缺磷培養(yǎng)下黑木相思苗木的生理生化響應(yīng)

裘珍飛 范春節(jié) 曾炳山

( 中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520)

黑木相思（Acacia melanoxylon）原產(chǎn)于澳大利亞南部，是相思類最高大喬木之一，具有固氮、速生、材質(zhì)優(yōu)良，且有一定的耐干旱、耐瘠薄、耐寒冷等特點(diǎn)。20 世紀(jì)90年代引進(jìn)我國后，通過系統(tǒng)選育，獲得生長迅速、樹干通直、木紋美麗和耐寒性強(qiáng)的優(yōu)良無性系，并在我國華南地區(qū)推廣應(yīng)用，種植規(guī)模日益擴(kuò)大，現(xiàn)已成為速生豐產(chǎn)，珍貴用材和生態(tài)公益等多用途樹種[1]。由于我國南方土壤普遍呈酸性，有效磷（P）含量低，經(jīng)營人工林時(shí)因缺P 影響生長量[2]。生產(chǎn)中通過加施P 肥提高植物可利用P 水平，但過度的P 施用會(huì)導(dǎo)致成本增加、水土污染、P 礦資源枯竭等社會(huì)和環(huán)境問題[3]。因此，研究P 脅迫對(duì)苗木生長和養(yǎng)分含量及相關(guān)生理指標(biāo)的影響，對(duì)了解黑木相思適應(yīng)P 脅迫的機(jī)制和栽培中P 養(yǎng)分的調(diào)控都具有重要的科學(xué)意義。

植物長期處在P 脅迫下，其形態(tài)、營養(yǎng)吸收和分配、生理生化及光合性能等均會(huì)發(fā)生適應(yīng)性變化[4]。研究表明低P 脅迫下，植物的地上部干物質(zhì)量降低，根系體積和表面積增加，從而引起根冠比、比根長等指標(biāo)的增加[5-6]；也引起植物體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等保護(hù)酶系統(tǒng)的抗氧化脅迫反應(yīng)[7-8]；P 脅迫影響葉片中光合色素含量及光能利用能力和效率[9-10]；長時(shí)間和重度P 脅迫造成植物新陳代謝紊亂，引起體內(nèi)養(yǎng)分吸收失去平衡，改變植物體內(nèi)化學(xué)組分[11-12]。P 脅迫下作物如何響應(yīng)和適應(yīng)一直是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一。目前，黑木相思的研究主要集中在選育和繁育上，有關(guān)P 脅迫下，黑木相思地上部及根系形態(tài)的變化；內(nèi)部產(chǎn)生的生理生化響應(yīng)機(jī)制及根、莖、葉各器官對(duì)養(yǎng)分吸收和利用的影響等相關(guān)內(nèi)容尚未見研究。本試驗(yàn)旨在揭示黑木相思適應(yīng)P 脅迫的機(jī)制，為我國華南地區(qū)的黑木相思高效栽培和P 肥的科學(xué)合理施用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以黑木相思組培苗為材料，選取生長統(tǒng)一的生根瓶苗（苗高（2.71±0.08） cm，全株鮮物質(zhì)量（0.033±0.01） g），培養(yǎng)在海綿支撐的育苗盤中，每盤種植20 株，盤內(nèi)澆灌營養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置全P 處理澆灌Hoagland’s 全營養(yǎng)液[13]，缺P 處理澆灌Hoagland’s 營養(yǎng)液中不添加KH2PO4（136 mg/L），但加入KCl（74.5 mg/L）用于平衡鉀離子，其他營養(yǎng)液元素組成不變。整個(gè)試驗(yàn)在熱帶林業(yè)研究所溫室中進(jìn)行，每處理3 盤，共6 盤，培養(yǎng)3個(gè)月后測定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2 測定方法

