黃地老虎成蟲對(duì)15種植物揮發(fā)物的電生理和行為反應(yīng)

李 琳，修春麗，路 偉，陸宴輝

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830091；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，杭州 310008)

0 引 言

【研究意義】黃地老虎Agrotissegetum(Denis et Schiffermüller)屬鱗翅目夜蛾科，幼蟲俗稱切根蟲、土地蠶等，在我國(guó)分布廣泛，其中華北、新疆、內(nèi)蒙古、甘肅、青海等地的發(fā)生比較嚴(yán)重[1]。黃地老虎是一種多食性害蟲，寄主植物多達(dá)100余種，主要危害棉花、小麥、玉米、高粱、馬鈴薯、甜菜、苜蓿、以及多種瓜類和蔬菜等作物。黃地老虎1～2齡幼蟲為害較輕，自3齡以上幼蟲為害逐漸加重，能咬斷幼苗近地面的莖部，造成作物整株死亡和田間缺苗斷壟。黃地老虎幼蟲晝伏夜出，白天生活在土壤中，夜晚出來取食為害，給防治帶來了很大的難度，亟待尋找和發(fā)展新的防治方法。【前人研究進(jìn)展】植食性昆蟲主要利用植物釋放的揮發(fā)性物質(zhì)來辨別寄主和非寄主、以及偏好寄主和普通寄主，植物揮發(fā)物在昆蟲寄主植物的選擇過程中常起著決定性作用[2-4]。每種植物的揮發(fā)物組分種類眾多，通過對(duì)吸引昆蟲的活性組分進(jìn)行鑒定、篩選與利用，可以研發(fā)昆蟲食誘劑產(chǎn)品及其行為調(diào)控措施[5]。目前，夜蛾、實(shí)蠅等多類害蟲的食誘劑已被成功研發(fā)[5,6]，并在棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)等一些重要害蟲的成蟲種群監(jiān)測(cè)與防治中取得明顯效果[7-9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在眾多寄主植物中，黃地老虎成蟲偏好在棉花、苘麻、芝麻、龍葵和灰藜等寄主植物上產(chǎn)卵，表現(xiàn)出了明顯的寄主偏好性[10-11]，但黃地老虎對(duì)寄主植物揮發(fā)物及其組分的電生理和行為反應(yīng)缺乏研究。【本研究切入點(diǎn)】遴選棉花、苘麻等黃地老虎寄主植物中常見的15種揮發(fā)性物質(zhì)，通過EAG測(cè)試黃地老虎雌性成蟲對(duì)每種物質(zhì)的電生理反應(yīng)，同時(shí)通過風(fēng)洞測(cè)定對(duì)各種物質(zhì)的選擇行為?！緮M解決的關(guān)鍵問題】測(cè)試黃地老虎雌性成蟲對(duì)不同揮發(fā)物的電生理以及行為反應(yīng)，驗(yàn)證植物揮發(fā)物在其寄主選擇中的重要功能，并篩選出對(duì)黃地老虎有顯著吸引作用的揮發(fā)性物質(zhì)，為研發(fā)成蟲食誘劑奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試?yán)ハx

黃地老虎為室內(nèi)種群，采用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所自行研制的人工飼料進(jìn)行繼代飼養(yǎng)，養(yǎng)蟲室條件為溫度(26±1)℃、濕度60%±10%RH、光照L∶D=14∶10 h。選擇形態(tài)完整且健康活躍的個(gè)體作為試蟲。

1.1.2 供試樣品

選用棉花、苘麻等黃地老虎寄主植物中常見的15種揮發(fā)物，列出各種揮發(fā)物及參照化合物正庚醛的標(biāo)準(zhǔn)樣品。表1

表1 供試化合物Table 1 Information on tested compounds

1.1.3 供試儀器

觸角電位儀EAG(Syntech，荷蘭)由電極固定器、觸角固定器PRG-2、探頭數(shù)據(jù)采集控制器 IDAC-2、氣味刺激控制裝置 CS-55 和觸角電位記錄顯示輸出裝置組成。

