載他克莫司可注射溫敏型水凝膠促牙周組織再生的研究

陳 希， 任春霞， 劉莉莉， 陳雨蒙，鄭夢(mèng)丹， 崔家森， 盧金金， 孫宏晨,

（1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院病理科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130021；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔病理科，遼寧 沈陽110001；4.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科，吉林 長(zhǎng)春130021；5.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院兒童口腔科，吉林 長(zhǎng)春130021）

牙周炎是一種由微生物和宿主免疫系統(tǒng)之間相互作用引起的慢性炎癥性疾病。該疾病不僅能破壞牙齒的支持結(jié)構(gòu)（牙齦、牙周膜及牙槽骨），導(dǎo)致牙齒松動(dòng)脫落，同時(shí)也與全身系統(tǒng)性疾病關(guān)系密切[1-2]?，F(xiàn)有的牙周治療手段，如牙周基礎(chǔ)治療、翻瓣術(shù)及自體骨移植術(shù)等僅能減小牙周袋和根分叉損害的探診深度，無法實(shí)現(xiàn)牙周組織的完全恢復(fù)[3-4]。因此，臨床上亟須開發(fā)具有促進(jìn)牙周組織再生作用的新型牙周炎治療制劑。

FK506也稱他克莫司（tacrolimus），是從鏈霉菌屬中提取出來的一種抗生素，也是臨床常用的強(qiáng)效免疫抑制劑[5]。目前的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506具有抗炎，促進(jìn)骨形成和骨缺損修復(fù)的作用[6-7]。由于抗炎與促進(jìn)骨形成是促進(jìn)牙周組織完全恢復(fù)的關(guān)鍵靶點(diǎn)[8]。因此，這些研究提示FK506在牙周炎的治療中具有良好的應(yīng)用前景。

選擇合適的載體是提高藥物效率的關(guān)鍵[9]。水凝膠作為應(yīng)用較廣泛的藥物載體，可被制成可注射劑型?？勺⑸湫退z具有臨床操作簡(jiǎn)便，注射所需創(chuàng)口小，液體狀態(tài)下具有流動(dòng)性以充填于不規(guī)則組織缺損腔隙等諸多優(yōu)點(diǎn)[10-12]。此外，該載體具有藥物緩釋性能，能夠?qū)崿F(xiàn)長(zhǎng)期、持續(xù)、少量給藥，使所包載的藥物穩(wěn)定、持續(xù)、高效地在局部釋放，并發(fā)揮作用[13]。

本研究擬制備載FK506可注射溫敏型水凝膠，研究其物理性能。采用大鼠牙周炎模型，研究其促牙周組織再生的功能；并通過體外細(xì)胞研究，探討該制劑的生物安全性，以期為FK506在牙周炎治療的臨床應(yīng)用中提供參考。

1 材料和方法

1.1 載FK506水凝膠的制備及形態(tài)觀察

殼聚糖（CS）、β-甘油磷酸鈉、明膠、FK506均購自美國Sigma-Aldrich公司。取5 mg FK506粉劑，溶于0.1 mL的無菌二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）中，配置成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的FK506儲(chǔ)存液，用無菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）將FK506儲(chǔ)存液稀釋至3.27μg/mL，備用。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%CS、56%β-甘油磷酸鈉溶液（含20μg/mL的FK506）及0.5%明膠水溶液按照不同體積比（10∶2∶0.25）磁力攪拌并振蕩混勻，調(diào)節(jié)pH至7.0。密封后置于37℃水浴恒溫箱中孵育，待其形成固態(tài)凝膠后冷凍干燥，掃描電鏡（JEOL公司，日本）下觀察其顯微結(jié)構(gòu)。