生物量、根系形態(tài)及養(yǎng)分測定。每盤隨機(jī)抽取苗木10 株，每處理共30 株，小心清除根部海綿支撐物，測量苗高和苗桿直徑，并記錄每苗葉片數(shù)，稱重全株鮮物質(zhì)量。把植株分成根、莖、葉3 部分，根系采用ScanMaker i800plus 彩色平臺(tái)掃描儀（上海中晶科技，中國）掃描圖片，經(jīng)相應(yīng)軟件分析后獲得根系形態(tài)參數(shù)。收集上述根、莖、葉，在 105 ℃恒溫烘干箱中殺青30 min，后在70 ℃下烘干至質(zhì)量恒定，分別稱量根、莖、葉的干物質(zhì)量。利用烘干的樣品，采用凱氏滴定法測定全氮（N）含量，采用鉬銻抗比色法測定全P 含量，采用火焰原子吸收分光光度法[14]測定全鉀（K）含量。按公式（1）～（3）計(jì)算根冠比、養(yǎng)分利用效率、養(yǎng)分積累量。

葉綠素含量測定。稱取葉片0.2 g，碾磨后用80%丙酮萃取、過濾、洗滌至葉子碎片無色，定容50 mL，采用UV-120 分光光度計(jì)（津島，日本）測定[15]。

氧化酶活性測定。稱取葉片0.2 g，加0.1 mol/LPH 為7.4 的磷酸緩沖液于冰水浴條件下制備成10%組織勻漿，用Allegra X-30 R 高速冷凍離心機(jī)（Beckman Coulter，美國）離心20 min，設(shè)置溫度為4 ℃，轉(zhuǎn)速10 000 r/min，靜置后取上清液測定氧化酶活性，采用氮藍(lán)四唑法測定SOD 活性，采用紫外吸收法測定CAT 活性，采用愈創(chuàng)木酚法[16]測定POD 活性。

光合參數(shù)測定。采用LI-6800 型便攜式光合測定儀（LI-COR，美國）測定葉片凈光合速率（A）等光合參數(shù)。全P 和缺P 處理各選取4 株苗木，每苗木固定1 片中部的成年葉作為測定對(duì)象，測定時(shí)間為9：00—11：00。采用光合測定儀自帶的光源控制光合有效輻射（PAR）分別為1 800、1 500、1 200、1 000、800、600、400、200、100、50、25、0 μmol/（m2·s），共12個(gè)水平。由于黑木相思成年葉為狹窄葉，按照實(shí)際被夾在葉室中的葉面積對(duì)測定的A進(jìn)行換算，依據(jù)光響應(yīng)曲線的經(jīng)典Farquhar 模型[17]進(jìn)行擬合，獲得光補(bǔ)償點(diǎn)（LCP）、光飽和點(diǎn)（LSP）、最大凈光合速率（Amax）、表觀量子效率（AQY）及暗呼吸速率（Rd）等光合參數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 16.0 進(jìn)行方差分析及差異顯著性檢驗(yàn)，用Excel 2007 處理圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺P 對(duì)黑木相思形態(tài)和生長的影響

由圖1 可知，與全P 處理相比較，從外觀上看，缺P 處理下，苗木地上部分生長明顯細(xì)弱，葉片稀疏，而根系部分相對(duì)發(fā)達(dá)，特別是細(xì)根增多。由表1 可知，缺P 處理下，葉片數(shù)和苗桿直徑極顯著下降（P＜0.01），苗高和全株鮮物質(zhì)量顯著下降（P＜0.05），而根鮮物質(zhì)量和干物質(zhì)量無顯著變化，根冠比以缺P 處理極顯著高于全P 處理（P＜0.01）。

圖1 全P 和缺P 處理下黑木相思苗木生長形態(tài)Fig. 1 Growth morphology of A. melanoxylon seedlings under normal P and P deficiency

表1 全P 和缺P 處理下黑木相思苗木生長狀況Table 1 Growth status of A. melanoxylon seedlings under normal P and P deficiency

