黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪皮膚抗菌肽最早表達(dá)時(shí)間的確定

Martina OPALIN 王 情 馬 躍 王碧霄 郭 策 徐艷春，3*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物檢測(cè)中心，哈爾濱，150040；3.國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)物保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心，哈爾濱，150040)

兩棲類(lèi)動(dòng)物是由水生向陸生過(guò)渡的脊椎動(dòng)物類(lèi)群，皮膚通透性高，僅有1—2層輕微角質(zhì)化的細(xì)胞[1]，有利于呼吸、排泄、調(diào)節(jié)水分、離子運(yùn)輸?shù)?，但缺少機(jī)械屏障，容易受到環(huán)境中病原微生物的侵襲。作為對(duì)策，兩棲類(lèi)在皮膚表面形成了一種強(qiáng)大的化學(xué)屏障，包括黏蛋白為主的黏液層，還有溶解于黏液層的抗菌肽(antimicrobial peptide，AMP)等物質(zhì)，共同構(gòu)成了體表的先天性免疫系統(tǒng)，抵抗多種微生物的入侵[2]。

抗菌肽是一類(lèi)具有生物活性的小分子，一般由12—100個(gè)氨基酸組成，分子量在4 KD左右，通常帶正電，凈電荷為+2—+9；具有兩親性[3-4]?？咕牡男蛄芯哂懈叨鹊亩鄻有裕?只蛙的皮膚可能有10—20種在大小、序列、電荷、疏水性、構(gòu)象、抗菌譜等都不同的肽類(lèi)；5 000多個(gè)現(xiàn)存的無(wú)尾目(Anura)蛙類(lèi)物種可以產(chǎn)生大約100 000種不同的抗菌肽[5]。如此多樣的抗菌肽是由龐大的基因家族來(lái)編碼的，在一定環(huán)境條件刺激下有選擇性地表達(dá)。當(dāng)環(huán)境微生物較多時(shí)，兩棲類(lèi)會(huì)增加抗菌肽的表達(dá)量，在無(wú)菌的環(huán)境中則不產(chǎn)生抗菌肽；而且在不同的微生物群落的刺激下會(huì)產(chǎn)生不同的表達(dá)譜[6-8]。

兩棲類(lèi)動(dòng)物的生活史中，受精卵在水中發(fā)育，蝌蚪經(jīng)過(guò)變態(tài)后登陸。兩棲類(lèi)的受精卵外被一層透明膠體，可以阻止微生物侵入[9]。蝌蚪孵化以后進(jìn)入水中，失去了這層卵膜的保護(hù)，但是其皮膚分泌黏蛋白構(gòu)建一層膠體屏障，使其免受水體微生物的挑戰(zhàn)[10]。但是，這層屏障隨著蝌蚪的發(fā)育逐漸變薄，保護(hù)作用逐漸減弱。與此同時(shí)，皮膚開(kāi)始分泌抗菌肽來(lái)補(bǔ)償膠體屏障削弱帶來(lái)的影響[11-12]。但是，蝌蚪最早在哪個(gè)發(fā)育階段開(kāi)始分泌抗菌肽始終缺乏研究。解決這一問(wèn)題對(duì)揭示蝌蚪的生存對(duì)策，理解兩棲類(lèi)的免疫進(jìn)化的機(jī)制，研究不同生態(tài)背景下蛙類(lèi)種群波動(dòng)機(jī)制等具有重要意義。

黑斑側(cè)褶蛙(Pelophylaxnigromaculatus)廣泛分布于亞洲大陸東部，棲息于草原、森林、叢林和沙漠中的河流、湖泊、池塘、沼澤和農(nóng)田等多種生境[13-14]。不同地理區(qū)域因氣候、海拔等因素的差異，水體中微生物群落結(jié)構(gòu)也各不相同[15]。本研究以東北地區(qū)黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪為對(duì)象，研究了各個(gè)發(fā)育時(shí)期皮膚組織學(xué)變化和抗菌肽表達(dá)情況，揭示其最早在T2期就開(kāi)始表達(dá)抗菌肽。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與形態(tài)測(cè)量

