高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測原桃膠中左旋肉堿的含量

劉啟月 李勇 余向陽 胡秋輝

摘要：利用超聲波輔助提取技術(shù)和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）對原桃膠中的左旋肉堿進(jìn)行定量分析。以左旋肉堿的含量為研究對象，考察不同提取劑的提取效率，優(yōu)化左旋肉堿的液質(zhì)聯(lián)用分析條件。結(jié)果表明，1 g原桃膠經(jīng)80%甲醇于60 ℃、300 W超聲提取1 h處理的左旋肉堿得率最高;左旋肉堿在相應(yīng)含量范圍內(nèi)的線性良好，r2=0.995;左旋肉堿加標(biāo)量為140～560 μg/kg時(shí)，回收率為89.7%～109.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～4.5%，方法定量限為15.1 pg。利用建立的分析方法測定6批桃膠樣品中的左旋肉堿，結(jié)果顯示，得率為 160～330 μg/kg。綜上可得，該方法可準(zhǔn)確快速地對桃膠中的左旋肉堿進(jìn)行定量分析。

關(guān)鍵詞：原桃膠;左旋肉堿;液質(zhì)聯(lián)用;LC-MS/MS

中圖分類號： R284.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0215-04

桃膠別稱桃樹膠，是桃[Prunus persica （L.） Batsch]或山桃[Prunus davidiana（Carr.）Franch]等薔薇科植物樹干受到機(jī)械傷或致病后分泌出來的膠質(zhì)半透明狀物質(zhì)[1]在樹干上曬干或采用其他脫水方法獲得的淡黃色、黃褐色半透明的固體塊狀物質(zhì)（圖1）。采摘后未經(jīng)其他加工處理的桃膠為原桃膠，原桃膠味苦、性平、益氣、和血、止渴、活血消腫、通淋止痛[2]。古代早已記載，原桃膠具有治療消渴癥即糖尿病的作用[2-4]，現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)，原桃膠具有降血糖、降血脂、提高免疫力[5]、抗氧化[6]、抗菌[7]等功能。并不是所有的桃樹都能產(chǎn)生桃膠，一般新樹不產(chǎn)生桃膠，隨著樹齡的增長，樹枝上的干創(chuàng)口（生理或病理）增多，流膠開始變多。桃膠的產(chǎn)生與氣候有很大關(guān)系，在我國亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)的沿海沿江地區(qū)，夏秋季桃膠的生產(chǎn)量較多，尤以湖北、浙江、福建、江蘇秦嶺-淮河以南地區(qū)盛產(chǎn)。盛產(chǎn)桃膠地區(qū)的居民常將桃膠作為一種食材烹飪成各種地方特色美食食用，例如用桃膠煲羹，有土家燕窩之稱，一度被很多愛美人士追捧。

左旋肉堿（L-carnitine），又稱L-肉堿、左卡尼汀、L-肉毒堿或維生素BT，是一種人類必需的類氨基酸，其主要的生理功能是作為載體將長鏈脂肪酸從線粒體膜外運(yùn)輸?shù)侥?nèi)，從而促進(jìn)脂肪酸的 β-氧化，加速機(jī)體的脂肪代謝[8]。研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)增加人體內(nèi)左旋肉堿的含量，可以促進(jìn)脂?；霓D(zhuǎn)運(yùn)，從而促進(jìn)脂肪代謝，降低各種組織的脂肪量，達(dá)到減脂、減體質(zhì)量的目的[9]。左旋肉堿具有很好的保健作用，常作為食品中的營養(yǎng)強(qiáng)化劑、添加劑添加于嬰兒食品、運(yùn)動員飲品、減肥健美食品中，還可以作為飼料添加劑促進(jìn)動物生長[10]。人體內(nèi)左旋肉堿的一個重要來源是從膳食中攝入，左旋肉堿在紅肉中的含量較多，在植物中的含量極少甚至沒有。目前，左旋肉堿的檢測方法主要有酶技術(shù)法、高效液相色譜法（HPLC）、離子色譜法和質(zhì)譜聯(lián)用法[11]，其中質(zhì)譜聯(lián)用法操作方便，不需要衍生化，不存在衍生過程中的水解問題，并且液相色譜可以消除載體干擾因素，適合樣品中游離肉堿、總?cè)鈮A的測定[12]。