風(fēng)洞裝置為自行設(shè)計(jì)，由透明有機(jī)玻璃制成，長(zhǎng)210 cm、高90 cm、寬80 cm。氣流設(shè)定為0.3 m/s，周圍環(huán)境保持黑暗，僅開啟風(fēng)洞上方的紅光燈，室內(nèi)溫度保持(25±1)℃、濕度(60±5)%RH。

1.2 方 法

1.2.1 植物揮發(fā)物的EAG測(cè)試

用已知對(duì)地老虎類害蟲成蟲具有較好引誘作用的綠葉氣味物質(zhì)正庚醛作為參照[12]，進(jìn)行觸角電位反應(yīng)測(cè)定。將每種揮發(fā)物標(biāo)準(zhǔn)化合物分別配制為5個(gè)濃度梯度，依次為：100、10、1、0.1、0.01 ng/mL，配制100 ng/mL的稀釋液，依次稀釋10倍，配置完成其余濃度梯度的稀釋液。將配制完成的5種濃度梯度的稀釋液用移液槍取10 μL，分別滴加到對(duì)折的濾紙條(0.5 cm寬×5 cm長(zhǎng))上，之后迅速的把濾紙條放進(jìn)巴斯德玻璃滴管內(nèi)，兩端用錫箔紙封好，制備好觸角后作為刺激味源使用。滴加有100 ng/mL正庚醛的濾紙條做為參照，滴加10 μL石蠟油的濾紙條做為對(duì)照。

將2～4日齡活躍的黃地老虎成蟲凍暈后其置于解剖鏡下，用解剖剪沿黃地老虎單根觸角基部剪下。檢查觸角的完整性，觸角完整即可進(jìn)一步試驗(yàn)。用雙面刀片將此觸角尖端切去一小節(jié)，將參考電極(涂抹導(dǎo)電膠)與觸角基部連接，放置到EAG微操做臺(tái)上，將觸角的尖端與記錄電極的毛細(xì)管相連，EAG系統(tǒng)通過兩個(gè)電極中的銀絲相連通。將EAG微操作臺(tái)整體搬運(yùn)至氣相色譜玻璃管出樣口處，等待1～3 min直到觸角電位信號(hào)穩(wěn)定，開始記錄觸角電位反應(yīng)值。每頭黃地老虎先測(cè)試對(duì)照化合物(石蠟油)，然后測(cè)試參照化合物(正庚醛)，再測(cè)試供試揮發(fā)物，測(cè)試揮發(fā)物按照從低濃度到高濃度依次進(jìn)行測(cè)試，再對(duì)參照和對(duì)照化合物進(jìn)行刺激測(cè)試。將巴斯德滴管的尖端通過管壁上的小孔(距離管口約11 cm)插入到鋼管中(深度約為3 mm)，每次刺激時(shí)間為0.5 s，兩次刺激的間隔時(shí)間30 s，每個(gè)物質(zhì)各重復(fù)10次。

EAG儀器通過IDAC-2信號(hào)采集器與計(jì)算機(jī)相連。觸角距離鋼管口大約3 mm，600 ml/min的氣流經(jīng)過活性碳和加濕瓶進(jìn)入鋼管(長(zhǎng)度14 cm，內(nèi)徑8 mm)然后攜帶刺激源吹向觸角。試驗(yàn)過程中室內(nèi)溫度保持(25±2)℃，濕度(70±5)%RH。

