狐源養(yǎng)殖場(chǎng)的臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌質(zhì)控菌株(菌株編號(hào)為ATCC25922)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；試驗(yàn)菌株于2016—2019年分離自東北不同地區(qū)狐養(yǎng)殖場(chǎng)，并分離純化和鑒定的大腸桿菌224株。

1.2 試劑

10×Buffer、Dntp、Taq酶、DL-2000 Marker、6×Loading Buffer、pMD18-T載體，感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，均由TaKaRa公司提供；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA片段凝膠回收試劑盒，均由愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.3 耐藥基因的檢測(cè)

PCR擴(kuò)增的模板為已鑒定的大腸桿菌的質(zhì)粒和菌液，采用25 μL PCR擴(kuò)增體系，按照參考文獻(xiàn)[8-9]設(shè)計(jì)引物序列(表1)。PCR擴(kuò)增體系為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，退火溫度見(jiàn)表1。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，隨機(jī)選擇各個(gè)基因的陽(yáng)性樣本進(jìn)行膠回收，連接到18-T載體上，進(jìn)行克隆測(cè)序后將質(zhì)粒樣本送至吉林庫(kù)美生物技術(shù)有限公司，利用DNASTAR軟件分析，與NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較分析。

表1 耐藥基因的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

在224株狐源大腸桿菌中，結(jié)果表明cmlA、cat和floR基因擴(kuò)增均出現(xiàn)陽(yáng)性，有77.23%的大腸桿菌可以攜帶氯霉素類(lèi)耐藥基因，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期目的片段相符，經(jīng)測(cè)序可得，其同源性均在99%以上(圖1，圖2，圖3)。cmlA基因擴(kuò)增的陽(yáng)性例數(shù)為73例，陽(yáng)性率為32.59%；cat基因檢出的陽(yáng)性樣本有98例，檢出率為43.75%；floR基因中有79例樣本被檢出，陽(yáng)性率為35.27%(表2)。分別計(jì)算攜帶單個(gè)基因以及多個(gè)基因的情況，結(jié)果表明在224株狐源大腸桿菌中，只單獨(dú)攜帶1種基因的比例占大多數(shù)，為47.32%，存在攜帶2個(gè)及3個(gè)以上基因的大腸桿菌。

圖1 部分cmlA基因PCR產(chǎn)物的電泳圖譜Fig.1 The electrophoretogram of portion cmlA 注：M：DL-2000 Marker；1：陰性對(duì)照；2—9：部分cmlA基因 Note：M，DL-2000 Marker.1，negative control.2-9，PCR products of cmlA gene

圖2 部分cat基因PCR產(chǎn)物的電泳圖譜Fig.2 The electrophoretogram of portion cat 注：M：DL-2000 Marker；1：陰性對(duì)照；2—10：部分cat基因 Note：M，DL-2000 Marker.1，negative control.2-10，PCR products of cat gene

圖3 部分floR基因PCR產(chǎn)物的電泳圖譜Fig.3 The electrophoretogram of portion floR 注：M：DL-2000 Marker；1：陰性對(duì)照；2—7：部分floR基因 Note：M，DL-2000 Marker.1，negative control.2-7，PCR products of floR gene

2.2 耐藥基因分布情況

不同地區(qū)的分布情況見(jiàn)圖4，不同基因在東北不同地區(qū)的分布存在差異，各個(gè)基因在這3個(gè)地區(qū)均有檢出，其中cmlA和cat基因在各地區(qū)的存在較為普遍，并保持較為相似的水平；floR基因的差異十分明顯，以遼寧地區(qū)的檢出率最高。

表2 狐源大腸桿菌產(chǎn)氯霉素類(lèi)耐藥基因攜帶情況及基因型

圖4 氯霉素類(lèi)耐藥基因的地區(qū)分布Fig.4 The distribution of chloramphenicol resistant gene

3 討論

隨著細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性逐漸升高，多重耐藥菌對(duì)環(huán)境的污染越來(lái)越嚴(yán)重，導(dǎo)致在臨床治療上的影響也趨于復(fù)雜化，一些日常的疾病也發(fā)生治療失敗的情況[10]?？股氐氖褂脡毫哟螅诜肿铀缴?，耐藥基因可以通過(guò)水平傳播和垂直傳播擴(kuò)散到不同的個(gè)體、種群和環(huán)境中，抗生素的使用不當(dāng)促進(jìn)了耐藥基因的產(chǎn)生和傳播。尤其是動(dòng)物的耐藥性和耐藥基因可以通過(guò)食物鏈傳播到人類(lèi)中，為人類(lèi)疾病的治療同樣產(chǎn)生了威脅[11]。

