東北虎豹國家公園野生動物大腸埃希菌毒力與耐藥性研究

梁 冰 紀 雪 祝令偉 王鐵成 劉 軍 郭學(xué)軍 孫 洋

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室，長春，130122)

保護和拯救野生動物在全球備受關(guān)注，我國也在逐年加大對野生動物的保護力度。2016年11月，在全國人大常委會上制定了國家公園試點總體方案，計劃建立“青海三江源國家公園”和“東北虎豹國家公園”。2017年在長春正式成立了東北虎豹國家公園國有自然資源資產(chǎn)管理局、東北虎豹國家公園管理局。我國野生東北虎(Pantheratigrisaltaica)、東北豹(Pantherapardusorientalis)種群跨越吉林、黑龍江兩省，涉及兩個省份的多個林業(yè)局，主要以吉林省為主。大腸埃希菌(Escherichiacoli)是動物和人的腸道中常見的條件致病菌，可引起多種疾病，在自然生態(tài)中亦扮演著重要角色[1]。在我國，針對不同動物來源的大腸埃希菌研究有很多，但對于野生動物源大腸埃希菌的研究卻相對缺乏，有限的報道也是針對人工飼養(yǎng)繁育的野生動物。本研究為了解東北虎豹國家公園野生動物大腸埃希菌毒力及耐藥特征，采集吉林省6個林業(yè)局管轄區(qū)內(nèi)的東北虎等野生動物的糞便樣品，進行大腸埃希菌的分離與鑒定，獲得野生動物攜帶大腸埃希菌的本底數(shù)據(jù)，監(jiān)測致病性及耐藥性大腸埃希菌在野生動物腸道內(nèi)的流行情況，為闡明野生動物病原菌耐藥傳播規(guī)律提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 樣品來源

2016年從東北虎豹國家公園轄區(qū)內(nèi)琿春、天橋嶺、黃泥河、汪清等地，采集東北虎、東北豹、野豬(Susscrofa)、馬鹿(Cervuselaphus)、西伯利亞狍(Capreoluspygargus)、梅花鹿(Cervusnippon)、東北兔(Lepusmandshuricus)和花尾榛雞(Tetrastesbonasia)等野生動物的糞便樣品共234份。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

麥康凱瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自青島海博生物公司；E-test試紙條購自O(shè)XOID公司；2×TaqMasterMix試劑包購自康為世紀公司；Premix ExTaqVersion 2.0 plus dye和DNA分子量標準DL2000購自TaKaRa公司；瓊脂糖購自Genview公司。使用引物見表1，由吉林庫美生物科技有限公司合成。

表1 本研究所用PCR引物

續(xù)表1

1.3 主要儀器

全自動微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)(BD PhoenixTM-100)、比濁儀(Phoenix SpecTM)為美國BD公司生產(chǎn)。生物安全柜(1300A2)為美國Thermo公司生產(chǎn)，PCR擴增儀(ETC-811)為北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司生產(chǎn)，生化培養(yǎng)箱(LRH-70)為上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 大腸埃希菌的分離

稱取每份糞便樣品5 g，加入2 mL無菌生理鹽水，室溫振蕩10 min，靜止2 min，上清為菌懸液。吸取20 μL糞便生理鹽水菌懸液于麥康凱瓊脂平板，半板涂布半板劃線，(36±1) ℃培養(yǎng)16—18 h，觀察菌落形態(tài)，挑取疑似單菌落于麥康凱瓊脂平板二次分離純化。

2.2 模板制備

分離株接種于腦心培養(yǎng)液中，(36±1) ℃振蕩培養(yǎng)16—18 h。吸取400 μL培養(yǎng)液，12 000 r/min離心1 min，棄上清，菌體沉淀用100 μL無菌去離子水重懸，95 ℃加熱7 min，室溫冷卻后12 000 r/min離心1 min，取上清液作為PCR檢測的DNA模板。

2.3 大腸埃希菌鑒定

參考文獻[2]合成大腸埃希菌特異性16S rDNA引物(表1)。PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 預(yù)混酶12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃總延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄分析。PCR陽性大腸埃希菌分離株于BD PhoenixTM-100全自動微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)進行生化鑒定和藥敏檢測。

