• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    1株畜禽糞便堆肥脫氨除臭菌的篩選及特性

    2020-10-26 06:54尹紅梅劉標郭照輝許麗娟杜東霞陳薇
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2020年17期
    關鍵詞:脫氨溶血性氨氣

    尹紅梅 劉標 郭照輝 許麗娟 杜東霞 陳薇

    摘要:為了探索微生物除臭菌對畜禽糞便中氨氣的處理效果,采用富集、平板劃線分離法,從堆肥樣品中共分離出25株菌株,通過氨氣選擇性培養(yǎng)基篩選出1株高效抑制氨氣的菌株,命名為菌株YS1。根據(jù)形態(tài)學觀察、內(nèi)部轉錄間隔區(qū)(ITS)rDNA序列同源性比對、系統(tǒng)進化分析對菌株YS1進行多相鑒定,初步鑒定該菌株為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)。結果表明,菌株YS1接種到硝化培養(yǎng)基后反應96 h,NH+4-N含量從100.0 mg/L下降至9.4 mg/L,NH+4-N 的去除率達90.6%,體系總氮削減率達58.6%。在反硝化培養(yǎng)基中反應96 h,NO-3-N的濃度由初始的99.3 mg/L下降為17.6 mg/L,降解率達82.3%,體系總氮削減率達35.4%。溶血性試驗表明,YS1菌株無溶血性。

    關鍵詞:尖孢鐮刀菌;除臭菌;脫氮;堆肥;NH+4-N;NO-3-N;菌株YS1

    中圖分類號:S182 ??文獻標志碼: A ?文章編號:1002-1302(2020)17-0261-05

    隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,畜禽養(yǎng)殖廢棄物大量堆積,導致嚴重的環(huán)境污染問題,也影響?zhàn)B殖場的衛(wèi)生防疫和人體健康。禽畜糞便是畜禽養(yǎng)殖廢棄物的主要來源。據(jù)有關數(shù)據(jù)統(tǒng)計,2015年規(guī)?;笄蒺B(yǎng)殖糞污產(chǎn)生量為3.834×109 t,遠超同期工業(yè)固體廢棄物的排放量,據(jù)初步估計,到2020年我國養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的畜禽糞便將超過60億t[1]。好氧堆肥技術由于工藝簡單、能耗低、投資少,被廣泛運用于禽畜糞便的處理,但是傳統(tǒng)的好氧堆肥處理容易產(chǎn)生惡臭,氮素損失嚴重,不僅污染大氣,還降低了肥料的養(yǎng)分含量。當前,除臭保氮技術是國內(nèi)外畜禽糞便堆肥研究的重點和熱點,但是迄今為止成效甚微。畜禽糞便堆肥產(chǎn)生的惡臭氣體的主要成分是氨氣、硫化氫等,且氨氣占比最大。當下畜禽糞便堆肥脫氨除臭的方式多種多樣,可分為物理、化學、生物、微生物方式等[2]。微生物處理方式是借助微生物的生理功能以及代謝作用,對其中的惡臭物充分降解,在實際使用中具有脫臭效果穩(wěn)定突出、避免二次污染等諸多優(yōu)勢,已成為當下解決臭氣問題的關鍵方法之一[3]。微生物脫氨除臭的主要作用機制是微生物的硝化和反硝化作用[4],因此這種除臭技術的關鍵是篩選得到高效優(yōu)勢的微生物。

    在除臭領域的微生物篩選、產(chǎn)品設計中,日本、歐美的技術更全面先進,目前取得了一系列的成果。而我國該領域的基礎研究有一定滯后,集中在相關除臭劑的基礎試驗上[5],具備知識產(chǎn)權和科技創(chuàng)新的除臭制劑產(chǎn)品的研究不多。本研究以堆肥腐熟樣為分離材料,分離篩選得到1株脫氨除臭效果好的菌株,命名為YS1。進行了形態(tài)觀察、內(nèi)轉錄間隔區(qū)(ITS)測序等方式鑒定,同時分析了菌株YS1的降氨能力,以期控制畜禽糞便形成的惡臭氣體,改善生態(tài)環(huán)境,為微生物除臭劑的開發(fā)和應用提供更多的理論參考及技術保障。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    腐熟堆肥樣采自湖南省株洲市某有機肥廠,用于具有脫臭效果的微生物菌株篩選。