2.2 缺P 對(duì)黑木相思根系形態(tài)參數(shù)的影響

由表2 可知，缺P 處理下黑木相思苗木總根長極顯著高于全P 處理（P＜0.01），增加了22.6%，而根的平均直徑以全P 處理極顯著大于缺P 處理（P＜0.01），總根表面積和體積以缺P 處理略大于全P 處理，但處理間無顯著差異，表明黑木相思苗木通過增加須根量，保持根的表面積和體積來適應(yīng)缺P 環(huán)境。

表2 全P 和缺P 條件下黑木相思苗木根系形態(tài)參數(shù)Table 2 Root parameters of A. melanoxylon seedlings under normal P and P deficiency

2.3 缺P 對(duì)黑木相思氧化保護(hù)酶活性的影響

由表3 可知，對(duì)比全P 處理，缺P 處理在葉片和根系中SOD、POD、CAT 活性均顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）升高。3 種酶活性升高幅度以葉片中的POD、CAT 較大，增幅達(dá)113.7%和473.3%，葉中SOD 及根系中的3 種酶活性增幅為26.7%～70.4%。

表3 全P 和缺P 培養(yǎng)下黑木相思根和葉中SOD、POD 和CAT 活性Table 3 SOD， POD and CAT activity of leaves and roots of A. melanoxylon seedlings under normal P and P deficiency U/mg

2.4 缺P 對(duì)黑木相思葉片光合參數(shù)的影響

由圖2 可知，在PAR 強(qiáng)度范圍內(nèi)，缺P 處理下的A低于全P 處理，隨著PAR 增強(qiáng)，2 種處理A的差值逐漸加大。通過擬合光響應(yīng)曲線，獲得的光響應(yīng)特征參數(shù)比較（表4），缺P 處理的LSP 比 全P 降 低652.8 μmol/（m2·s），LCP 提 高14.4 μmol/（m2·s），AQY 降 低33.33%，Amax降低20.21 %，而Rd兩者間差異不顯著。

圖2 全P 和缺P 條件下黑木相思葉片光響應(yīng)曲線Fig. 2 Light response curves of A. melanoxylon seedlings leaves under normal P and P deficiency

表4 全P 和缺P 條件下黑木相思葉片光合作用參數(shù)Table 4 Photosynthetic parameters of A. melanoxylon seedlings leaves under normal P and P deficiency

2.5 缺P 對(duì)黑木相思葉綠素含量的影響

由圖3 可知，缺P 處理下，葉綠素a、b 含量及葉綠素總量顯著低于全P 處理（P＜0.05），其中葉綠素b 下降幅度達(dá)21.82%，葉綠素a 降幅為17.07%，葉綠素總量降幅為18.38%。

圖3 全P 和缺P 條件下黑木相思苗木葉綠素含量Fig. 3 Chlorophyll content of A. melanoxylon seedlings leaves under normal P and P deficiency

2.6 缺P 對(duì)黑木相思各器官全N、全P、全K 含量的影響

由表5 可知，缺P 處理下，葉片中全N、全P 和全K 的含量極顯著低于全P 處理（P＜0.01），莖中全P 和全K 的含量極顯著低于全P 處理（P＜0.01），而全N 含量缺P 處理顯著低于全P 處理（P＜0.05），根中全N 含量在2個(gè)處理間差異不顯著，而全P 和全K 存在極顯著（P＜0.01）和顯著差異（P＜0.05）。說明缺P 條件下除了根對(duì)N 的吸收不受影響外，根對(duì)P 和K 及莖、葉對(duì)N、P 和K 的吸收和儲(chǔ)存都受到顯著影響。其中影響最大的是根和莖中的全P 含量，缺P 處理比全P 分別降低了82.9%和86.8%，葉片中的全P 含量降低了59.7%，根、莖、葉中N 含量缺P 處理比全P 降低了9.3%～19.7%，而K 含量降低了14.7%～29.5%。