2.4 最小抑菌濃度(MIC)檢測

挑取大腸埃希菌的單菌落接種于2 mL MH肉湯培養(yǎng)液中，(36±1) ℃培養(yǎng)16—18 h，將增菌液稀釋至0.5麥氏比濁度備用。蘸取0.5麥氏比濁度的菌液在MH平板上均勻涂布。將四環(huán)素E-test試紙條放置于MH平板中央，(36±1) ℃培養(yǎng)16—18 h，參考CLSI標準(2018版)判定最小抑菌濃度MIC(minimal inhibitory concentration)。

2.5 四環(huán)素耐藥基因檢測

參考文獻[3-4]合成tetA、tetB、tetC、tetD、tetW和tetM6種耐藥基因引物(表1)。PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix預(yù)混酶12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃總延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.6 Eric-PCR指紋圖譜鑒定

參考文獻[5]合成引物ERIC-1(5′-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3′)和 ERIC-2(5′-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3′)。PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix預(yù)混酶12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火80 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄分析。

2.7 大腸埃希菌系統(tǒng)進化分群分析

參考文獻[6]合成ChuA、YjaA和TspE4.C23對引物(表1)。多重PCR反應(yīng)體系；Mix1 0.125 μL，Mix2 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，72 ℃總延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄分析。

2.8 大腸埃希菌毒力基因檢測

參考文獻[7]合成F41、LT、EAST1、Stx1、Stx2、eae、F6、F4、F5、F18、STa、Stx2e和STb等13對大腸埃希菌毒力基因，PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix預(yù)混酶12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補至25 μL。大腸埃希菌各毒力基因PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火45 s(表1)，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)，72 ℃總延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄分析。

3 結(jié)果

3.1 大腸埃希菌分離與鑒定結(jié)果

從234份陸生野生動物糞便樣品中，分離獲得40株疑似大腸埃希菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定和BD PhoenixTM-100全自動微生物鑒定，確定分離株均為大腸埃希菌，分離率為17.1%(40/234)。

3.2 大腸埃希菌藥敏檢測結(jié)果

通過BD PhoenixTM-100全自動微生物藥敏系統(tǒng)對40株大腸埃希菌進行藥敏檢測，有8株大腸埃希菌對四環(huán)素耐藥，耐藥率為20%(8/40)。

3.3 MIC檢測結(jié)果

利用四環(huán)素E-test試紙條對8株四環(huán)素耐藥大腸埃希菌進行檢測，MIC值如表2所示，最高抑菌濃度為128 μg/mL，最低抑菌濃度為32 μg/mL。四環(huán)素耐藥菌株均來源于東北虎和野豬。

表2 四環(huán)素耐藥大腸埃希菌分離株鑒定結(jié)果

3.4 ERIC-PCR結(jié)果

通過ERIC-PCR結(jié)果如圖1所示，40株大腸埃希菌分離株存在35種不同指紋圖譜。

圖1 大腸埃希菌ERIC-PCR鑒定結(jié)果(部分)Fig.1 ERIC-PCR identification results of Escherichia coli(partial) 注：M：DNA標準100 bp；1—12：大腸埃希菌分離株 Note：M，DNA marker 100 bp.1-12，Escherichia coli isolates

3.5 大腸埃希菌系統(tǒng)進化分群

40株野生動物源大腸埃希菌的系統(tǒng)進化分群結(jié)果顯示A群占7.5%(3/40)，B1群占30%(12/40)，B2群占15%(6/40)，D群占37.5%(15/40)，未知群占10%(4/40)，PCR結(jié)果如圖2所示。

圖2 大腸埃希菌ABD分群PCR結(jié)果(部分)Fig.2 PCR results of Escherichia coli on phylogenetic clustering(partial) 注：M：DNA標準100 bp；1—9：大腸埃希菌分離株；N：陰性對照 Note：M，DNA marker 100 bp.1-9，Escherichia coli isolates.N，negative

3.6 大腸埃希菌毒力基因檢測結(jié)果

對40株大腸埃希菌進行13種毒力基因檢測，有10株大腸埃希菌攜帶EAST1基因，攜帶率為25%(10/40)，其余毒力基因未檢出。

3.7 耐藥基因檢測結(jié)果

對8株四環(huán)素耐藥大腸埃希菌進行四環(huán)素耐藥基因檢測，僅檢測到tetA和tetB(表2)，未檢測到tetC、tetD、tetW和tetM耐藥基因。