在黑龍江省尚志市帽兒山地區(qū)的人工池塘中，從5月中旬持續(xù)到7月中旬，采集從受精卵到完成變態(tài)各個(gè)時(shí)期的黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪和幼蛙。采集時(shí)，用紗網(wǎng)小心撈取受精卵或蝌蚪，根據(jù)形態(tài)進(jìn)行物種鑒定[16]，把其他物種的蝌蚪放回池塘。把黑斑側(cè)褶蛙蝌蚪放在燒杯中，用魚(yú)安定(MS-222)過(guò)量麻醉致死。根據(jù)Gosner的標(biāo)準(zhǔn)鑒別發(fā)育時(shí)期[17]。因?yàn)镚osner分期非常細(xì)，分期標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)器官、結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)與否，而相鄰時(shí)期的皮膚變化不夠明顯。而且受到環(huán)境溫度波動(dòng)的影響，每個(gè)時(shí)期難以采集到多個(gè)標(biāo)本。故此把各個(gè)時(shí)期歸納到5個(gè)較寬泛時(shí)期：E期(embryo stage，對(duì)應(yīng)Gosner’s stage 1—19)、H期(hatchling，對(duì)應(yīng)Gosner’s stage 20—22)、T1期(對(duì)應(yīng)Gosner’s stage 23—25)、T2期(對(duì)應(yīng)Gosner’s stage 26)、T3期(變態(tài)前期，對(duì)應(yīng)Gosner’s stage 27—41)、T4 期(變態(tài)期，對(duì)應(yīng)Gosner’s stage 42—45)和J期(幼蛙期，對(duì)應(yīng)Gosner’s stage 46)。把蝌蚪放置在帶有刻度的塑料板上測(cè)量體長(zhǎng)，精確到0.1 mm。E期、H期、T1期的各5只樣本直接置于液氮中保存，3只樣本置于10%的福爾馬林緩沖液中固定。將T2期及以后的各個(gè)時(shí)期的消化道(胃+腸道)小心剝離出來(lái)，用柔軟的細(xì)線按照其走向比齊，再置于刻度尺上測(cè)定長(zhǎng)度，精確到0.1 mm。再把各時(shí)期的皮膚小心分離下來(lái)。操作完成后，把皮膚和消化道樣本立即放入液氮中保存。

1.2 抗菌肽的檢測(cè)

把蝌蚪、皮膚、腸道等材料從液氮中取出，分別置于0.1%的DEPC溶液處理過(guò)的研缽中，用RNase Free水迅速清洗，用濾紙吸干水分，在研缽內(nèi)倒入液氮，把樣品研磨成粉末。將粉末收集于1.5 mL的離心管內(nèi)，用Trizol法提取總RNA?？俁NA用NanoPhotometer(Implen，Germany)測(cè)定濃度，并在2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性。

用RNA PCR Kit(AMV).Ver.3.0(TaKaRa，大連)，分別以10條根據(jù)無(wú)尾兩棲類(lèi)抗菌肽信號(hào)肽區(qū)域設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物PS1—PS10為上游引物，以通用引物PC為下游引物(表1)進(jìn)行抗菌肽cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成和PCR檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和程序參照試劑盒的說(shuō)明書(shū)。

表1 黑斑側(cè)褶蛙抗菌肽cDNA克隆的引物序列[18]

抗菌肽cDNA的擴(kuò)增采用50.0 μL體系，包含1×PCR buffer(Mg2+plus)、1U TaKaRa ExTaqHS、10 pmol上游引物PS1—PS10之一和5 pmol下游引物PC、10 μL反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA。反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C/2 min；(94°C/30 s，Ta/30 s，72°C/1 min)35 cycles；72°C/10 min；10°C/∞。取5 μL PCR產(chǎn)物在1.8%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。在紫外燈下用無(wú)菌手術(shù)刀將目的片段切下，放入1.5 mL Eppendorf管中，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)，杭州有限公司)進(jìn)行純化回收。將每個(gè)時(shí)期所有的PCR產(chǎn)物混合后，再用pMD18-T Vector試劑盒(TaKaRa，大連)進(jìn)行克隆。菌斑經(jīng)過(guò)LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)繁后，取菌液1 μL，用10 μL上述體系進(jìn)行PCR鑒定。每個(gè)時(shí)期取5個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序采用Sanger法，用BigDye?Terminator v3.1 試劑盒在ABI 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems，USA)上完成。用Lasergene中的EditSeq將測(cè)得的cDNA序列進(jìn)行整理，在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)序列的同源性判定是否為抗菌肽，并判定其所屬基因家族。