表5 全P 和缺P 條件下黑木相思苗木各器官養(yǎng)分含量Table 5 Nutrient content in different organs of A.melanoxylon seedlings under normal P and P deficiency mg/g

2.7 缺P 對(duì)黑木相思養(yǎng)分利用效率的影響

由表6 可知，缺P 條件下黑木相思各器官對(duì)N、P、K 養(yǎng)分的利用效率有顯著差異，特別是P 的利用效率，根、莖、葉各器官在缺P 培養(yǎng)時(shí)都極顯著高于全P 培養(yǎng)（P＜0.01），其中根和莖的P 利用率分別提高了6.3 和6.7 倍，葉的P 利用率提高了2.5 倍。在N 和K 的利用率中，除根對(duì)N 的利用率在缺P 和全P 培養(yǎng)下無顯著差異外，其他以缺P 培養(yǎng)顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）高于全P 培養(yǎng)。說明缺P 條件下大大提高了黑木相思的N、P、K 的利用效率。

表6 全P 和缺P 條件下黑木相思苗木養(yǎng)分利用效率Table 6 Nutrient use efficiency of A. melanoxylon seedlings under normal P and P deficiency mg/g

3 結(jié)論和討論

缺P 后，黑木相思苗木地上部生長受到顯著限制，主要表現(xiàn)在株高降低，莖桿變細(xì)，葉量減少，而地下部總根長增加，根系表面積和體積保持穩(wěn)定，表明黑木相思苗木通過減小地上部分生物量，保持地下部生物量，增加根系長度來適應(yīng)缺磷環(huán)境，這些植株生長和根系形態(tài)的變化與大多 數(shù) 林 木 受 到 磷 脅 迫 的 形 態(tài) 變 化 相 似[5-6，11-12，18]。地上部生長量降低一方面可能是營養(yǎng)元素缺乏，體內(nèi)代謝減緩所致，另一方面也是植株應(yīng)對(duì)磷缺乏的形態(tài)適應(yīng)機(jī)制，通過降低地上部生物量的分配及光合作用產(chǎn)物向根部的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)地下部特別是細(xì)根生長，以擴(kuò)大根系對(duì)磷的吸收。黑木相思苗木在缺P 下培養(yǎng)3個(gè)月，雖然表現(xiàn)出植株細(xì)弱，葉量減少的癥狀，但尚未出現(xiàn)葉脈紫紅色，老葉有壞死斑塊易脫落等缺素病癥[19]，說明黑木相思對(duì)磷缺乏具有一定的耐受力。

在順境條件下，植物呼吸、光合作用及一些生化合成反應(yīng)產(chǎn)生的自由基與清除自由基需要的氧化保護(hù)酶處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但在逆境條件下，自由基會(huì)加速產(chǎn)生，積累起來的活性氧就會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害[20]。缺P 處理后，黑木相思苗木葉片和根系中3 種氧化保護(hù)酶（SOD、POD 和CAT）的活性同步升高，表明黑木相思通過提高各種氧化保護(hù)酶活性，來清除缺P 脅迫后苗木體內(nèi)積累的活性氧，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免受其氧化損傷。另外，氧化保護(hù)酶活性受不同植株類型及磷脅迫程度影響，如巴西橡膠（Hevea brasiliensis）各種氧化保護(hù)酶活性隨著磷脅迫時(shí)間的增加呈現(xiàn)持續(xù)增加或先升后降的趨勢(shì)[7]。農(nóng)作物中普遍認(rèn)為保護(hù)酶系統(tǒng)活性變化幅度可衡量品種耐缺磷脅迫能力的強(qiáng)弱[21]，例如，張玉霞等[22]對(duì)大豆（Glycine max）低磷脅迫研究結(jié)果表明氧化保護(hù)酶活性變化受基因型控制，磷高效基因型受脅迫后，氧化保護(hù)酶活性變化較大，磷低效基因型則變化不明顯。本研究中黑木相思葉片中的POD 和CAT活性，缺P 處理比全P 增幅達(dá)113.7%和473.3%，反應(yīng)了黑木相思耐低磷的生理適應(yīng)機(jī)制。

