周楸腋芽離體培養(yǎng)快繁技術(shù)研究

張蕊 李藝 高巨 孫凌玲 張磊

摘要：為研究周楸組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，以周楸2號(hào)為材料，對(duì)帶腋芽莖段離體培養(yǎng)不同階段培養(yǎng)基中萘乙酸（NAA）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）濃度分別設(shè)計(jì)4個(gè)水平，通過研究NAA和6-BA主效應(yīng)及交互作用對(duì)腋芽誘導(dǎo)率、無菌苗增殖系數(shù)和NAA對(duì)無菌苗生根率的影響，以期明確周楸腋芽離體培養(yǎng)時(shí)最適激素條件。研究表明，周楸2號(hào)帶腋芽莖段離體培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基適宜的激素水平為NAA 0.010～0.015 mg/L，6-BA 0.6～1.2 mg/L;增殖培養(yǎng)基適宜的激素水平為NAA 0.15～0.20 mg/L，6-BA 0.8～1.6 mg/L;生根培養(yǎng)基適宜的激素水平為NAA 1.0～1.5 mg/L。

關(guān)鍵詞：周楸2號(hào);腋芽;離體培養(yǎng);NAA;6-BA;組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)： S723.1+32.6 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）17-0065-05

楸樹（Catalpa bungei C. A. Mey.）為紫葳科落葉喬木[1]，其材質(zhì)優(yōu)良、生長(zhǎng)快、壽命長(zhǎng)、適應(yīng)能力強(qiáng)，是常用的植樹造林樹木之一;同時(shí)楸樹枝葉繁茂、花開錦簇，景觀效果獨(dú)具特色，因此楸樹亦被廣泛應(yīng)用于沿路、沿河、沿水和園林綠化。隨著社會(huì)環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)和環(huán)境保護(hù)措施的不斷落實(shí)，在大規(guī)模鄉(xiāng)村和城市綠化中，政府大力倡導(dǎo)以選用優(yōu)良本土樹種為主，楸樹為河南省周口市城鄉(xiāng)綠化首選天然分布樹種之一，目前，楸樹產(chǎn)業(yè)迎來巨大發(fā)展空間和機(jī)遇。

近年來，楸樹組織培養(yǎng)技術(shù)研究得了人們的重視，楸樹組織培養(yǎng)（組培）育苗克服了傳統(tǒng)育苗生產(chǎn)中存在的常見問題（種子量少[2]、育苗周期長(zhǎng)、苗木生長(zhǎng)性狀一致性差、苗木數(shù)量和質(zhì)量難以滿足生產(chǎn)要求、嫁接苗由于插穗和砧木對(duì)水分需求不一致易導(dǎo)致“小腳”病、埋根影響母樹生長(zhǎng)[3]、扦插生根率低[4]等）。近年來有關(guān)楸樹組織培養(yǎng)（組培）育苗的報(bào)道較多，范國(guó)強(qiáng)等對(duì)金絲楸幼嫩莖段進(jìn)行離體培養(yǎng)，初次探討金絲楸組培不同階段適合的培養(yǎng)基和激素組合[5]。李艷敏等以金絲楸為試材，采用改變繼代培養(yǎng)方式、將增殖和壯苗培養(yǎng)相結(jié)合、添加對(duì)活性炭等措施，使金絲楸組培工廠化生產(chǎn)順利進(jìn)行[6]。王愛芝對(duì)花楸的幼胚等5種不同外植體進(jìn)行研究，指出適合花楸莖段和片葉的誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)條件[7]。韓創(chuàng)舉對(duì)豫楸一號(hào)扦插、嫁接、組織培養(yǎng)等無性繁殖技術(shù)參數(shù)進(jìn)行研究，指出芽接是常規(guī)苗木生產(chǎn)中簡(jiǎn)單易行的育苗方法，并且對(duì)楸樹組織培養(yǎng)條件進(jìn)行探討[8]。王改萍等對(duì)圓基長(zhǎng)果楸、豫楸1號(hào)、豫楸2號(hào)、梓樹4個(gè)品種試驗(yàn)材料的研究表明，初代培養(yǎng)基最適激素水平為N6+6-芐基腺嘌呤（6-BA） 1.5 mg/L+萘乙酸（NAA） 0.01 mg/L[9]。楊燕等通過對(duì)圓基長(zhǎng)果楸和灰楸的5種不同外植體，采用11種不同滅菌處理方法，5種不同培養(yǎng)基及不同生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、瓊脂濃度和蔗糖組合進(jìn)行試驗(yàn)研究，為楸樹組培育苗進(jìn)一步研究提供了完整的技術(shù)參考[10-11]。劉小云對(duì)圓基長(zhǎng)果楸組織培養(yǎng)各項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行了全面研究[12]。翟曉巧等對(duì)灰楸莖段誘導(dǎo)成苗進(jìn)行研究[13]。姜何對(duì)新品種魯楸1號(hào)的組培育苗進(jìn)行綜合研究，分別建立了圓基長(zhǎng)果楸、灰楸、魯楸1號(hào)的最適培養(yǎng)體系[14]。張燁然等以楸樹（QS2）和滇楸（DQ72）的優(yōu)良單株為試材，對(duì)其莖段進(jìn)行初代與增殖培養(yǎng)，提出QS2和DQ72適宜的初代培養(yǎng)基激素水平為DKW+6-BA 1.0 mg/L+吲哚丁酸（IBA） 0.1 mg/L，增殖培養(yǎng)階段適宜激素水平為DKW+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L[15]。而關(guān)于周楸系列的組培研究尚未見報(bào)道。周楸2號(hào)原產(chǎn)于河南省周口市，具有喜光、深根、速生等特點(diǎn)，其生長(zhǎng)特性表現(xiàn)優(yōu)良，在園林綠化、固沙保土、家具用材及用藥等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，有較大的發(fā)展前景，目前市場(chǎng)對(duì)其苗木需求大，優(yōu)質(zhì)苗木供需矛盾突出。本試驗(yàn)對(duì)周楸2號(hào)進(jìn)行離體培養(yǎng)快繁技術(shù)研究，以期探討出周楸組培快繁不同階段適合的激素組合，為楸樹產(chǎn)業(yè)化育苗技術(shù)研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為周楸2號(hào)，引自河南花博士花卉有限公司楸樹種植基地。