目前，對于原桃膠的研究主要集中在桃膠多糖成分的分析及其功能研究，對其他成分的研究基本沒有報(bào)道。原桃膠的營養(yǎng)價(jià)值不僅是因?yàn)槠浜胸S富的植物多糖，研究者在原桃膠中還發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)、氨基酸及豐富的微量元素。筆者在試驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)，原桃膠中可能還存在左旋肉堿。原桃膠中的左旋肉堿含量可能是評價(jià)原桃膠營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。本研究以原桃膠為原料，優(yōu)化提取條件及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）檢測條件，對原桃膠中的左旋肉堿進(jìn)行提取與定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1批原桃膠混合樣品采摘于湖北省武漢市，6批不同品種的原桃膠樣品于2019年6月采摘于浙江省杭州市;左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度為95.54%，購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）;超純水（儀器購自Direct-R公司）;甲酸、甲酸銨、甲醇、乙腈均為色譜純。

Agilent 1290-6470液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，購自美國Agilent公司;SBL-10DT超聲波恒溫清洗劑，購自寧波新芝生物科技股份有限公司;TG16-WS型高速離心機(jī)，購自長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;粉碎機(jī)，購自天津泰斯特檢測有限公司;AP2500-0 型電子天平，產(chǎn)自瑞士Ohaus公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 左旋肉堿的提取方法 挑選100 g干凈的食用級原桃膠，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎60 s后，將桃膠粉過60目篩收集備用。取1 g桃膠粉于50 mL離心管中，加入30顆玻璃小珠（防止桃膠樣品結(jié)團(tuán)，提高提取效率），加入10 mL提取液，在60 ℃溫水中于300 W超聲提取60 min，室溫冷卻至常溫后 5 000 r/min 離心5 min，取1 mL上清液，用 0.22 μm 的有機(jī)濾膜過濾到進(jìn)樣小瓶中，待測。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)液的制備 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：稱取10.0 mg左旋肉堿入10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后稀釋定容、混勻。配制的左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液質(zhì)量濃度為1 mg/mL，可于-18 ℃保存6個月。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用甲醇將左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋，得到質(zhì)量濃度為10、20、40、60、80、100 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)液，根據(jù)測得的結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 色譜條件 色譜柱Agilent poroshell 120 HILIC-Z（2.1 mm×150.0 mm，2.7 μm），Agilent ZORBAX SB-C18（2.1 mm×150.0 mm，3.5 μm），流動相：80%乙腈-20%水（含20 mmol/L甲酸銨，用純度為99%的甲酸調(diào)節(jié)pH值為2.3），流速為 0.3 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件 離子監(jiān)測方式為多離子監(jiān)測（MRM），離子化模式為正離子化方式，離子源為電噴霧（ESI），毛細(xì)管電壓為4.0 kV，霧化氣壓為103.4 kPa，干燥氣流速為11 L/min，干燥器溫度為350 ℃，定量離子對的質(zhì)荷比（m/z）為162. 1→103.1，定性離子對的m/z為162.1→64.1，錐孔電壓為100 V，碰撞能量為14 V，左旋肉堿在3 min左右即出峰。

2 結(jié)果與分析

2.1 LC-MS儀器條件的優(yōu)化

左旋肉堿為極性化合物，本研究分別考察C18色譜柱、HILIC色譜柱的分離效果，以80%乙腈-20%水（20 mmol/L甲酸銨，pH值為2.3）為流動相，由于左旋肉堿的極性強(qiáng)，C18柱峰型不佳且拖尾現(xiàn)象明顯，而HILIL柱對左旋肉堿的保留時(shí)間適中且峰形佳，適合定量分析。圖2-a為C18柱左旋肉堿的提取離子EIC圖，圖2-B為HILIC色譜柱左旋肉堿的提取離子EIC離子圖。左旋肉堿在電噴霧正離子化方式下主要生成[M+H]+（m/z：162.2），因此選擇[M+H]+進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，產(chǎn)生的主要碎片離子m/z為103.1和64.0，將m/z為103.1的碎片離子作為定量離子，將m/z為64.0的碎片離子作為定性離子。整個檢測過程為5 min，出峰時(shí)間為 3 min 左右（圖2）。

2.2 樣品提取優(yōu)化

考察用不同含水量的有機(jī)提取液提取桃膠中左旋肉堿的效率，取1 g混合樣桃膠粉末，加入 10 mL 提取液，提取液分別為體積分?jǐn)?shù)為90%、80%、70%乙醇、甲醇和乙腈，按照“1.2.1”節(jié)的方法超聲提取1 h，取上清液，過濾后用LC-MS/MS測定其左旋肉堿含量。由圖3可以看出， 80%甲醇的提取得率為9種提取液中最好的（當(dāng)甲醇含水量大于30%時(shí)，桃膠泡發(fā)成黏稠狀，無法分離上清）。因此，本研究選擇80%甲醇提取左旋肉堿。