    分離培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基等。

    NH3選擇性培養(yǎng)基:蔗糖50.0 g,KH2PO4 2.0 g,MgSO4 0.5 g,F(xiàn)eSO4 0.1 g,ZnSO4 0.5 g,NaCl 2.0 g,H2O 1 000 mL 等。

    硝化培養(yǎng)基:葡萄糖5.00 g,(NH4)2SO4 0.47 g,NaCl 1.00 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g,K2HPO4 0.50 g,MgSO4·7H2O 0.25 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0,于121 ℃滅菌20 min。

    反硝化培養(yǎng)基:葡萄糖5.000 g,KNO3 0.722 g,NaCl 1.000 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.050 g,K2HPO4 0.500 g,MgSO4·7H2O 0.250 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0,于121 ℃滅菌20 min。

    1.2 方法

    1.2.1 脫氨除臭菌的富集、分離與純化 取腐熟堆肥樣10 g接種于裝有90 mL無菌水的三角瓶中,室溫環(huán)境下于180 r/min搖床處理30 min,隨后在搖床中靜置 20 min,取5 mL接種在95 mL NH3培養(yǎng)基中,于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)5 d,取5 mL發(fā)酵液繼續(xù)接種在NH3培養(yǎng)基中,以淘汰不能利用 NH+4-N 的微生物,如此反復連續(xù)富集7代。將發(fā)酵液適當稀釋后,涂散在不同的培養(yǎng)基平板上,于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),篩選其中長勢良好的菌落,多次分離純化,直至獲得完全純的單菌落,作斜面保存。

    1.2.2 脫氨除臭菌的復篩 參照Liu等的篩選方法[6],將分離得到的單菌株接種培養(yǎng)過夜后,以體積比5%的接種量接種至NH3選擇性培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。于培養(yǎng)后24、48、96 h取樣,采用凱氏定氮法測定NH3的釋放量。

    1.2.3 高效脫氨菌株的鑒定

    1.2.3.1 形態(tài)觀察 將目標菌株YS1接種至固體培養(yǎng)基平板上,于28 ℃下恒溫培養(yǎng)。待菌落長出后,觀察菌落的大小、形狀、顏色等屬性,結合《真菌鑒定手冊》[7]進行初步鑒定。

    1.2.3.2 ITS序列的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和測序研究 YS1基因組DNA的提取過程參照Ferre等的方法[8]完成。結合真菌ITS引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[9-10]擴增ITS rDNA序列。PCR參照劉建利的方法[10]進行。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、純化等處理后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。ITS rDNA結果在GenBank中完成同源性比較,挑選相似性>96%的序列,結合MEGA 5.0軟件構建ITS rDNA序列的系統(tǒng)進化樹[11]。

    1.2.4 溶血性試驗 將活化后的YS1及對照菌株LY-3接種于血平板上,在30 ℃靜置培養(yǎng)48 h,觀察是否有溶血圈出現(xiàn),以對照菌株LY-3作為指示菌株,判斷尖孢鐮刀菌YS1是否具有溶血性[12]。

    1.2.5 種子液制備 將斜面上保存的YS1接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h,制得種子液用于后續(xù)試驗。

    1.2.6 脫氮性能的測定 用“1.2.5”節(jié)中制備形成的菌懸液,以2%的接種量接種至硝化、反硝化培養(yǎng)基中,于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。每隔24 h取樣,樣品經(jīng)8 000 r/min離心20 min,取上清液測定NH+4-N、NO-3-N、總氮含量,每個取樣點設置3個平行。

    1.2.7 分析測定 硝基氮含量采用紫外分光光度法進行檢測,氨氮含量采用納氏試劑分光度法進行檢測,總氮含量采用凱氏定氮法測定。菌絲干質量采用稱質量法測定。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件One-way ANOVA程序進行單因素方差分析。

    2 結果與分析

    2.1 菌株的分離篩選結果

    豬糞腐熟堆肥樣經(jīng)富集、分離純化后,共獲得25株脫氨除臭菌株。將分離得到的25株菌株接種到NH3選擇性培養(yǎng)基,發(fā)酵培養(yǎng)48 h后,復篩得到7株脫氨效率較好、生長旺盛的單菌,分別編號為YS1、YS3、YS4、YS5、YX1、YX3、YX4。這7株菌株對氨氣的去除率如表1所示,可以看出,培養(yǎng)48 h后,菌株YS1對氨氣的降解率達81.20%,顯著高于其他菌株(P﹤0.05)。最后選擇除氨效率高、生長速度快的YS1為目標菌株進行后續(xù)試驗。