1.2 試驗(yàn)方法

供試基本培養(yǎng)基為N6，蔗糖、瓊脂用量參考楊燕的研究結(jié)果[10]，光照及溫度條件參考王改平等的研究結(jié)果[9，16]。誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)每培養(yǎng)瓶中接種3個(gè)芽點(diǎn)，每個(gè)處理接種5瓶，重復(fù)5次，隨機(jī)區(qū)組排列。

1.2.1 試驗(yàn)材料獲取與消毒 于2019年3月21日上午采集周楸2號(hào)當(dāng)年生長(zhǎng)充實(shí)的枝條，并將采集枝條帶回實(shí)驗(yàn)室，剪成長(zhǎng)15 cm帶腋芽枝段，采用1/2 Hogland's營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中24 h更換1次培養(yǎng)液，共培養(yǎng)10 d[8]。將頂芽和腋芽新萌發(fā)芽點(diǎn)切割成2 cm長(zhǎng)莖段，帶腋芽莖段的消毒滅菌依據(jù)楊燕的研究[10]。

1.2.2 楸樹無菌苗獲取 在N6培養(yǎng)基上，NAA濃度設(shè)A1（0.005 mg/L）、A2（0.010 mg/L）、A3（0.015 mg/L）、 A4（0.020 mg/L）4個(gè)水平;6-BA濃度設(shè)B1（0.6 mg/L）、B2（0.9 mg/L）、B3（1.2 mg/L）、B4（1.5 mg/L）4個(gè)水平。將消毒后帶芽點(diǎn)莖段，分別接種至上述16組不同處理的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)35 d后，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽腋芽莖段數(shù)量，計(jì)算誘導(dǎo)率[10]。

1.2.3 楸樹無菌苗繼代培養(yǎng) 在N6培養(yǎng)基上，NAA濃度設(shè)C1（0.05 mg/L）、C2（0.10 mg/L）、C3（0.15 mg/L）、C4（0.20 mg/L）4個(gè)水平;6-BA濃度設(shè)D1（0.8 mg/L）、D2（1.2 mg/L）、D3（1.6 mg/L）、D4（2.0 mg/L）4個(gè)水平。選取無污染、生長(zhǎng)健康、經(jīng)過35 d培養(yǎng)的楸樹無菌苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)，將無菌楸樹苗切成長(zhǎng)1.5 cm的帶腋芽莖段，分別接種至上述16組不同處理的增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)35 d后，統(tǒng)計(jì)再生芽個(gè)數(shù)，計(jì)算增殖系數(shù)[10]。

1.2.4 楸樹組培苗生根培養(yǎng) 在N6培養(yǎng)基上，NAA濃度設(shè)0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L 4個(gè)水平，然后選取經(jīng)過增殖培養(yǎng)的無菌苗，分別接種至上述不同NAA水平的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)生根無菌苗數(shù)量，計(jì)算生根率[10]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，雙因素方差分析以及用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基不同激素濃度對(duì)誘導(dǎo)率的影響

