南苜蓿葉總黃酮提取及抑菌抗氧化活性

王家皓 賁蕾潔 符茜 張揚(yáng) 鄭麗雪

摘要：以南苜蓿為原料，通過(guò)復(fù)合酶解協(xié)同乙醇法提取其葉片中的總黃酮。采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化其最佳提取工藝，進(jìn)一步考察南苜蓿葉總黃酮對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制性能，再通過(guò)對(duì)羥基自由基的清除能力、DPPH自由基的清除能力測(cè)定其抗氧化性能。結(jié)果表明最佳提取工藝為：復(fù)合酶用量3.0%，酶解時(shí)間15.7 min，酶解溫度39.0 ℃。在此條件下，南苜蓿葉總黃酮得率達(dá)到（1.9±0.3）%。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，南苜蓿葉總黃酮對(duì)大腸桿菌ATCC 25922最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，簡(jiǎn)稱(chēng)MIC）為 0.15 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC 25923 MIC為0.20 mg/mL。南苜蓿葉總黃酮對(duì)羥基自由基和DPPH均表現(xiàn)出一定的清除能力，當(dāng)樣品濃度為1.0 mg/mL時(shí)，清除率分別為54.75%、88.48%，對(duì)DPPH自由基、羥自由基半數(shù)抑制濃度IC50分別為0.368、0.947 mg/mL。

關(guān)鍵詞：南苜蓿;葉片;總黃酮;提取工藝;復(fù)合酶解法;抑菌活性;抗氧化活性;清除率;最低抑菌濃度;半數(shù)抑制濃度

中圖分類(lèi)號(hào)： TS201.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）17-0201-05

南苜蓿是豆科苜蓿屬的一二年生草本植物，別稱(chēng)草頭、金花菜，主要分布于我國(guó)江浙一帶[1]。它在我國(guó)有悠久的栽培歷史，最早作為綠肥和飼料引用栽培[2]。南苜蓿對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求不高，所以其產(chǎn)量很大，而且生長(zhǎng)快速。南苜蓿具有清熱涼血、治療黃疸、降低膽固醇含量[3]等多種養(yǎng)生調(diào)理作用，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，其嫩芽中蛋白質(zhì)含量在28.5%以上，富含18種氨基酸以及豐富的維生素、礦物質(zhì)、微量元素等，具有高蛋白、高膳食纖維、低脂肪特征，加之口感清爽、甘甜，廣泛用于蔬菜食用[4]。

目前，針對(duì)南苜蓿的研究主要有3個(gè)方面：一是種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與遺傳多樣性研究[5-6];二是功能因子生理活性研究[7-8];三是化學(xué)成分提取鑒定。晏小云等從南苜蓿乙醇提取物中發(fā)現(xiàn)以芹菜素為代表的黃酮功能因子，但其生理作用機(jī)制尚不清楚，研究相對(duì)不夠深入[1]。本研究首次采用復(fù)合酶解協(xié)同乙醇法提取南苜蓿葉（主要食用部位）中的總黃酮，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步分析其抗菌及抗氧化性能，為蘇南地區(qū)南苜蓿資源的綜合開(kāi)發(fā)利用奠定一定的理論基礎(chǔ)與試驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試驗(yàn)材料有南苜蓿（常熟當(dāng)?shù)?0月產(chǎn)）、蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、果膠酶、纖維素酶、無(wú)水乙醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、磷酸鹽緩沖液、綠礬（FeSO4·7H2O）、鄰二氮菲、三氯乙酸、三氯化鐵、抗壞血酸，均購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

主要試驗(yàn)儀器有PL602E/02型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、DHG-9037A型恒溫干燥箱（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）、HH-11-2-S型水浴鍋（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、722-UV型紫外分光光度計(jì)（上海高致精密儀器有限公司）、HK-20B 1000g型粉碎機(jī)（廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）、SHB-IIA型離心機(jī)（臨海市永昊真空設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)菌種