1.2.2 植物揮發(fā)物的風(fēng)洞測(cè)定

將植物揮發(fā)物配置成濃度為100 μg/mL的稀釋液，用移液槍取10 μL配制好的溶液滴加到濾紙條(寬0.5 cm×長(zhǎng)5 cm)上，放置于裝置上風(fēng)口的試驗(yàn)臺(tái)上，試驗(yàn)臺(tái)高30 cm，距上風(fēng)端20 cm。試驗(yàn)用雌性成蟲單頭引入風(fēng)洞裝置下風(fēng)口的觀察記錄黃地老虎成蟲的起飛方向：逆風(fēng)(飛向滴有活性物質(zhì)的濾紙條)且越過裝置二分之一處，和順風(fēng)(遠(yuǎn)離滴有活性物質(zhì)的濾紙條)，并分別記錄試蟲選擇時(shí)間。若黃地老虎雌性成蟲靜止不動(dòng)3 min，或起飛后觸及風(fēng)洞任意壁且停留時(shí)間超過5 s即結(jié)束試驗(yàn)。每種物質(zhì)共測(cè)試60頭雌蟲，每組測(cè)試20頭，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在每種測(cè)試化合物刺激之前和之后，對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)化合物的EAG振幅值取平均值。然后根據(jù)公式(CT-CK)/(CF-CK)計(jì)算相對(duì)EAG響應(yīng)值，CT：被測(cè)刺激的EAG振幅值；CK：對(duì)照(石蠟油)的平均EAG振幅值；CF：參照物質(zhì)(正庚醛)的EAG平均振幅值。風(fēng)洞試驗(yàn)用X2檢驗(yàn)黃地老虎成蟲在兩個(gè)方向間是否呈假設(shè)H0為50：50的理論分布，計(jì)算X2的值和相應(yīng)的顯著性水平P值。在風(fēng)洞中靜止不動(dòng)的黃地老虎雌性成蟲不計(jì)入統(tǒng)計(jì)分析內(nèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃地老虎雌性成蟲對(duì)15種植物揮發(fā)物的電生理反應(yīng)

研究表明，黃地老虎雌性成蟲對(duì)4種測(cè)試植物揮發(fā)物均沒有明顯的EAG反應(yīng)，但對(duì)其余11種植物揮發(fā)物產(chǎn)生了較強(qiáng)的EAG反應(yīng)。黃地老虎雌性成蟲對(duì)癸烷、對(duì)乙基苯乙酮、2-甲基壬烷和3,3-二甲基辛烷未產(chǎn)生明顯的EAG反應(yīng)，且隨著揮發(fā)物濃度的增加，EAG相對(duì)反應(yīng)值基本沒有變化。黃地老虎雌性成蟲對(duì)1,2-二乙苯、1,4-二乙苯、丁酸丁酯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、桉葉油醇、乙酸葉醇酯、芳樟醇、β-月桂烯、壬醛、羅勒烯和β-蒎烯的EAG反應(yīng)隨著揮發(fā)物濃度的增加而增加，濃度較小時(shí)基本不產(chǎn)生電生理反應(yīng)，在最大測(cè)試濃度100 μg/ml時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)烈的電生理反應(yīng)，其中，黃地老虎雌成蟲對(duì)丁酸丁酯和壬醛的反應(yīng)相對(duì)于其它揮發(fā)物更強(qiáng)烈。圖1

注：1: 1,2-二乙苯; 2: 1,4-二乙苯; 3: 丁酸丁酯; 4: 癸烷; 5: 4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯; 6: 對(duì)乙基苯乙酮; 7: 桉葉油醇; 8: 乙酸葉醇酯; 9: 芳樟醇; 10: 2-甲基壬烷; 11: β-月桂烯; 12: 壬醛; 13: 3,3-二甲基辛烷; 14: 羅勒烯; 15: β-蒎烯

2.2 黃地老虎雌性成蟲對(duì)15種植物揮發(fā)物的行為反應(yīng)