從表1可以看出，NAA和6-BA 2因素交互對(duì)周楸20號(hào)誘導(dǎo)率作用顯著（P=0.004<0.05）。從表2可以看出，誘導(dǎo)培養(yǎng)基NAA濃度為0.015 mg/L時(shí)，0.9 mg/L 6-BA與0.6、1.2、1.5 mg/L等其他3個(gè)濃度水平相比，差異均達(dá)顯著水平;A3B2處理對(duì)腋芽誘導(dǎo)率的影響優(yōu)于其他濃度激素組成。

從表1可以看出，對(duì)楸樹腋芽誘導(dǎo)率的影響 6-BA顯著（P=0.000<0.05），而NAA不顯著（P=0.303>0.05）。從表3可以看出，楸樹腋芽誘導(dǎo)率的影響因素以6-BA為主，其次為NAA。不同濃度NAA處理下，A3水平NAA對(duì)應(yīng)的楸樹腋芽誘導(dǎo)率平均數(shù)最大，對(duì)楸樹腋芽誘導(dǎo)率影響最大，不同濃度NAA對(duì)楸樹腋芽誘導(dǎo)率影響順序依次為A3>A2>A4>A1;同理可以得出，不同濃度6-BA對(duì)楸樹腋芽誘導(dǎo)率影響順序依次為B2>B3>B1>B4;即處理A3B2對(duì)腋芽誘導(dǎo)率的影響優(yōu)于其他試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，與簡(jiǎn)單分析結(jié)果一致。從表4可以看出， 在NAA和6-BA交互作用影響下， 處理A3B2對(duì)楸樹腋芽誘導(dǎo)率影響最大，其他設(shè)計(jì)方案中較優(yōu)組合有A4B3、A2B1。

2.2 增殖培養(yǎng)基不同激素濃度對(duì)增殖系數(shù)的影響

從表5可以看出，NAA和6-BA 2因素交互對(duì)周楸20號(hào)增殖系數(shù)的作用不顯著（P=0.358>0.05）;NAA和6-BA對(duì)楸樹無菌苗增殖系數(shù)的影響顯著（P=0.005<0.05、P=0.001<0.05），其中 6-BA 為主要影響因素，NAA次之。從表6可以看出，當(dāng)激素濃度組成為C3D1和C4D2時(shí)，腋芽增殖系數(shù)優(yōu)于其他激素濃度組成。

從表7可以看出，不同濃度NAA對(duì)楸樹無菌苗再生的影響順序依次為C4>C3>C2>C1，C4對(duì)應(yīng)的增殖系數(shù)平均數(shù)最大;不同濃度6-BA對(duì)楸樹無菌苗增殖系數(shù)影響順序依次為D2>D3>D1>D4。在NAA和6-BA的交互作用影響下，從表8可以看出，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案C3D1和C4D2對(duì)楸樹腋芽增殖系數(shù)影響最大，而其他設(shè)計(jì)方案中較優(yōu)組合有C3D2、C4D3。

2.3 生根培養(yǎng)基中不同NAA濃度對(duì)生根率的影響

從表9可以看出，1.0、1.5 mg/L NAA與0.5、2.0 mg/L相比，生根率分別提高71.42%、57.12%，差異達(dá)顯著水平。

3 討論與結(jié)論

在植物組織培養(yǎng)育苗技術(shù)研究中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是影響植物離體形態(tài)發(fā)生的最關(guān)鍵因素[17]。目前關(guān)于楸樹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中不同激素組合對(duì)不同外植體誘導(dǎo)分化、增殖和生根影響的研究報(bào)道較多，試驗(yàn)所采用楸樹品種、外植體、取材時(shí)間等不同，最適基本培養(yǎng)基類型、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及濃度等條件不同[5-15，18-23]。本試驗(yàn)初次通過分析NAA和 6-BA主效應(yīng)及其交互作用對(duì)周楸帶腋芽莖段誘導(dǎo)率、無菌苗增殖系數(shù)的影響，以及NAA不同濃度與生根率的關(guān)系，研究周楸腋芽離體培養(yǎng)不同階段的最適NAA和6-BA水平。