1.2 大鼠牙周炎模型建立

將50只雄性Wistar大鼠（體質(zhì)量180~220 g，6~7周齡，清潔級(jí)，購自吉林大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）隨機(jī)分為5組，每組10只。實(shí)驗(yàn)分組：空白組（正常Wistar大鼠，未建模）、牙周炎組（放置結(jié)扎絲）、牙周炎+水凝膠組（放置結(jié)扎絲，同期注射水凝膠）、牙周炎+載FK506水凝膠組（放置結(jié)扎絲，同期注射載FK506水凝膠，F(xiàn)K506質(zhì)量濃度：3.27μg/mL）及牙周炎+FK506組（放置結(jié)扎絲，同期注射FK506溶液，F(xiàn)K506質(zhì)量濃度：3.27μg/mL）。Wistar大鼠經(jīng)10%水合氯醛（20 mg/kg）麻醉；置結(jié)扎絲于大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙與第二磨牙之間，并將結(jié)扎絲環(huán)繞上頜第一磨牙牙頸部1圈[14]；同期分別注射25μL相應(yīng)溶液至結(jié)扎絲所在牙位牙槽嵴頂?shù)酿す悄は?。常?guī)動(dòng)物復(fù)蘇及飼養(yǎng)。藥物注射頻率為每3天1次，持續(xù)2周。

1.3 Micro-CT圖像分析

全麻狀態(tài)下，用4%多聚甲醛心臟灌流固定后，取大鼠雙側(cè)上頜骨置于4%多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定24 h。采用Micro-CT進(jìn)行掃描（電流：114 mA；電壓：70 kV；曝光時(shí)間：0.3 s）。選定感興趣區(qū)域（region of interest，ROI），測(cè)量上頜第一磨牙和第二磨牙間的牙槽骨區(qū)域。測(cè)量的相應(yīng)參數(shù)：骨礦物質(zhì)密度（bone mineral density,BMD）；組織礦物質(zhì)密度（tissue mineral density,TMD）；骨體積分?jǐn)?shù) （bone volume/total volume,BV/TV）；骨小梁厚度（trabecular thickness,Tb.Th）；骨小梁數(shù)目（trabecular number,Tb.N）；骨小梁分離度（trabecular separation,Tb.Sp）。

1.4 形態(tài)學(xué)分析

將上頜骨標(biāo)本置于10%的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脫鈣，梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片（切片厚度為3.0μm）。常規(guī)HE染色，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察炎性細(xì)胞的分布和牙周組織的再生效果。

1.5 免疫組織化學(xué)分析

取3.0μm石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，于枸櫞酸鈉緩沖液中進(jìn)行微波抗原修復(fù)；PBS沖洗3次，每次5 min，3%過氧化氫溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min；PBS沖洗3次，每次5 min，滴加山羊血清置室溫封閉1 h，滴加兔抗大鼠MMP-9（1∶500）、兔抗大鼠COX-2（1∶500）抗體，4℃孵育過夜；PBS沖洗3次，每次5 min，滴加生物素標(biāo)記的二抗置室溫孵育10 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素生物素溶液置室溫孵育20 min；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine,DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察、拍照。

1.6 MTT法檢測(cè)載FK506水凝膠對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

Wistar大鼠處死后取股骨，采用全骨骨髓法提取、分離并培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）[15]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：空白組、水凝膠組、載FK506水凝膠組及FK506組。采用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)（0.4μm孔徑，6孔板，美國Costar公司），在小室內(nèi)注入水凝膠，置于37℃、5% CO2的孵箱內(nèi)，待其凝固。將消化收集的第3代BMSCs以2×105個(gè)/孔的密度接種于Transwell下室中。共培養(yǎng)48 h后，移走上層小室，加入MTT（200μL/孔）至下室，終質(zhì)量濃度為5 mg/mL。37℃孵育4 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入1.5 mL二甲基亞砜（DMSO）混勻，酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)技術(shù)有限公司）測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 10.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各實(shí)驗(yàn)組和空白組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水凝膠的形貌表征觀察

采用Nano measure軟件分析得出，以CS、β-甘油磷酸鈉、明膠為原料的可注射溫敏型水凝膠的孔徑均等，平均直徑為40～80μm。該水凝膠有利于細(xì)胞爬入、營養(yǎng)物質(zhì)吸收和細(xì)胞代謝廢物排出。

2.2 載FK506水凝膠促牙周組織再生作用

本研究采用Micro-CT檢測(cè)大鼠上頜骨磨牙區(qū)牙槽骨的修復(fù)情況（圖1）。釉牙骨質(zhì)界與牙槽嵴頂（cementoenamel junction to the alveolar bone crest,CEJ-ABC）之間的垂直距離增加表示牙槽骨破壞。實(shí)驗(yàn)2周后，牙周炎組CEJ-ABC平均距離比空白組大50%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。該結(jié)果表明我們成功地建立了牙周炎模型；牙周炎+水凝膠組和牙周炎+FK506組的CEJ-ABC平均距離仍大于空白組，但與牙周炎組相比，CEJ-ABC平均距離已下降；經(jīng)載FK506水凝膠處理2周后，CEJ-ABC平均距離與空白組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖2。