研究表明，1,2-二乙苯、1,4-二乙苯、丁酸丁酯、癸烷、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、對(duì)乙基苯乙酮、桉葉油醇、乙酸葉醇酯、芳樟醇、β-月桂烯、壬醛、3,3-二甲基辛烷、羅勒烯和β-蒎烯14種寄主植物揮發(fā)物對(duì)黃地老虎雌蟲具有顯著的吸引作用，成蟲逆風(fēng)趨向供試揮發(fā)物的數(shù)量顯著高于順風(fēng)趨向?qū)φ帐炗偷臄?shù)量(1,2-二乙苯：X2=7.02，df=1，P=0.008；1,4-二乙苯：X2=3.88，df=1，P=0.049；丁酸丁酯：X2=8.82，df=1，P=0.003；癸烷：X2=7.02，df=1，P=0.008；4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯：X2=14.02，df=1，P<0.001；對(duì)乙基苯乙酮：X2=29.26，df=1，P<0.001；桉葉油醇：X2=4.34，df=1，P=0.037；乙酸葉醇酯：X2=4.50，df=1，P=0.034；芳樟醇：X2=6.28，df=1，P=0.012；β-月桂烯：X2=33.02，df=1，P<0.001；壬醛：X2=4.32，df=1，P=0.038；3,3-二甲基辛烷：X2=13.28，df=1，P<0.001；羅勒烯：X2=14.80，df=1，P<0.001；β-蒎烯：X2=13.26，df=1，P<0.001)。其中，β-月桂烯和對(duì)乙基苯乙酮在風(fēng)洞中對(duì)黃地老虎雌蟲的吸引力最強(qiáng)，在測(cè)試的60頭黃地老虎雌蟲中，分別有50頭和46頭雌蟲逆風(fēng)趨向β-月桂烯和對(duì)乙基苯乙酮。但2-甲基壬烷處理中，黃地老虎成蟲的趨向行為不明顯(X2=0.62，df=1，P=0.431)。圖2

注：1: 1,2-二乙苯; 2: 1,4-二乙苯; 3: 丁酸丁酯; 4: 癸烷; 5: 4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯; 6: 對(duì)乙基苯乙酮; 7: 桉葉油醇; 8: 乙酸葉醇酯; 9: 芳樟醇; 10: 2-甲基壬烷; 11: β-月桂烯; 12: 壬醛; 13: 3,3-二甲基辛烷; 14: 羅勒烯; 15: β-蒎烯

3 討 論

目前關(guān)于黃地老虎的研究，主要集中在生物學(xué)特性、發(fā)生與防治以及性信息素鑒定等方面[13-16]。試驗(yàn)通過EAG技術(shù)測(cè)試了黃地老虎雌性成蟲對(duì)棉花等主要寄主植物中幾種常見揮發(fā)物的觸角電生理反應(yīng)，并在風(fēng)洞中篩選出了對(duì)黃地老虎成蟲具有較強(qiáng)引誘作用的活性物質(zhì)，證實(shí)了黃地老虎成蟲對(duì)植物揮發(fā)物的嗅覺識(shí)別功能。Hallberg研究了黃地老虎成蟲觸角上的感器類型，共4種，其中包括在各種昆蟲中主要行使嗅覺識(shí)別功能的毛形感器和錐形感器[17]，為研究結(jié)果提供了直接證據(jù)。研究為黃地老虎植物源引誘劑及其行為調(diào)控技術(shù)的研發(fā)提供了理論依據(jù)并奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