    2.2 菌株YS1的鑒定

    2.2.1 菌落及菌體形態(tài)學觀察 如圖1所示,菌株YS1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后,菌落呈白色,突起絮狀,高2~4 mm。菌絲白色質密,呈絨毛狀,孢子呈粉質,其孢子呈紡錘形。菌落與孢子的形態(tài)特征與鐮刀菌分類鑒定標準基本一致。

    2.2.2 ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建 PCR擴增獲得YS1菌株的ITS序列長度為532 bp,在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast同源性比對分析,結果顯示其與Fusarium oxysporum同源性達98%以上。利用MEGA 5.0軟件對菌株YS1的ITS rDNA構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果見圖2。結合菌株的菌落形態(tài)、顯微形態(tài)特征及ITS rDNA序列分析的結果,YS1菌株可鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)。

    2.3 菌株YS1溶血性

    以LY-3為參照菌株,檢測菌株YS1溶血性。從圖3可以看出,LY-3菌株菌落附近形成了尺寸偏大的溶血圈(圖3-B),而尖孢鐮刀菌YS1菌落周圍沒有出現(xiàn)溶血圈(圖3-A),說明尖孢鐮刀菌YS1不具有溶血性。

    2.4 菌株YS1脫氮性能測定

    2.4.1 菌株YS1硝化性能測定 將菌株YS1種子液以5%的接種量接種于硝化培養(yǎng)基中,考察 NH+4-N 轉化情況,結果見圖4。菌株YS1在24 h后進入對數(shù)期,隨后開始快速轉化NH+4-N,96 h內(nèi)將NH+4-N量從 100.0 mg/L 降至9.4 mg/L,NH+4-N 的去除率達90.6%。在NH+4-N氧化的同時,培養(yǎng)基中積累NO-3-N,反應48 h后,NO-3-N濃度達23.4 mg/L,隨后緩慢下降。體系總氮含量初始值為99.6 mg/L,反應前24 h,發(fā)酵液的總氮含量維持在一個穩(wěn)定的水平,24 h 后,體系總氮含量開始下降,96 h時為41.2 mg/L,總氮含量的削減率達58.6%。證明YS1菌株有良好的硝化性能。

    2.4.2 菌株YS1反硝化性能測定 將菌株YS1接種于反硝化培養(yǎng)基中,測定反應過程中菌絲干質量及硝態(tài)氮、氨態(tài)氮、總氮含量的變化。由圖5可知,在反應96 h時,YS1菌絲干質量達6.12 mg/mL,表明菌株YS1在反硝化培養(yǎng)基上長勢理想。菌株YS1對數(shù)期后NO-3-N的轉化速率很快提升,經(jīng)反應 96 h,NO-3-N含量從最初的99.3 mg/L降至 17.6 mg/L,降解率達82.3%。從圖5中還可以看出,反硝化培養(yǎng)基中有NH+4-N積累,反應48 h后,NH+4-N含量達 18.6 mg/L,隨后逐漸下降。體系總氮含量在菌株YS1進入對數(shù)期后迅速減少,后逐漸穩(wěn)定,反應96 h后總氮含量從最初的 99.6 mg/L 減少到64.3 mg/L,削減率為35.4%。初步確定YS1菌株有良好的反硝化性能。

    3 討論與結論

    堆肥處理是實現(xiàn)畜禽糞便無害化與資源化的一個十分有效的途徑。堆肥過程中散發(fā)的惡臭氣體中的主要成分是氨氣、硫化氫、三甲胺等,其中氨氣占比最大。有研究結果表明,在堆肥過程中,有98%的氮以NH3形式揮發(fā)損失[13]。氮的損失和形成的惡臭不僅污染環(huán)境,影響人體健康,而且降低了肥料中的養(yǎng)分含量。

    本試驗以堆肥腐熟樣為分離源,以NH3的釋放量為分析菌株除臭性能的指標因素,并從堆肥樣本中分離獲得1株脫氨除臭性能最為突出的菌株YS1,根據(jù)菌株菌落、菌體形態(tài)與ITS rDNA序列分析結果,鑒定菌株YS1為尖孢鐮刀菌。