試驗(yàn)菌種主要有大腸桿菌（Escherichia coli） ATCC 25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） ATCC 25923，菌種保藏于常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院發(fā)酵工程中心。

1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g 氯化鈉，1 L蒸餾水，pH值為7.2～7.4。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 南苜蓿預(yù)處理 將南苜蓿葉置于70 ℃烘箱內(nèi)干燥至恒質(zhì)量，取出用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)20目篩網(wǎng)，得到南苜蓿葉粉末，用袋子密封好放在通風(fēng)干燥處避光保藏，備用。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 參考余勇等的方法[8]制作蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以蕓香苷濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。本試驗(yàn)中得到線(xiàn)性回歸方程為y=12.595x-0.006 8，r2=0.998 7，表明在一定范圍內(nèi)吸光度與濃度的線(xiàn)性關(guān)系良好。

1.5.3 南苜蓿葉總黃酮的提取 稱(chēng)取2.5 g干燥后的南苜蓿葉粉末置于50 mL燒杯中，先加復(fù)合酶液25 mL，放入一定溫度的水浴鍋中酶解一定時(shí)間，之后轉(zhuǎn)移至80 ℃水浴鍋中滅酶10 min，取出后用乙醇加至50 mL，再放入40 ℃水浴鍋中提取10 min，取出后用真空抽濾機(jī)抽濾，濾液即為含有南苜?？傸S酮的提取液。

1.5.4 南苜蓿葉總黃酮含量的測(cè)定 吸取0.5 mL南苜蓿葉總黃酮提取液置于25 mL比色管中，按“1.5.2”節(jié)下方法測(cè)吸光度。根據(jù)蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程，計(jì)算南苜蓿葉總黃酮的含量，然后計(jì)算得率。

總黃酮得率=C×25×50×100V×m×1 000×100%。

式中：C表示待測(cè)液總黃酮含量，mg/mL;V表示吸取的提取液的體積，mL;m表示提取用的樣品質(zhì)量，g。

1.5.5 單因素試驗(yàn) 選取復(fù)合酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間等3個(gè)因素，考察各因素對(duì)南苜蓿葉總黃酮得率的影響。在進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí)，固定復(fù)合酶添加量為1%、酶解溫度為40 ℃、酶解時(shí)間為 10 min，分別改變所對(duì)應(yīng)的設(shè)定因素，復(fù)合酶添加量為1%、2%、3%、4%、5%;酶解溫度為30、35、40、45、50 ℃;酶解時(shí)間為5、10、15、20、25 min。

1.5.6 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)前期的單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，然后進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定最佳提取工藝。試驗(yàn)因素水平及相關(guān)情況見(jiàn)表1。

1.5.7 抑菌活性測(cè)定 采用梯度稀釋分析的方法確定南苜蓿葉總黃酮對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）[11]。

在無(wú)菌操作條件下，將各濃度梯度的南苜蓿葉總黃酮提取液各吸取2 mL，分別置于不同培養(yǎng)皿中，加入預(yù)先準(zhǔn)備好的LB培養(yǎng)基，充分混勻，凝固后在平板中分別加入0.2 mL大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌懸液，涂布均勻，以無(wú)菌水和5%苯甲酸鈉為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個(gè)濃度做平行試驗(yàn)3次。以不長(zhǎng)菌的最低濃度作為南苜蓿葉總黃酮的MIC。

1.5.8 抗氧化活性的測(cè)定

1.5.8.1 對(duì)DPPH·自由基清除能力的測(cè)定 將提取得到的南苜蓿葉總黃酮溶液配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同含量的樣品溶液，參照Cai等的方法[10]進(jìn)行DPPH·自由基清除能力測(cè)定。