EAG結(jié)果表明，黃地老虎雌性成蟲對(duì)一些植物揮發(fā)物的觸角電位值均隨濃度的升高而升高，這與許多鱗翅目其他昆蟲的研究結(jié)果相一致。例如，煙青蟲和棉鈴蟲對(duì)正己醇、(-)-里那醇等6 種植物揮發(fā)物的EAG劑量反應(yīng)，均隨著刺激物質(zhì)濃度的增大而增強(qiáng)[18]；雌性桃蛀螟觸角對(duì)玉米花絲氣味物質(zhì)1-己醇、1-庚醇、β-蒎烯和β-紫羅酮的EAG反應(yīng)隨濃度的增加，反應(yīng)強(qiáng)度增加迅速[19]。昆蟲的觸角離體后，隨時(shí)間的推移觸角活性會(huì)逐漸下降，因此本試驗(yàn)挑取活躍的黃地老虎成蟲進(jìn)行觸角電位試驗(yàn)，剪下后立即進(jìn)行EAG測(cè)試，保證觸角的活性。在進(jìn)行EAG試驗(yàn)時(shí)，觸角反應(yīng)的絕對(duì)值受多種因素的影響，如載氣流速、溫度、前次反應(yīng)對(duì)后次反應(yīng)、樣品管與觸角之間的距離等因素的影響。試驗(yàn)中采用參照物質(zhì)正庚醛標(biāo)定觸角的活性，測(cè)試得到的觸角電位值是對(duì)于參照物質(zhì)的相對(duì)值，可以有效地消除上述因素的影響。

風(fēng)洞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)乙基苯乙酮、癸烷和3,3-二甲基辛烷對(duì)黃地老虎雌性成蟲的引誘能力明顯，而EAG測(cè)試時(shí)不能引起黃地老虎成蟲觸角明顯的電位反應(yīng)。電生理和行為反應(yīng)的不一致的現(xiàn)象，在植食性昆蟲的嗅覺研究中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)[20-22]。昆蟲對(duì)植物揮發(fā)物的反應(yīng)行為常受到自身生理狀況、環(huán)境因素等各方面因素的綜合影響，這往往是兩者結(jié)果不一致的原因所在。除對(duì)乙基苯乙酮、癸烷和3,3-二甲基辛烷外，黃地老虎對(duì)其余物質(zhì)情況的EAG反應(yīng)強(qiáng)度和風(fēng)洞行為趨性基本一致。黃地老虎雌性成蟲對(duì)不同揮發(fā)物的風(fēng)洞試驗(yàn)中，觀察到多數(shù)逆風(fēng)飛向測(cè)試物質(zhì)一側(cè)，但很少降落在引誘物質(zhì)上，可能是由于測(cè)試的是單一活性物質(zhì)，對(duì)成蟲的引誘能力不如植物本身釋放的多組分揮發(fā)物。不同揮發(fā)物組分之間可能存在著增效等不同作用，有待進(jìn)一步研究，另外還需進(jìn)行單一和混配活性物質(zhì)的田間引誘效果驗(yàn)證，這更有助于對(duì)吸引效果的確認(rèn)和評(píng)估。

另外，顏色、大小和輪廓等固有性質(zhì)也是影響昆蟲辨別植物的強(qiáng)烈信號(hào)，昆蟲能夠利用這些視覺信號(hào)搜索寄主；遠(yuǎn)距離時(shí)，昆蟲主要依靠植物輪廓定位寄主，近距離時(shí)，寄主的大小，顏色和形狀發(fā)揮重要作用[23,24]。顏色信號(hào)在黃地老虎寄主選擇行為的作用與功能，同樣值得進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

通過EAG測(cè)試黃地老虎雌性成蟲對(duì)棉花等主要寄主植物中常見的15種揮發(fā)物組分的電生理反應(yīng)，對(duì)1,2-二乙苯、1,4-二乙苯、丁酸丁酯、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、桉葉油醇、乙酸葉醇酯、芳樟醇、β-月桂烯、壬醛、羅勒烯和β-蒎烯產(chǎn)生了明顯反應(yīng)，對(duì)測(cè)試的最大濃度100 μg/mL的反應(yīng)最強(qiáng)烈。利用風(fēng)洞測(cè)定黃地老虎雌性成蟲對(duì)15種植物揮發(fā)物的行為選擇，其中1,2-二乙苯、1,4-二乙苯、丁酸丁酯、癸烷、4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、對(duì)乙基苯乙酮、桉葉油醇、乙酸葉醇酯、芳樟醇、β-月桂烯、壬醛、3,3-二甲基辛烷、羅勒烯和β-蒎烯對(duì)成蟲有顯著的引誘作用。