    溶血性是體外對相關菌株安全性測定過程中需要分析的關鍵指標之一。根據(jù)溶血特點,可對該指標分成2類:α溶血,表現(xiàn)為菌落周圍存在草綠色的溶血圈,對人致病力差;β溶血,表現(xiàn)為菌落周圍存在透明溶血圈,易讓人體發(fā)病。若不存在溶血便不會形成溶血圈。本試驗觀察到菌株YS1無溶血圈形成,說明菌株YS1不具有溶血性。

    將菌株YS1接種于硝化培養(yǎng)基中,96 h內(nèi)對氨態(tài)氮的去除率達90.6%。同時發(fā)現(xiàn)在NH+4-N氧化的同時,培養(yǎng)基中積累NO-3-N,反應48 h后,NO-3-N含量達23.4 mg/L。將菌株YS1接種于反硝化培養(yǎng)基中,在96 h內(nèi)對硝態(tài)氮的去除率達82.3%,同時發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中有NH+4-N積累,在反應48 h后,NH+4-N 含量達18.6 mg/L。初步判斷YS1菌株具有良好的硝化、反硝化能力。

    以往的反硝化理論指出,反硝化需要在缺氧的環(huán)境下展開,溶解氧的存在對菌株反硝化發(fā)揮了一定的抑制效果。好氧反硝化環(huán)節(jié)中,由于內(nèi)部存在相應的還原酶,所以可借助NO-3-N與氧氣,完成協(xié)同呼吸[14]。YS1的菌體中也可能具有相應的還原酶,從而可借助氧和硝酸鹽共呼吸,這樣可在好氧環(huán)境下實現(xiàn)反硝化作用。

    本試驗篩選得到的尖孢鐮刀菌具有同步硝化與反硝化特性,這在國內(nèi)外文獻中鮮見報道。尖孢鐮刀菌分致病性與非致病性2種。尖孢鐮刀菌致病菌是農(nóng)作物重要的土傳性真菌性病原菌,會引起植物根部腐爛、維管束褐變及植株萎蔫,導致茄科、芭蕉科與葫蘆科等許多重要農(nóng)作物嚴重減產(chǎn)[15]。非致病性尖孢鐮刀菌能在植株中定殖,不會造成植物病害且對致病性尖孢鐮刀菌有良好的抑制作用,因此已被作為生防菌株應用于防治番茄、黃瓜、康乃馨等植物的枯萎病[16-17]。為了確定菌株YS1是否能用于生產(chǎn)實踐,在后續(xù)研究中,將進一步鑒定其為致病菌株還是非致病性菌株。

    本研究從豬糞腐熟堆肥樣中共獲得25株脫氨除臭菌株,通過氨氣選擇性培養(yǎng)基復篩,得到1株脫氨除臭效率最高的菌株YS1,經(jīng)鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum),該菌株無溶血性。

    菌株YS1具有良好的硝化與反硝化性能。將菌株YS1接種于硝化培養(yǎng)基中,96 h后NH+4-N的去除率達90.6%;將菌株YS1接種于反硝化培養(yǎng)基中,反應96 h后,菌株YS1菌絲干質量達 6.12 mg/mL,NO-3-N的降解率達82.3%。

    參考文獻:

    [1]武淑霞,劉宏斌,黃宏坤,等. 我國畜禽養(yǎng)殖糞污產(chǎn)生量及其資源化分析[J]. 中國工程科學,2018,20(5):103-111.

    [2]Gwyther C L,Williams A P,Golyshin P N,et al. The environmental and biosecurity characteristics of livestock carcass disposal methods:a review[J]. Waste Management,2011,31(4):767-778.

    [3]Chen X G,Geng A L,Yan R,et al.Isolation and characterization of sulphur-oxidizing Thiomonas sp.and its potential application in biological deodorization[J]. Letters in Applied Microbiology,2004,39(6):495-503.

    [4]Wang D W,Yao T,Yang Q L,et al.Screening and degradation characterization of efficient and stable cellulose degrading microbial communities[J]. Acta Prataculturae Sinica,2014,23(2):253-259.