1.3 皮膚的組織學(xué)觀察

參照歐志杰等[19]的方法，把蝌蚪的皮膚樣本制備石蠟切片，并進(jìn)行AB-PAS染色[20]。組織切片在CX40生物顯微鏡(Olympus，日本)下觀察，用ToupView顯微成像系統(tǒng)(上海光學(xué)儀器廠)拍照記錄和圖像處理。

2 結(jié)果

2.1 蝌蚪不同發(fā)育時(shí)期的鑒定

比照Gosner的鑒別標(biāo)準(zhǔn)，把蝌蚪歸納為5個(gè)發(fā)育時(shí)期：受精卵及胚胎期(E期)、孵化期(H期)、T1期、T2期、變態(tài)前期(T3期)、變態(tài)期(T4期)和幼蛙期(J期)。各個(gè)時(shí)期的特點(diǎn)如圖1和表2。

圖1 黑斑側(cè)褶蛙各個(gè)發(fā)育時(shí)期的外觀特征Fig.1 Visual representation of different development stages of Pelophylax nigromaculatus 注：A.E期的受精卵團(tuán)；B.H期剛孵化的蝌蚪；C.T1期腹面觀；D.T1期背面觀；E.T2期體型較大尚未出現(xiàn)后肢的蝌蚪；F、G.T3期變態(tài)前期的蝌蚪，身體背面可見(jiàn)成體蛙特有的斑點(diǎn)和條紋以及腺體；H.T4期正處于變態(tài)中的蝌蚪；I.J期完成變態(tài)的幼蛙 Note：A，spawn at stage E.B，hatchlings at stage H.C，lateral view of larvae at stage T1.D，dorsal view of larvae at stage T1.E，larvae at stage T2.F，G，pre-metamorphic larvae at stage T3，showing the specie-specific dorsal line and glands.H，metamorphic larvae at stage T4.I，juvenile frog at stage J

表2 黑斑側(cè)褶蛙各個(gè)發(fā)育時(shí)期的特征

2.2 蝌蚪不同發(fā)育時(shí)期皮膚組織結(jié)構(gòu)的變化

胚胎期(E期)能夠觀察到蝌蚪胚胎在卵囊中跳動(dòng)，其皮膚僅有1—2層細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞層下面為基底層，顯微鏡下常不清晰。致密層(真皮)極薄，層位于表皮基底層之下。表皮表層分布大量巨型細(xì)胞，包括胞核位于邊緣，胞質(zhì)透明的黏液細(xì)胞和頂端有大量微小色素顆粒的分泌細(xì)胞(圖2-A)。剛剛孵化進(jìn)入水中的蝌蚪(H期)，皮膚結(jié)構(gòu)與E期相似，表皮有1—2層細(xì)胞，真皮層極薄。在表皮表面散在分布大量的微小色素顆粒(圖2-B)。

圖2 黑斑側(cè)褶蛙各個(gè)時(shí)期皮膚的組織學(xué)變化Fig.2 Histological changes of skin at different development stages of Pelophylax nigromaculatus 注：A.胚胎期(×250)；B.孵化期(×250)；C.T1期(×250)；D.T2期(×250)；E.T3期(×500)；F.T4期及幼蛙期(×500)；GC.巨型細(xì)胞；EL.表皮層；CL.致密層；SL.疏松層；EFP.表皮微小色素顆粒；EMP.表皮載黑素細(xì)胞；DMP.真皮載黑素細(xì)胞；MC.黏液細(xì)胞；GG.顆粒腺；MG.黏液腺 Note：A，embryo stage(×250).B，hatchling stage(×250).C，T1 stage(×250).D，T2 stage(×250).E，T3 stage(×500).F，T4 stage and juvenile frog (×500).GC，giant cells.EL，epidermal layer.CL，compact layer.SL，spongy layer.EFP，epidermal fine pigments.EMP，epidermal melanophores.DMP，dermal melanophores.MC，mucus cell.GG，granular gland.MG，mucous gland