在初期的研究中發(fā)現(xiàn)，氯霉素類(lèi)的耐藥性表現(xiàn)出一種較高的水平[12]，因此本試驗(yàn)對(duì)狐源大腸桿菌進(jìn)行氯霉素類(lèi)耐藥基因的檢測(cè)和分析。cmlA基因是通過(guò)對(duì)外排泵上的蛋白來(lái)發(fā)揮作用，該蛋白可以保護(hù)機(jī)體免受氯霉素的影響，還可以改變藥物的通路，使細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)氯霉素的耐藥性[5]。cat基因表達(dá)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶從而產(chǎn)生滅活作用，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[6]。有173株可攜帶氯霉素類(lèi)耐藥基因，檢出率高達(dá)77.23%。其中cat基因的陽(yáng)性率較高，共有43.75%的大腸桿菌攜帶該耐藥基因，這個(gè)結(jié)果與趙鳳菊等[13]對(duì)豬源大腸桿菌氯霉素耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果相似；cmlA的檢出率為32.59%，與Momtaz等[14]對(duì)伊朗地區(qū)雞源大腸桿菌的檢測(cè)結(jié)果類(lèi)似。這兩種基因都對(duì)氯霉素產(chǎn)生作用，從而使機(jī)體產(chǎn)生耐藥性。氯霉素雖然在獸藥中被禁用了較長(zhǎng)的時(shí)間，但是其耐藥性和耐藥基因的攜帶率仍然存在，可能與氯霉素易殘留并且較難降解的特點(diǎn)有關(guān)，雖然該類(lèi)藥物已經(jīng)不再使用，但是環(huán)境中存在的污染和繁殖過(guò)程中的傳播仍然存在，還需要時(shí)間來(lái)消除它的影響。根據(jù)之前對(duì)虎源大腸桿菌的研究[3]，cmlA和cat基因的檢出率已經(jīng)有所下降。氟苯尼考的耐藥性為46.43%，其耐藥基因floR存在于質(zhì)粒中[15]，并伴隨質(zhì)粒進(jìn)行傳播，從而使氟苯尼考的耐藥性也在逐年上升。本試驗(yàn)中floR基因的陽(yáng)性率為35.27%，這個(gè)結(jié)果與劉艷紅等[16]對(duì)豬源和雞源的大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因的研究結(jié)果相差較多，這個(gè)差異可能跟物種不同有關(guān)，在東北地區(qū)狐的飼養(yǎng)用藥中，對(duì)氟苯尼考的使用還較少，但是其耐藥性的增長(zhǎng)仍然需要關(guān)注。只單獨(dú)攜帶一種基因的比例占大多數(shù)，這個(gè)結(jié)果表明這3種基因相互之前的影響較小。比較分析不同地區(qū)耐藥基因的分布情況，不同地區(qū)較為優(yōu)勢(shì)的基因不同，cmlA和cat基因在各地區(qū)都保持較為相似的水平，均表現(xiàn)為50%左右，沒(méi)有較大的差異起伏；floR基因的地區(qū)差異尤為明顯，以遼寧地區(qū)的檢出率最高，表明該基因具有快速擴(kuò)散和傳播的潛力，需要加強(qiáng)監(jiān)控。

狐的飼養(yǎng)具有較為廣泛的發(fā)展前景，開(kāi)展氯霉素類(lèi)耐藥基因的檢測(cè)和監(jiān)控，掌握產(chǎn)生氯霉素類(lèi)藥物耐藥的主要機(jī)制，可以防止多重耐藥菌的擴(kuò)散和爆發(fā)，降低對(duì)狐的經(jīng)濟(jì)價(jià)值的影響，對(duì)指導(dǎo)養(yǎng)殖場(chǎng)臨床用藥具有一定的意義。了解耐藥基因的流行病學(xué)規(guī)律，可以有效地降低耐藥性及其相應(yīng)的基因從動(dòng)物擴(kuò)散到環(huán)境甚至傳播到人類(lèi)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，建議加強(qiáng)合理使用抗生素的管理，減少對(duì)抗生素產(chǎn)生環(huán)境壓力，避免甚至消除耐藥性的傳播和擴(kuò)散，為新藥的研制提供分子基礎(chǔ)。