    [5]Ni J Q,Heber A J,Sutton A L,et al. Effect of swine manure dilution on ammonia,hydrogen sulfide,carbon dioxide,and sulfur dioxide releases[J]. Science of the Total Environment,2010,408(23):5917-5923.

    [6]Liu Z,Powers W,Murphy J,et al. Ammonia and hydrogen sulfide emissions from swine production facilities in North America:a meta-analysis[J]. Journal of Animal Science,2014,92(4):1656-1665.

    [7]魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海:上海科學技術出版社,1979:226-227.

    [8]Ferrer C,Colom F,F(xiàn)rases S,et al. Detection and identification of fungal pathogens by PCR and by ITS2 and 5.8 S ribosomal DNA typing in ocular infections[J]. Journal of Clinical Microbiology,2001,39(8):2873-2879.

    [9]尹樂斌,雷志明,孔彥卓,等. 一株高產(chǎn)果膠酶的真菌分離鑒定及酶學特性[J]. 中國釀造,2017,36(2):93-97.

    [10]劉建利. 利用28S rDNA D1/D2區(qū)和ITS rDNA序列鑒定甜瓜白粉病病原菌[J]. 植物保護學報,2011,38(1):47-51.

    [11]Tamura K,Stecher G,Peterson D,et al. MEGA 6:molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution,2013,30(12):2725-2729.

    [12]孟祥晨,李 雪,姚 蕾,等. 兩株植物乳桿菌作為潛在益生菌的體外評價[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報,2015,46(9):44-51.

    [13]Pagans E,Barrena R,F(xiàn)ont X,et al. Ammonia emissions from the composting of different or ganic wastes.Dependency on process temperature[J]. Chemosphere,2006,62(9):1534-1542.

    [14]樊 杰,林煒鐵. 一株硝化脫氮除臭菌的篩選鑒定及其多途徑氮代謝功能的研究[J]. 環(huán)境科學學報,2010,30(4):722-728.

    [15]Kaur R,Kaur J,Rama R S.Nonpathogenic Fusarium as a biological control agent[J]. Plant Pathology Journal,2010,9(3):79-91.

    [16]Shishido M,Miwa C,Usami T,et al. Biological control efficiency of Fusarium wilt of tomato by nonpathogenic Fusarium oxysporum Fo-B2 in different environments[J]. Phytopathology,2005,95(9):1072-1080.

    [17]Abeysinghe S. Biological control of Fusarium oxysporum f. sp.radicis-cucumerinum,the casual agent of root and stem rot of Cucumis sativus by non-pathogenic Fusarium oxysporum[J]. Ruhuna Journal of Science,2006,1:24-31.