進(jìn)入T1期后，表皮細(xì)胞排列更為規(guī)則，散在的微小色素顆粒有所減少(圖2-C)。T2期表皮細(xì)胞增加到3—5層，散在的色素顆粒進(jìn)一步減少。表皮和真皮中開(kāi)始出現(xiàn)載黑素細(xì)胞，胞質(zhì)中色素大量聚集，呈團(tuán)塊狀。同時(shí)疏松層開(kāi)始發(fā)育，并偶見(jiàn)較小的顆粒腺和黏液腺，致密層也顯著加厚(圖2-D)。T3期表皮細(xì)胞排列更加規(guī)則，細(xì)胞層數(shù)穩(wěn)定在3—5層，色素顆粒形態(tài)和分布與T2相同。疏松層顯著加厚，載黑素細(xì)胞主要出現(xiàn)在表皮與疏松層的界面附近。疏松層內(nèi)可見(jiàn)較多的黏液腺和顆粒腺，但體積較小。致密層顯著加厚，可見(jiàn)數(shù)量較多的成纖維細(xì)胞和膠原纖維束(圖2-E)。蝌蚪進(jìn)入變態(tài)期(T4期)和幼蛙期(J期)，皮膚已經(jīng)具備了成年蛙的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，表皮由多層細(xì)胞構(gòu)成，載黑素細(xì)胞出現(xiàn)在表皮、表皮與疏松層的界面處，以及疏松層內(nèi)，可見(jiàn)到大量的色素團(tuán)塊。顆粒腺和黏液腺更加發(fā)達(dá)，黏液腺稍小，靠近表皮層，顆粒腺較大，占據(jù)疏松層的主要空間。致密層顯著加厚，膠原纖維束更為粗大(圖2-F)。

2.3 蝌蚪不同發(fā)育時(shí)期體長(zhǎng)及消化道的變化

蝌蚪不同發(fā)育時(shí)期體長(zhǎng)的變化趨勢(shì)如圖3，H期體長(zhǎng)為0.4—0.7 cm，平均為(0.56±0.12)cm；T1期為0.8—1.8 cm，平均為(1.28±0.34)cm；T2期為3.5—6.1 cm，平均為(4.86±0.75)cm；T3期進(jìn)一步增大，達(dá)到4.2—6.8 cm，平均為(5.48±0.71)cm；到T4期時(shí)，體長(zhǎng)隨著尾部的吸收而縮短，處于3.7—6.2 cm，平均(5.38±0.91)cm；至變態(tài)完成之后的幼蛙期(J期)，體長(zhǎng)為3.5—5.2 cm，平均(4.19±0.64)cm。整個(gè)蝌蚪期的體長(zhǎng)變化近似“S”形曲線。

圖3 黑斑側(cè)褶蛙不同發(fā)育時(shí)期體長(zhǎng)和消化道的變化趨勢(shì)Fig.3 The dynamics of body length and digestive tract length at different developmental stages of Pelophylax nigromaculatus

消化道在T1期的長(zhǎng)度為2.7—4.2 cm，平均(3.35±0.51)cm。在T2期迅速延長(zhǎng)到15.0—19.7 cm，平均達(dá)到(17.54±1.39)cm。到T3期較T2期稍有加長(zhǎng)，保持在15.4—20.2 cm的水平，平均為(18.48±1.27)cm。至T4期時(shí)，消化道長(zhǎng)度又縮短到12.7—16.1 cm，平均(13.78±1.34)cm。完成變態(tài)進(jìn)入幼蛙期，消化道長(zhǎng)度進(jìn)一步縮短到5.9—6.4 cm，平均為(6.15±0.24)cm。