缺P 處理下，黑木相思葉綠素含量，A等光合作用指標(biāo)顯著下降，這與馬尾松（Pinus massoniana）的研究結(jié)果相同[23]。吳楚等[24]認(rèn)為磷脅迫下水曲柳（Fraxinus mandshurica）葉片中可溶性蛋白下降導(dǎo)致1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶含量減少，從而引起光合作用速率的降低，而對(duì)葉綠素生物合成和含量影響不顯著。Amax、Rd和AQY 也是反映植物光合能力的3個(gè)基礎(chǔ)指標(biāo)[25]。Amax反映了植物在強(qiáng)光下吸收和轉(zhuǎn)換光能的能力，Rd代表了植物在黑暗下呼吸作用消耗的光合產(chǎn)物，AQY 反映了植物在弱光下吸收和轉(zhuǎn)換光能的能力。黑木相思缺P 處理下Amax和AQY 顯著下降，表明葉片捕獲強(qiáng)光和弱光的能力都降低，從而限制光合速率，而Rd升高不顯著，說明暫時(shí)沒有對(duì)光合產(chǎn)物產(chǎn)生過量的消耗。

缺P 處理下，黑木相思苗木對(duì)N、P 和K 的吸收和存儲(chǔ)顯著降低，在根、莖、葉器官中，影響最大的為P 含量，降低了59.7%～87.0%，其次為K 含量，降低了14.7%～29.5%，N 含量降低了9.25%～19.7%。研究表明，馬尾松在重度缺P 條件下，苗木對(duì)N 和K 的吸收量也顯著減少，并且對(duì)N 的吸收影響要大于K[26]。缺P 處理下黑木相思根、莖、葉對(duì)P 元素分配表現(xiàn)為根和莖中P 含量大幅度減少，而葉中仍保含有一定量的P 含量，這可能是為了滿足葉片進(jìn)行一定的光合作用，維持正常的生理生化活動(dòng)所需，也是黑木相思響應(yīng)磷脅迫適應(yīng)機(jī)制。在澳大利亞多種年代序列土壤中生長的植物研究表明，相思樹（A.rostellifera）在極低磷土壤中仍保持葉總P 含量大于0.5 mg/L，這是相思樹種適應(yīng)低磷環(huán)境形成的一種葉P 組分分配模式[27]。缺P 條件下大大提高黑木相思根、莖、葉器官的養(yǎng)分利用效率，這與桉樹（Eucalyptus robusta）在重度磷脅迫下，P 利用效率大幅增加相同[28]。研究表明磷脅迫下P 利用效率的提高與根際和葉片的酸性磷酸酶活性增強(qiáng)有關(guān)[29]，葉P 功能組分研究表明，光合磷利用效率與代謝磷和結(jié)構(gòu)性磷之比正相關(guān)[30]。

本文在表型和生理生化上探討了黑木相思磷脅迫響應(yīng)機(jī)制，事實(shí)上植物應(yīng)答低磷環(huán)境引起體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子、磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等大量基因響應(yīng)，構(gòu)成復(fù)雜的磷代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[31]。如擬南芥（Arabidopsis thaliana）在磷脅迫下，占總基因29%的基因表達(dá)發(fā)生變化[32]，1 000 多個(gè)功能基因被誘導(dǎo)和抑制[33]，因此以后從分子生物學(xué)水平解析黑木相思磷脅迫的基因響應(yīng)，將更清晰認(rèn)識(shí)磷脅迫適應(yīng)機(jī)制，為提高養(yǎng)分利用效率，實(shí)現(xiàn)高效栽培提供有效途徑。