    猜你喜歡
    脫氨溶血性氨氣
    三元廢水脫氨塔裝置的擴能改造及效果
    碳氧血紅蛋白在新生兒ABO溶血性黃疸中的臨床意義
    火電廠精處理再生廢水氣態(tài)膜法脫氨工藝中試研究
    糞便污水的臭氧脫氨試驗研究
    絲蘭屬植物提取物降低養(yǎng)雞場氨氣排放的試驗
    利巴韋林片致溶血性貧血伴急性腎衰竭1例
    去白細胞懸浮紅細胞儲血袋兩種放置方式的溶血性分析
    養(yǎng)血益氣膠囊聯(lián)合潑尼松片治療自身免疫性溶血性貧血30例
    噴射脫氨法處理鎢鉬冶金過程中的高濃度氨氮廢水
    久久精品综合一区二区三区| 日韩免费av在线播放| 国产av麻豆久久久久久久| 国内精品久久久久久久电影| 成人午夜高清在线视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 手机成人av网站| 两个人看的免费小视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久中文字幕人妻熟女| 久久久成人免费电影| 丁香欧美五月| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 99riav亚洲国产免费| 午夜免费观看网址| 午夜福利18| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 在线观看一区二区三区| 老司机在亚洲福利影院| 中出人妻视频一区二区| 一夜夜www| 麻豆国产97在线/欧美| 岛国在线观看网站| 亚洲在线自拍视频| xxx96com| 精品久久久久久久久久久久久| 成年免费大片在线观看| 成年免费大片在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产爱豆传媒在线观看| 国产乱人伦免费视频| 久久久久久久久中文| 欧美极品一区二区三区四区| bbb黄色大片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 色综合站精品国产| 99在线人妻在线中文字幕| 少妇丰满av| 91av网一区二区| 国产三级中文精品| 两个人的视频大全免费| av天堂中文字幕网| 老司机深夜福利视频在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 精品一区二区三区四区五区乱码| 俺也久久电影网| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 香蕉丝袜av| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 一进一出好大好爽视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 在线a可以看的网站| www.熟女人妻精品国产| 久久九九热精品免费| 热99在线观看视频| 999久久久国产精品视频| 九九在线视频观看精品| 激情在线观看视频在线高清| 99视频精品全部免费 在线 | 国产乱人伦免费视频| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | a在线观看视频网站| 精品免费久久久久久久清纯| 国产一区二区在线av高清观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲 国产 在线| 国产视频一区二区在线看| 国产成+人综合+亚洲专区| 日韩大尺度精品在线看网址| 在线播放国产精品三级| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 午夜精品久久久久久毛片777| www.www免费av| 性色av乱码一区二区三区2| 18禁美女被吸乳视频| 国产伦人伦偷精品视频| 免费大片18禁| 成在线人永久免费视频| 99热只有精品国产| 国产精品一及| 久久99热这里只有精品18| 在线视频色国产色| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美一区二区精品小视频在线| 精品电影一区二区在线| 婷婷亚洲欧美| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 99在线人妻在线中文字幕| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产91精品成人一区二区三区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 午夜福利在线在线| 午夜视频精品福利| 一进一出抽搐gif免费好疼| 精品不卡国产一区二区三区| 一级黄色大片毛片| www日本在线高清视频| 免费看光身美女| 超碰成人久久| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲电影在线观看av| 一区二区三区高清视频在线| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲欧美日韩东京热| 搡老熟女国产l中国老女人| 搞女人的毛片| 黄色成人免费大全| 白带黄色成豆腐渣| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 一二三四在线观看免费中文在| 国产99白浆流出| 日本黄大片高清| 午夜福利高清视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲电影在线观看av| 欧美不卡视频在线免费观看| 在线观看舔阴道视频| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产免费男女视频| 色老头精品视频在线观看| 麻豆成人av在线观看| 久久久久久人人人人人| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 免费电影在线观看免费观看| 国产黄色小视频在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 免费看日本二区| 国产成人啪精品午夜网站| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲成av人片在线播放无| 国产精品亚洲美女久久久| 国产精品乱码一区二三区的特点| 九九在线视频观看精品| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 色综合亚洲欧美另类图片| 最新中文字幕久久久久 | 深夜精品福利| 国产91精品成人一区二区三区| 久久精品国产清高在天天线| 黄色女人牲交| 88av欧美| 亚洲av电影在线进入| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 18美女黄网站色大片免费观看| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲五月天丁香| 99riav亚洲国产免费| 好男人在线观看高清免费视频| 国内精品久久久久久久电影| 精品久久蜜臀av无| www.精华液| 真实男女啪啪啪动态图| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 免费看光身美女| 一个人看的www免费观看视频| 小说图片视频综合网站| 国产爱豆传媒在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 在线视频色国产色| 在线免费观看的www视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产精品日韩av在线免费观看| 我要搜黄色片| 午夜精品在线福利| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 美女高潮的动态| 国产精品久久电影中文字幕| 国产熟女xx| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 成人国产一区最新在线观看| 热99在线观看视频| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产精品女同一区二区软件 | 国产成人精品无人区| 精品欧美国产一区二区三| 成人鲁丝片一二三区免费| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品亚洲美女久久久| 老司机在亚洲福利影院| 老汉色∧v一级毛片| 午夜影院日韩av| 宅男免费午夜| 久久中文看片网| 