消化道相對(duì)體長(zhǎng)的比例在T1期為2.63，T2期增加到3.61，T3期略有回落，為3.37，T4期回落到接近T1期的水平2.56，J期進(jìn)一步降低到1.47。

2.4 蝌蚪不同發(fā)育時(shí)期抗菌肽的檢測(cè)

蝌蚪不同發(fā)育時(shí)期的樣本均成功提取了總RNA，電泳檢測(cè)顯示18S和28S兩個(gè)清晰條帶，表明RNA比較完整。E期、H期和T1期因?yàn)闃悠诽?，未能分離皮膚、消化道等器官，而是整體提取總RNA。T2期至J期的樣品均將皮膚、消化道分離開(kāi)，分別提取了總RNA。

采用引物PS1-PS10進(jìn)行TR-PCR反應(yīng)檢測(cè)抗菌肽的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，10對(duì)引物在E期、H期和T1期的總RNA中均未獲得陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，表明這3個(gè)時(shí)期沒(méi)有抗菌肽表達(dá)。從T2期開(kāi)始，一些引物在皮膚、腸道和整體樣本上均得到PCR產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序確定為抗菌肽(表3)。

經(jīng)過(guò)在GenBank中搜索比對(duì)，根據(jù)同源性和AMP序列特征最終確定T2期檢測(cè)到的抗菌肽包括temporin-1N、esculentin-1N和nigrocin-7N等3個(gè)家族。T3期皮膚和腸道均檢測(cè)到抗菌肽nigrocin-4N家族。到T4期皮膚檢測(cè)到nigrocin-6N、esculentin-2N、nigrocin-4N等3個(gè)家族；腸道檢測(cè)到的抗菌肽有nigrocin-6N、nigrocin-3N。幼蛙期皮膚中檢測(cè)到的家族較多，包括nigrocin-5N、esculentin-1P、temporin-1N、esculentin-1N、nigrocin-7N等家族，腸道中的抗菌肽家族與皮膚相同。

3 討論

兩棲類(lèi)皮膚非特異性免疫包括物理屏障、細(xì)胞屏障、化學(xué)屏障和微生物屏障。物理屏障主要是表皮層輕微角化的細(xì)胞和真皮的膠原纖維層；細(xì)胞屏障主要是皮膚中的樹(shù)突狀細(xì)胞、朗格罕氏細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等各類(lèi)免疫細(xì)胞；化學(xué)屏障主要是抗菌肽和黏液層；微生物屏障主要是皮膚上附著的微生物群落[21]。兩棲類(lèi)生活史早期是在水體中完成的，而變態(tài)之后也不離開(kāi)濕潤(rùn)環(huán)境。這樣的生活環(huán)境中，微生物極為豐富，其中不乏能夠侵襲機(jī)體的致病微生物[22-23]。發(fā)育過(guò)程中，這些免疫屏障是如何建立和成熟的，如何有效保護(hù)機(jī)體免受攻擊等，都是與蝌蚪的生存密切相關(guān)。

表3 黑斑側(cè)褶蛙各個(gè)時(shí)期總RNA提取和擴(kuò)增得到抗菌肽的總體結(jié)果(+陽(yáng)性，-陰性，×未采樣)

研究顯示，受精卵和胚胎受到卵膜的保護(hù)。卵膜是透明膠體，可以阻止微生物侵入[9]。蝌蚪孵化以后進(jìn)入水中，非特異性免疫主要依靠皮膚分泌的黏蛋白膠體屏障[10]。蝌蚪的發(fā)育是為陸地生活做準(zhǔn)備，而陸地環(huán)境中難以維持較厚且含水量高的黏液層，因而，這個(gè)黏液層隨著發(fā)育的進(jìn)程不斷變薄，這無(wú)疑會(huì)削弱免疫屏障。成體蛙依靠抗菌肽這一化學(xué)屏障來(lái)抵抗微生物的侵襲[24]。然而，物理屏障何時(shí)向化學(xué)屏障過(guò)渡，對(duì)于兩棲類(lèi)來(lái)說(shuō)非常關(guān)鍵的。生態(tài)因子的作用下，蝌蚪發(fā)育受阻或加速，如果其皮膚發(fā)育水平不能及時(shí)完成這一過(guò)渡，就會(huì)面臨著更高免疫風(fēng)險(xiǎn)[25]。