Micro-CT定量分析顯示，與空白組相比，我們觀察到牙周炎組BMD（P＜0.001）、TMD明顯減?。≒＜0.01），BV/TV明顯降低（P＜0.01），Tb.Th也有所降低（P＜0.05），Tb.N無明顯變化，Tb.Sp增加（P＜0.01）。以上數(shù)據(jù)表明我們成功建立了大鼠牙周炎模型，結(jié)扎絲的機(jī)械刺激及炎癥因素等導(dǎo)致ROI骨組織明顯破壞。與牙周炎組相比，牙周炎+水凝膠組及牙周炎+FK506組的TMD和BV/TV顯著增加（P＜0.05），其中牙周炎+水凝膠組Tb.Sp有所降低，但差異不明顯。這表明單獨(dú)應(yīng)用水凝膠或者FK506可以在一定程度上緩解牙槽骨破壞的嚴(yán)重程度。此外，水凝膠與FK506聯(lián)合應(yīng)用后（牙周炎+載FK506水凝膠組），其BMD比牙周炎組明顯增大（P＜0.05），TMD增 加33.3%（P＜0.05），BV/TV增 加240%（P＜0.05），Tb.Sp減少55.9%（P＜0.001），Tb.N增加81%（P＜0.001），Tb.Th無明顯變化。這些結(jié)果表明，負(fù)載FK506的水凝膠可以有效地協(xié)同抑制炎癥并促進(jìn)牙周組織再生。詳見圖3。

圖1 Micro-CT掃描結(jié)果顯示牙槽骨再生情況Figure 1 Micro-CT images showing regeneration of the alveolar bone

圖2各組CEJ至ABC的距離比較Figure 2 Quantitative comparison on the distance from CEJ to ABC

2.3 組織學(xué)分析結(jié)果

應(yīng)用HE染色法評(píng)估炎癥狀況和牙周膜再生情況。如圖4A～4C所示，空白組牙周組織結(jié)構(gòu)清晰，結(jié)合上皮緊貼牙釉質(zhì)表面，牙周纖維排列整齊，牙骨質(zhì)完整，牙周組織內(nèi)未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或牙槽骨吸收。然而在牙周炎組（圖4D～4F），上頜第一磨牙和第二磨牙牙間乳頭消失，結(jié)合上皮向牙根部遷移形成深牙周袋，牙周纖維結(jié)構(gòu)紊亂，牙骨質(zhì)中可見吸收性凹坑，牙周組織中可以看到大量中性粒細(xì)胞及少量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)，牙槽骨吸收至根尖附近。這些結(jié)果表明我們成功地建立了大鼠牙周炎模型。與牙周炎組相比，牙周炎+水凝膠組（圖4G～4I）及牙周炎+FK506組（圖4M～4O）的牙槽骨破壞程度減弱，并可見清晰的嗜堿性反折線，牙周組織內(nèi)可見少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。在牙周炎+載FK506水凝膠組（圖4J～4L）中，幾乎沒有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或牙槽骨破壞，牙骨質(zhì)完整，并且可以在根叉區(qū)及上頜第一磨牙與第二頜磨牙之間看到新生骨組織，牙周狀況與空白組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HE染色結(jié)果顯示，F(xiàn)K506與可注射溫敏型水凝膠聯(lián)合應(yīng)用（牙周炎+載FK506水凝膠組）可以有效地控制炎癥，促進(jìn)牙周組織再生。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中由于結(jié)扎線的刺激，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的牙間乳頭和結(jié)合上皮并未完全恢復(fù)。

圖3各組Micro-CT相關(guān)參數(shù)比較Figure 3 Comparison of Micro-CT related parameters of each group