1.5.8.2 對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定 將提取得到的南苜蓿葉總黃酮溶液配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同含量的樣品溶液，參照許建本等的方法[11]進(jìn)行羥基自由基清除能力的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 復(fù)合酶添加量的影響 在本試驗(yàn)中，復(fù)合酶質(zhì)量之比為1 g ∶ 1 g，由圖1可知，當(dāng)增加復(fù)合酶使用量時(shí)，南苜蓿葉總黃酮得率逐漸上升;當(dāng)在復(fù)合酶添加量為3%時(shí)，南苜蓿葉總黃酮得率最高，為1.49%;但隨著復(fù)合酶添加量增加，得率沒(méi)有持續(xù)升高反而出現(xiàn)了下降，這可能是因?yàn)槊柑砑恿窟^(guò)多，此時(shí)底物完全被酶包圍，植物細(xì)胞壁中的纖維素和果膠在酶的作用下產(chǎn)生的水解產(chǎn)物對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)的吸附性較強(qiáng)[12]，所以復(fù)合酶添加量過(guò)多反而會(huì)使南苜蓿葉總黃酮得率降低。

2.1.2 復(fù)合酶酶解溫度的影響 由圖2可知，當(dāng)溫度小于40 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，南苜蓿葉總黃酮得率增大，是因?yàn)闇囟壬?，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，使得細(xì)胞內(nèi)成分更容易溶出[13];當(dāng)溫度大于40 ℃時(shí)，隨溫度升高，南苜蓿葉總黃酮得率減小，這是因?yàn)槊副举|(zhì)上是蛋白質(zhì)， 酶蛋白會(huì)因?yàn)闇囟壬叨冃允Щ?，因而浸提效果變差[14]。

2.1.3 復(fù)合酶酶解時(shí)間的影響 由圖3可知，總黃酮得率在酶解時(shí)間為15 min時(shí)最佳，達(dá)到1.45%，在酶解時(shí)間為 5～15 min內(nèi)，南苜蓿葉總黃酮得率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而變高;之后隨著酶解時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，得率有下降趨勢(shì)。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化南苜蓿葉總黃酮提取工藝

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析 通過(guò)對(duì)各試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，得到總黃酮得率（y）回歸模型方程為：y=1.99+0.003 75A+0.045B-0.061C-0.078AB+0.001AC-0.013BC-0.2A2-0.17B2-0.31C2。南苜蓿葉總黃酮提取工藝的響應(yīng)面分析結(jié)果和回歸方程方差結(jié)果分析見(jiàn)表2、表3。

由表3可知，該模型P值=0.000 2<0.01，屬于差異極顯著模型;而失擬項(xiàng)的P值為0.802 3>0.05，差異不顯著，說(shuō)明該模型能夠預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果的分析;模型的確定系數(shù)R2值為0.967 8，R2adj為 0.926 4，說(shuō)明該試驗(yàn)所建立的模型擬合良好。

由3個(gè)影響因素的F值大小可以得出，各因素對(duì)南苜蓿葉總黃酮得率的影響大小分別為酶解溫度>酶解時(shí)間>復(fù)合酶添加量。模型中因素一次項(xiàng)酶解溫度（C）對(duì)南苜蓿葉總黃酮得率有顯著影響，二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)南苜蓿葉總黃酮得率有極顯著影響，交互項(xiàng)中的復(fù)合酶添加量（A）與酶解時(shí)間（B）對(duì)南苜蓿葉總黃酮得率影響顯著，其余項(xiàng)均不顯著。說(shuō)明各因素對(duì)南苜蓿葉黃酮得率的影響并不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，而是存在一定的交互作用。

2.2.2 交互作用分析 根據(jù)響應(yīng)面回歸方程與方差分析、試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，建立響?yīng)面試驗(yàn)3D結(jié)構(gòu)模型圖和等高線(xiàn)圖，結(jié)果見(jiàn)圖4至圖6。