本試驗(yàn)分析誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不同濃度水平NAA和6-BA對(duì)楸樹腋芽誘導(dǎo)率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6-BA 主效應(yīng)和NAA與6-BA之間交互作用顯著;對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析認(rèn)為，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中NAA和6-BA最優(yōu)組合為A3B2;在NAA 4個(gè)濃度水平中，A3處理周楸2號(hào)腋芽誘導(dǎo)率平均值最大;而在不同 6-BA 濃度中B2處理周楸2號(hào)腋芽誘導(dǎo)率平均值最大，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中最優(yōu)處理組合為A3B2。最優(yōu)處理組合A3B2的周楸2號(hào)腋芽誘導(dǎo)率平均數(shù)為23.333%;其次為A4B3、A2B1，這2個(gè)處理周楸2號(hào)腋芽誘導(dǎo)率平均數(shù)分別為21.113%、19.443%;再其次為A1B2、A2B3、A3B1、A2B2、A4B1、A4B2，周楸2號(hào)腋芽誘導(dǎo)率平均數(shù)分別為16.113%、16.113%、15.003%、15.000%、14.447%、14.447%;處理組合中周楸2號(hào)腋芽誘導(dǎo)率平均數(shù)較高的前3個(gè)組合為A3B2、A4B3、A2B1，培養(yǎng)基中NAA濃度與6-BA濃度的比值均為0.017，而處理組合A1B2、A2B3、A3B1、A2B2、A4B1、A4B2中培養(yǎng)基中NAA濃度與6-BA濃度的比值均分別為0.006、0.008、0.025、0.011、0.033、0.022。因此可以認(rèn)為，誘導(dǎo)率不僅與培養(yǎng)基中NAA和6-BA的濃度有關(guān)，與NAA濃度/6-BA濃度也有一定關(guān)系，且6-BA對(duì)誘導(dǎo)率的影響較大，因此依據(jù)綜合分析初步認(rèn)為，誘導(dǎo)培養(yǎng)基合適的激素水平是NAA濃度范圍為0.010～0.015 mg/L;6-BA濃度范圍為 0.6～1.2 mg/L。而NAA和6-BA 2因素主效應(yīng)和交互作用對(duì)誘導(dǎo)率的影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究闡明。

增殖培養(yǎng)基中NAA和6-BA對(duì)無菌苗再生的主效應(yīng)顯著，其交互作用對(duì)楸樹增殖系數(shù)的影響不顯著;在NAA 4個(gè)濃度水平中，C3處理楸樹無菌苗增殖系數(shù)最高;在6-BA 4個(gè)濃度水平中，D2處理楸樹無菌苗增殖系數(shù)最高，因此可以認(rèn)為，增殖培養(yǎng)基在NAA和6-BA主效應(yīng)影響下，最優(yōu)處理組合為C3D2。但在NAA和6-BA交互作用下，C3D1、C4D2處理楸樹腋芽增殖系數(shù)平均數(shù)最大，為4.8，為最優(yōu)處理組合;其次為C3D2、C4D3處理組合，楸樹腋芽增殖系數(shù)平均數(shù)為4.4;C3D1和C4D2處理組合中NAA與6-BA的濃度比值分別為0.188和0.167，C3D2和C4D3處理組合中NAA與6-BA的濃度比值均為0.125，初步認(rèn)為增殖培養(yǎng)基合適的激素水平是NAA濃度范圍為0.15～0.20 mg/L;6-BA濃度范圍為0.8～1.6 mg/L。培養(yǎng)基中NAA和6-BA的濃度及其比值不僅影響楸樹莖段腋芽誘導(dǎo)，對(duì)無菌苗再生增殖也存在一定影響，NAA和6-BA 2因素主效應(yīng)和交互作用對(duì)楸樹莖段無菌苗增殖系數(shù)的影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究闡明。

生根培養(yǎng)基中，NAA濃度為1.0 mg/L和 1.5 mg/L 時(shí)，培養(yǎng)3 d后有根源基凸起，培養(yǎng)30 d后須根長(zhǎng)5 cm，NAA濃度為 1.0 mg/L 時(shí)須根生長(zhǎng)快，且須根較多;當(dāng)NAA濃度為2.0 mg/L時(shí)，生根率反而下降，表明高濃度NAA不利于根源基形成和幼根生長(zhǎng)。

周楸2號(hào)帶腋芽莖段離體培養(yǎng)不同階段，對(duì)NAA和6-BA的濃度及其比值需求不同。在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，需要較低濃度的NAA和較高濃度的6-BA，NAA與6-BA的濃度比值為0.017時(shí)誘導(dǎo)率較高，這可能與腋芽本身所含NAA水平較高有關(guān);在增殖培養(yǎng)階段，需要較高濃度的NAA和6-BA，NAA與6-BA的濃度比值為0.167左右時(shí)增殖系數(shù)較高;生根培養(yǎng)基階段根源基的誘導(dǎo)需要一定濃度的NAA，但過高濃度NAA會(huì)抑制幼根生長(zhǎng)。

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