本研究發(fā)現(xiàn)，黑斑側(cè)褶蛙胚胎期(E期)和孵化進(jìn)入水體時(shí)(H期)，皮膚真皮層極薄，表皮僅有1—3層細(xì)胞。表皮層中有大量的分泌黏液的巨型細(xì)胞，來(lái)維持體表黏液層。直到T2期時(shí)，真皮和表皮下面的疏松層才顯著加厚，并出現(xiàn)較小的顆粒腺和黏液腺(圖2)，預(yù)示著T2期(對(duì)應(yīng)于Gosner 26期)是抗菌肽最早表達(dá)的時(shí)期?？咕牡臋z測(cè)驗(yàn)證了這一點(diǎn)(表3)。我們采用了10條上游引物檢測(cè)抗菌肽。這10條引物幾乎覆蓋了已知無(wú)尾兩棲類(lèi)各類(lèi)抗菌肽前體信號(hào)肽的保守區(qū)域[18]，理論上講，組織中只要有抗菌肽的轉(zhuǎn)錄就能夠檢測(cè)出來(lái)?？咕臋z測(cè)在E期、H期和T1期都是陰性，而到T2期才首次得到陽(yáng)性結(jié)果，并持續(xù)到幼蛙期。這說(shuō)明在黑斑側(cè)褶蛙的皮膚最早合成抗菌肽是在T2期。

蝌蚪孵化進(jìn)入水體后(H期)，主要依靠殘留的卵黃提供能量，到T1期時(shí)才開(kāi)始在小范圍內(nèi)覓食，到T2期的則可以大范圍自由移動(dòng)，消化道較T1期大幅度延長(zhǎng)(圖3)，以適應(yīng)采食浮游生物和植物性食物的需要。理論上講，T1期蝌蚪自主采食的同時(shí)，也開(kāi)始在腸道中建立微生物群落[26]。與此同時(shí)，為了防御微生物的侵襲，腸道組織也應(yīng)該開(kāi)始轉(zhuǎn)錄抗菌肽[27]。然而，我們雖然把T1期的蝌蚪整體提取總RNA，但是并未檢測(cè)出抗菌肽。組織學(xué)觀察表明，T1期蝌蚪的皮膚并沒(méi)有分泌抗菌肽的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(圖3)，說(shuō)明這一時(shí)期的蝌蚪腸道中也未建立足夠的抗菌肽免疫屏障，到T2期才在皮膚和腸道同時(shí)建立起抗菌肽免疫。

這一結(jié)果暗示，如果蝌蚪在胚胎期和蝌蚪期的發(fā)育因溫度和污染物等的影響出現(xiàn)加速或延遲發(fā)育[28-30]，如果其皮膚的發(fā)育未能與環(huán)境致病微生物群落的變化相匹配，則其皮膚免疫屏障的效能有可能受到影響，進(jìn)而影響到其生存。但是在氣候變化、環(huán)境污染等生態(tài)背景下，兩棲類(lèi)蝌蚪的先天性免疫會(huì)受多大程度的影響，這種影響在種群層面有哪些效應(yīng)，還需要進(jìn)一步研究。

我們?cè)诤诎邆?cè)褶蛙抗菌肽目前共發(fā)現(xiàn)有13個(gè)家族106種cDNA序列[31]，本研究在每個(gè)時(shí)期僅測(cè)定了少數(shù)陽(yáng)性克隆的序列，而未進(jìn)行全部測(cè)序。因此，各個(gè)時(shí)期檢出的抗菌肽只能說(shuō)明該時(shí)期有抗菌肽轉(zhuǎn)錄，所鑒定的抗菌肽家族數(shù)量和種類(lèi)不能代表該時(shí)期表達(dá)抗菌肽的多樣性。關(guān)于抗菌肽在各個(gè)發(fā)育時(shí)期的變化動(dòng)態(tài)以及免疫屏障的效能等問(wèn)題，也有待進(jìn)一步研究。