成在线人永久免费视频| 国产精品久久视频播放| 校园春色视频在线观看| 免费看光身美女| 丁香欧美五月| 欧美日韩乱码在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 午夜日韩欧美国产| 神马国产精品三级电影在线观看| 午夜福利免费观看在线| 久久久久性生活片| 91在线观看av| 一进一出好大好爽视频| 婷婷丁香在线五月| 久久久久久人人人人人| 黄片大片在线免费观看| 白带黄色成豆腐渣| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 又大又爽又粗| 亚洲最大成人中文| 99精品欧美一区二区三区四区| 欧美中文日本在线观看视频| ponron亚洲| 夜夜爽天天搞| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产成人啪精品午夜网站| 嫩草影视91久久| 日本 欧美在线| 一级毛片高清免费大全| 亚洲av免费在线观看| 欧美3d第一页| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久9热在线精品视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 哪里可以看免费的av片| 级片在线观看| 久久亚洲精品不卡| 美女高潮的动态| 国内精品美女久久久久久| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产精品亚洲美女久久久| 男女床上黄色一级片免费看| 午夜成年电影在线免费观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 好男人在线观看高清免费视频| 757午夜福利合集在线观看| 久久香蕉国产精品| xxx96com| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 99热6这里只有精品| 亚洲熟女毛片儿| 欧美日韩乱码在线| 国产精品野战在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 高清在线国产一区| 一区福利在线观看| 久久久国产成人精品二区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲黑人精品在线| www日本在线高清视频| 久久精品综合一区二区三区| 免费观看精品视频网站| 亚洲av免费在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 嫩草影视91久久| 色精品久久人妻99蜜桃| 又黄又粗又硬又大视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产 一区 欧美 日韩| www日本黄色视频网| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲中文字幕日韩| 免费看十八禁软件| 国产精品1区2区在线观看.| 黄色视频,在线免费观看| 国内精品久久久久精免费| 婷婷六月久久综合丁香| 91麻豆av在线| 久久久国产欧美日韩av| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲 国产 在线| 青草久久国产| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲精华国产精华精| 国产精品99久久久久久久久| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 99久久精品热视频| 老司机福利观看| 国产av在哪里看| 麻豆成人午夜福利视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品 国内视频| 国产免费男女视频| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 最新美女视频免费是黄的| 男人舔女人下体高潮全视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产成人aa在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 日本一二三区视频观看| 一区二区三区激情视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 黄色日韩在线| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国语自产精品视频在线第100页| 我要搜黄色片| 国产精品99久久久久久久久| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 日韩欧美免费精品| 欧美乱色亚洲激情| 日本免费a在线| 黑人操中国人逼视频| 国产精品九九99| 久久热在线av| 18禁国产床啪视频网站| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产乱人视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 日韩欧美 国产精品| 午夜免费激情av| 一个人看的www免费观看视频| 国产高清有码在线观看视频| 国产精品国产高清国产av| 一个人免费在线观看电影 | 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 成人国产综合亚洲| 母亲3免费完整高清在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 免费大片18禁| 特级一级黄色大片| 亚洲七黄色美女视频| 韩国av一区二区三区四区| 90打野战视频偷拍视频| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲无线在线观看| 亚洲av成人一区二区三| 偷拍熟女少妇极品色| 看黄色毛片网站| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产一区二区激情短视频| 国产探花在线观看一区二区| 99在线人妻在线中文字幕| 怎么达到女性高潮| 国产三级黄色录像| 亚洲av成人一区二区三| 香蕉丝袜av| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日本免费a在线| 亚洲专区字幕在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 岛国在线免费视频观看| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 婷婷精品国产亚洲av| 夜夜爽天天搞| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产成人影院久久av| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日本一二三区视频观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 无人区码免费观看不卡| 久久人人精品亚洲av| 成人鲁丝片一二三区免费| 久久国产乱子伦精品免费另类| 最新在线观看一区二区三区| 久久久精品大字幕| 免费高清视频大片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 黄色视频,在线免费观看| 9191精品国产免费久久| av在线天堂中文字幕| 亚洲一区二区三区不卡视频| 两个人视频免费观看高清| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久精品91无色码中文字幕| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 精品人妻1区二区| 成年免费大片在线观看| 99re在线观看精品视频| 伦理电影免费视频| 波多野结衣高清作品| 啦啦啦韩国在线观看视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 最好的美女福利视频网| 国产一区二区激情短视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 怎么达到女性高潮| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美在线一区亚洲| 91在线观看av| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 