由圖4至圖6可知，兩兩因素的交互作用對(duì)南苜蓿葉總黃酮得率影響作用的3D模型開(kāi)口均是向下的，即當(dāng)2個(gè)因素水平均提高時(shí)，南苜蓿葉總黃酮得率都升高;當(dāng)達(dá)到一個(gè)最高值即峰值時(shí)，南苜蓿葉總黃酮得率達(dá)到最大;當(dāng)2個(gè)因素水平繼續(xù)升高，南苜蓿葉總黃酮得率則開(kāi)始下降。通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件的計(jì)算可得最佳提取工藝方案為：復(fù)合酶用量為3.0%，酶解時(shí)間為15.7 min，酶解溫度為 39.0 ℃，此時(shí)的得率為1.99%。

2.2.3 最佳提取方案驗(yàn)證試驗(yàn) 為驗(yàn)證響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性與可靠性，根據(jù)上述響應(yīng)面試驗(yàn)得到的酶輔助乙醇提取南苜蓿葉總黃酮的最佳提取方案，設(shè)定考察因素水平為：復(fù)合酶添加量3.0%，酶解時(shí)間15.7 min，酶解溫度39.0 ℃，對(duì)南苜蓿葉進(jìn)行酶解輔助乙醇提取總黃酮化合物，得到南苜蓿葉總黃酮得率為（1.9±0.3）%，與響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果相符，說(shuō)明此響應(yīng)面模型得到的南苜蓿葉總黃酮提取工藝在實(shí)踐中同樣可行。

2.3 抑菌活性的分析

由表4可知，南苜蓿總黃酮對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制效果，按照最低抑菌濃度測(cè)試方法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，南苜蓿葉總黃酮對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.15 mg/mL，南苜蓿葉黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.2 mg/mL。

2.4 南苜蓿葉總黃酮抗氧化活性的測(cè)定

2.4.1 對(duì)DPPH·自由基清除能力的測(cè)定 由圖7可以看出，在0.2～1.0 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，南苜蓿葉總黃酮的濃度與DPPH·的清除率成正比，即越高清除率越強(qiáng)。根據(jù)Excel 2010軟件分析，南苜蓿葉總黃酮對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50為0.368 mg/mL，維生素C對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50為0.108 mg/mL。

2.4.2 對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定 由圖8可知，質(zhì)量濃度范圍在0.2～1.0 mg/mL時(shí)，南苜蓿葉總黃酮清除羥基自由基的能力隨著濃度的增加而增加，但最大值不超過(guò)60%;而維生素C對(duì)于羥基自由基的清除能力基本維持在70～90%之間。根據(jù)Excel 2010軟件分析，南苜蓿葉總黃酮對(duì)羥自由基的IC50為0.947 mg/mL，維生素C對(duì)羥自由基的IC50為0.049 mg/mL?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明，南苜蓿葉總黃酮對(duì)羥基自由基和DPPH·均表現(xiàn)出一定的清除能力，但效果不如維生素C。

3 結(jié)論與討論

以常熟本地產(chǎn)的南苜蓿葉為原料，首次采用復(fù)合酶酶解協(xié)同乙醇法提取其中的總黃酮，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)南苜蓿葉總黃酮的抗氧化活性及抑菌作用進(jìn)行初步探索，為系統(tǒng)、合理、全面地開(kāi)發(fā)南苜蓿資源建立科學(xué)依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果表明，南苜蓿葉總黃酮的最佳提取工藝方案：復(fù)合酶添加量為3.0%，酶解時(shí)間為15.7 min，酶解溫度為39.0 ℃，在此工藝條件下，南苜蓿葉黃酮得率達(dá)到（1.9±0.3）%。抑菌試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，南苜蓿葉總黃酮對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等2種菌均有明顯的抑制作用，對(duì)大腸桿菌的MIC為0.15 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為 0.2 mg/mL。體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，南苜蓿葉總黃酮對(duì)羥基自由基和DPPH均表現(xiàn)出一定的清除能力，但效果不如維生素C。

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