4 討論

腸桿菌基因間共有重復(fù)序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC)分散在細菌的基因組中，保守性極強，不易突變。ERIC-PCR是在RAPD-PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對細菌基因組DNA進行指紋圖譜分析的一種方法，可用來區(qū)別不同種的細菌和同一種細菌的不同菌株[8]。本研究分離獲得的大腸埃希菌ERIC圖譜分散度高，同源性低，在40株分離株出現(xiàn)35種不同的指紋圖譜，說明不同物種野生動物之間菌群交換存在屏障。

大腸埃希菌是常見條件性致病菌之一，也是細菌群落在腸道微環(huán)境中獲得和傳遞毒力及耐藥相關(guān)遺傳元件的重要菌屬，大腸埃希菌的耐藥譜也是腸道菌群耐藥基因水平傳播評估的重要指標。本研究結(jié)果表明東北虎豹國家公園棲息的陸生野生動物攜帶大腸埃希菌耐藥情況并不嚴重，僅存在四環(huán)素耐藥表型并檢出相關(guān)耐藥基因，表明東北虎豹國家公園自然生態(tài)基本未受到人類畜牧養(yǎng)殖等活動的嚴重影響，但亦不能掉以輕心。Timonin等[9]對棲息于海島的加拿大野馬(Equuscaballus)做了類似的研究，大腸埃希菌分離率為28.7%(146/508)，97%的分離株對全部抗生素敏感，僅有4株(2.7%)對四環(huán)素耐藥，1株對β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。而與人類活動接觸更為密切的野生動物如鳥類、嚙齒類等通常耐藥與毒力元件攜帶率更高[10]。本研究檢出四環(huán)素耐藥株也多從與人類活動區(qū)域有交集的野豬分離獲得。

四環(huán)素作為臨床上常用的抗生素，在我國養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用，長期大量的使用不僅造成家畜體內(nèi)細菌四環(huán)素的耐藥水平增高，同時也對環(huán)境造成了嚴重的抗生素污染。王基偉[11]報道吉林地區(qū)豬源大腸埃希菌四環(huán)素耐藥率為83.63%，張瑜等[12]對延邊地區(qū)豬源大腸埃希菌四環(huán)素耐藥率為89%，而本研究中，野生動物大腸埃希菌對四環(huán)素的耐藥率為20%，相對于周邊養(yǎng)殖業(yè)對四環(huán)素的耐藥率，我國“東北虎豹國家公園”中野生動物源大腸埃希菌的耐藥情況較為樂觀，但耐藥菌四環(huán)素MIC值已高達128 μg/mL，需要加以關(guān)注。大腸埃希菌對四環(huán)素的耐藥機制主要以外排和核糖體保護機制為主[13]，本研究在8株具有四環(huán)素耐藥表型大腸埃希菌中分別檢出tetA和tetB基因，均為攜帶單一耐藥基因，這與國內(nèi)流行特點一致。

大腸埃希菌系統(tǒng)進化分群可分為A、B1、B2、D和未知群，其中B2群和D群為主要致病群[6]，腸道外大腸埃希菌感染主要以B2群為主[14]。本研究中D群占較大比例，其次為B1群、B2群和A群。D群和B2群所占比例為52.5%。其中25%的分離株檢出EAST1(enteroaggregativeEscherichiacoliheat-stable enterotoxin 1)毒力基因。EAST1為腸集聚性大腸埃希菌耐熱腸毒素，是一種小蛋白質(zhì)類毒素，與很多致病性大腸埃希菌家族有關(guān)聯(lián)[15]。EAST1(38aa)由astA基因編碼，編碼基因和免疫原性均與STa不同，該毒素通過激活腺苷環(huán)化酶發(fā)揮活性。astA毒力基因轉(zhuǎn)移通過插入序列IS1414實現(xiàn)，可在不同屬細菌間水平轉(zhuǎn)移，除了大腸埃希菌，在沙門氏菌(Salmonellaenterica)中也有發(fā)現(xiàn)[16]。

本研究對陸生野生動物源大腸埃希菌進行了初步研究，獲得了大腸埃希菌系統(tǒng)進化分群、毒力基因、耐藥表型、耐藥基因型及耐藥程度等的實驗結(jié)果，為進一步了解陸生野生動物攜帶致病性或耐藥性大腸埃希菌的情況提供了參考數(shù)據(jù)，為建立野生動物和人攜帶耐藥病原菌之間的流行病學(xué)關(guān)聯(lián)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。