欧美午夜高清在线| 亚洲第一电影网av| 在线观看一区二区三区| 亚洲欧美精品综合久久99| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产真实乱freesex| 激情在线观看视频在线高清| 黄色视频,在线免费观看| 99国产精品99久久久久| 波多野结衣高清作品| 最新美女视频免费是黄的| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲成人久久爱视频| 国产毛片a区久久久久| 99在线人妻在线中文字幕| 人妻久久中文字幕网| 国产精品99久久99久久久不卡| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲av片天天在线观看| 在线免费观看的www视频| 日本黄色片子视频| 老汉色∧v一级毛片| cao死你这个sao货| 国产精品电影一区二区三区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产精品亚洲av一区麻豆| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国模一区二区三区四区视频 | av欧美777| 日本黄色片子视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲美女黄片视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产1区2区3区精品| 舔av片在线| 黑人操中国人逼视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 麻豆成人av在线观看| 久9热在线精品视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 99久国产av精品| 在线永久观看黄色视频| 成人欧美大片| 亚洲av第一区精品v没综合| 免费av不卡在线播放| 午夜免费激情av| 18禁观看日本| 精品日产1卡2卡| 亚洲真实伦在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 黑人欧美特级aaaaaa片| 成人特级av手机在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 日韩av在线大香蕉| 欧美三级亚洲精品| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 男女那种视频在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲av第一区精品v没综合| 在线a可以看的网站| 精品一区二区三区视频在线 | 两个人的视频大全免费| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产成人aa在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| cao死你这个sao货| 亚洲一区二区三区不卡视频| 床上黄色一级片| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 日本一本二区三区精品| 精品国产三级普通话版| 精品日产1卡2卡| 亚洲成人精品中文字幕电影| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 亚洲成人免费电影在线观看| 成人无遮挡网站| av福利片在线观看| 男女视频在线观看网站免费| 欧美日韩精品网址| 天天躁日日操中文字幕| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产真人三级小视频在线观看| 观看免费一级毛片| 极品教师在线免费播放| 一二三四在线观看免费中文在| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 看免费av毛片| 国产高清有码在线观看视频| 国内精品美女久久久久久| 日本黄色片子视频| 色吧在线观看| 国产熟女xx| 日韩高清综合在线| 国产男靠女视频免费网站| 法律面前人人平等表现在哪些方面| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 桃红色精品国产亚洲av| 久久人人精品亚洲av| 午夜久久久久精精品| 中文字幕熟女人妻在线| 精品不卡国产一区二区三区| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲激情在线av| 色综合婷婷激情| 亚洲精华国产精华精| 久久精品人妻少妇| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久精品综合一区二区三区| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产美女午夜福利| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 看片在线看免费视频| 色播亚洲综合网| 午夜福利高清视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产麻豆成人av免费视频| 日本 av在线| 看片在线看免费视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产毛片a区久久久久| 99精品久久久久人妻精品| 色噜噜av男人的天堂激情| 窝窝影院91人妻| 免费搜索国产男女视频| 97碰自拍视频| 中文在线观看免费www的网站| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲欧美激情综合另类| 久久精品国产清高在天天线| 国产伦一二天堂av在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲国产精品999在线| 高潮久久久久久久久久久不卡| 两个人视频免费观看高清| 欧美一区二区精品小视频在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 九九在线视频观看精品| 国产单亲对白刺激| 亚洲精品美女久久av网站| 成年版毛片免费区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 黄片小视频在线播放| 欧美乱色亚洲激情| 国产淫片久久久久久久久 | 在线a可以看的网站| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久中文看片网| 亚洲av成人一区二区三| 国产精华一区二区三区| 成人三级黄色视频| 日日夜夜操网爽| 嫩草影院入口| 日本与韩国留学比较| 国内精品久久久久精免费| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 一本精品99久久精品77| 18禁美女被吸乳视频| 国产爱豆传媒在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产精品女同一区二区软件 | 久久草成人影院| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 免费在线观看成人毛片| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产精品国产高清国产av| 99热6这里只有精品| 日韩欧美三级三区| 日韩精品中文字幕看吧| 精品一区二区三区四区五区乱码| 97超视频在线观看视频| 婷婷亚洲欧美| xxxwww97欧美| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产乱人伦免费视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲熟妇熟女久久| 黄色成人免费大全| 性欧美人与动物交配| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美乱色亚洲激情| 又大又爽又粗| 久久久久久人人人人人| 久久草成人影院| 精品乱码久久久久久99久播| 舔av片在线| 国产午夜精品论理片| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 午夜日韩欧美国产| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 一区二区三区国产精品乱码| 偷拍熟女少妇极品色|