2.3 左旋肉堿的回收率與檢出限

用80%甲醇按照“1.2.1”節(jié)的方法重復(fù)提取7份桃膠粉末，用LC-MS/MS測得左旋肉堿的均值為288 μg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.9%。以288 μg/kg作為本底值，添加約0.5、1.0、2.0倍本底值的左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)到實(shí)際樣品中，進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個添加濃度平行重復(fù)5次。由表1可見，左旋肉堿的加標(biāo)回收率為89.7%～109.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～4.5%。因此，本研究方法具有較好的回收率，能夠滿足實(shí)際樣品的分析要求。

取儲備液逐級稀釋，進(jìn)樣量設(shè)為5 μL。以信噪比（S/N）=3計(jì)算左旋肉堿的檢出限（LOD），以信噪比=10計(jì)算其定量限（LOQ），并以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明，左旋肉堿的LOD為 5.0 pg/g，LOQ為15.1 pg/g，能夠滿足實(shí)際樣品分析對檢測限的需求。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

利用LC-MS/MS分析10、20、40、60、80、100 μg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為y=274.9x+815.8，r2=0.995。結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為10～100 μg/L 范圍內(nèi)時(shí)，左旋肉堿的線性關(guān)系良好。

2.5 精密度與重現(xiàn)性

分別對質(zhì)量濃度為10、20、100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行5次連續(xù)進(jìn)樣，計(jì)算5次測定值的平均值和變異系數(shù)（CV），考察方法的精密度。由表2可見，針對不同濃度的左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行連續(xù)進(jìn)樣后，3個質(zhì)量濃度水平的CV為1.0%～3.1%，表明該方法隨機(jī)誤差較小，具有較好的精密度。通過同一臺儀器、同一實(shí)驗(yàn)員同一天對定值配方粉進(jìn)行重復(fù)測定（n=7），考察方法的日內(nèi)精密度;通過同一臺儀器、同一實(shí)驗(yàn)員連續(xù)3 d對定值配方粉進(jìn)行重復(fù)測定（n=7），考察方法的日間精密度。結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度和日間精密度良好，CV分別為3.2%和8.0%。

2.6 樣品含量的測定

取6月份采集于浙江省的6批不同品種的桃膠樣品，粉碎后分別準(zhǔn)確稱取1 g，每個樣品設(shè)3個平行，分別按照“1.2.1”節(jié)的方法對桃膠中的左旋肉堿含量進(jìn)行測定。如表3所示，經(jīng)本研究方法對6批桃膠樣品進(jìn)行定量分析，確定該6批原桃膠中的左旋肉堿含量為160～330 μg/kg。左旋肉堿在動物紅肉中含量豐富，在羊肉、牛肉中的含量較高，瑞士LONZA公司的數(shù)據(jù)顯示，綿羊肉中的左旋肉堿含量達(dá)到2 100 mg/kg，牛肉中的含量為640 mg/kg，雞肉中的含量為75 mg/kg。目前的研究結(jié)果顯示，左旋肉堿在植物中含量很少或基本沒有，在椰菜花、花生中的含量為1 mg/kg，橄欖、橙汁、菠菜葉中未檢出左旋肉堿。原桃膠中左旋肉堿的含量尚達(dá)不到GB 14880—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)——食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[13]中的含量范圍，但其作為一種膳食兼?zhèn)涞奶烊恢参镌串a(chǎn)品，還是含有一定量的左旋肉堿。原桃膠中不只含有桃膠多糖，研究原桃膠中的其他具體功能活性成分，可為后期桃膠功能型產(chǎn)品的開發(fā)與加工提供指導(dǎo)性建議。

3 結(jié)論

本研究利用超聲波輔助提取技術(shù)和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對原桃膠中的左旋肉堿進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，1 g原桃膠經(jīng)80%甲醇于 60 ℃、300 W超聲提取1 h所得左旋肉堿得率最高。左旋肉堿在相應(yīng)含量范圍內(nèi)的線性良好，r2=0.995，加標(biāo)回收率和檢測限定量限均滿足要求。利用本研究建立的分析方法，測得6批桃膠樣品中左旋肉堿的得率為160～330 μg/kg。

目前，評價(jià)桃膠的品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)并不完善，還需從多方面做更詳細(xì)的研究。一方面是應(yīng)加大對其含量最多的桃膠多糖的生理作用機(jī)制的研究;另一方面，應(yīng)加大對除桃膠多糖外其余的生理活性成分的定性定量研究;最后，桃膠作為采后可直接食用的食材，農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)也是需要關(guān)注的重點(diǎn)。由此看出，原桃膠的價(jià)值研究需要投入更多關(guān)注。

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