圖4牙周組織HE染色結(jié)果Figure 4 HE staining of the periodontium

為了進(jìn)一步研究載FK506水凝膠的抗炎作用，我們采用免疫組織化學(xué)染色法觀察牙周組織中炎癥因子COX-2和MMP-9的表達(dá)水平。與空白組相比，牙周炎組的牙周組織中有大量COX-2和MMP-9陽性細(xì)胞，牙周炎+水凝膠組和牙周炎+FK506組的COX-2和MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)量略有下降，但仍高于空白組；然而在牙周炎+載FK506水凝膠組中只有散在分布的COX-2和MMP-9陽性細(xì)胞，這表明水凝膠緩釋FK506有效地控制了牙周組織炎癥。詳見圖5。

圖5牙周組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（X400）Figure 5 Immunohistochemical staining results of the periodontal tissue（X400）

2.4 載FK506水凝膠對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

MTT結(jié)果表明，水凝膠及其負(fù)載藥物FK506與BMSCs細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞增殖趨勢(shì)略有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖6）。此結(jié)果表明水凝膠及其負(fù)載藥物不會(huì)引起細(xì)胞毒性或抑制細(xì)胞增殖。

圖6 MTT法檢測(cè)載FK506水凝膠對(duì)BMSCs增殖活性的影響Figure 6 The effect of FK506-containing hydrogel on the proliferation of BMSCs by MTT method

3 討論

牙周炎是菌斑微生物與宿主免疫系統(tǒng)間復(fù)雜的相互作用所致的炎癥性疾病。由牙周炎引起的牙槽骨吸收是成人失牙的首要原因，牙周炎會(huì)影響人們的面容美觀，營養(yǎng)吸收甚至心理健康。現(xiàn)有的牙周治療手段僅能減小牙周袋和根分叉損害的探診深度，部分恢復(fù)牙周附著，遭到破壞的牙周組織無法完全恢復(fù)其生理結(jié)構(gòu)和功能。牙周炎治療的關(guān)鍵一方面是抑制牙周炎癥，另一方面是促進(jìn)牙周組織再生，而現(xiàn)有的治療方法很難同時(shí)實(shí)現(xiàn)這兩方面的要求。因此，尋找一種既能控制牙周炎癥，并能進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)牙周組織再生與修復(fù)的治療手段仍是該領(lǐng)域面臨的難題。

牙周炎發(fā)生、發(fā)展過程中，在以牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）、脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）為主介導(dǎo)的病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecule patterns,PAMPs）作用下[16]，外周血和齦溝中的中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體被激活，釋放大量的前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）[17]。PGE2通過促進(jìn)核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappaB ligand,RANKL）表達(dá)并抑制骨保護(hù)素（osteoprotegerin,OPG）表達(dá)從而對(duì)破骨細(xì)胞的形成起到積極作用。因此，抑制炎性因子如PGE2和MMPs的分泌對(duì)于控制牙周炎具有重要作用。研究表明，F(xiàn)K506可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）的活性來減少M(fèi)MPs的產(chǎn)生[18]，通過抑制炎性細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）來減少PGE2的產(chǎn)生[19]，進(jìn)而抑制RANKL的表達(dá)，從而阻止破骨細(xì)胞的分化并控制牙槽骨的吸收。同時(shí)COX-2作為催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的限速酶,在炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)環(huán)節(jié)具有關(guān)鍵作用[20]。本研究中，我們用結(jié)扎線模擬人的牙結(jié)石，促進(jìn)牙菌斑的積累并引起牙周組織炎癥。HE染色結(jié)果顯示，經(jīng)過載FK506水凝膠處理2周后，牙周組織炎癥反應(yīng)明顯減輕。同時(shí)，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，牙周炎+載FK506水凝膠組中只有散在的COX-2和MMP-9陽性細(xì)胞，這證實(shí)了FK506在牙周炎治療中的抗炎作用。

近年來已有諸多研究發(fā)現(xiàn)FK506在促進(jìn)骨組織再生中起重要作用[6-7]。我們目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牙周炎+載FK506水凝膠組與空白組CEJ-ABC平均距離及Micro-CT測(cè)得的相關(guān)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明FK506在控制炎癥微環(huán)境的基礎(chǔ)上還可以促進(jìn)牙槽骨的再生。

綜上所述，載FK506可注射溫敏型水凝膠可以有效地控制牙周組織炎癥，減輕牙槽骨的破壞程度，在牙周組織再生中具有良好的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。