石莼綠藻提取物能夠增強(qiáng)仔豬的抗病能力

任淑靜 譯自 ，doi:10.1016/j.vas.2019.100051

潘雪男 校 羅靜如 制圖表

豬呼吸道疾病是全球養(yǎng)豬生產(chǎn)者現(xiàn)今最關(guān)心的一種豬病，由其引起的保育豬的死亡數(shù)接近保育期總死亡數(shù)的54%(美國(guó)農(nóng)業(yè)部，2008年)。支氣管敗血性博德特菌(Bordetella bronchiseptica)是引起豬呼吸道疾病的最重要的病原體之一，也是豬發(fā)生萎縮性鼻炎(Atrophic Rhinitis，AR)的主要病因，AR是一種在世界各地豬場(chǎng)的保育舍中高度流行的傳染性呼吸道疾病。萎縮性鼻炎的治療通常是給患病仔豬服用抗生素。然而，抗生素耐藥性細(xì)菌的增加促使人們開發(fā)替代性藥物來(lái)保護(hù)仔豬免受一些疾病(如萎縮性鼻炎)的困擾。新生仔豬的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，在生命的最初幾個(gè)小時(shí)，它們只能通過(guò)母豬的初乳和常乳獲得被動(dòng)免疫保護(hù)。新生仔豬的存活高度依賴于在其一生最初18 h～36 h內(nèi)攝入的初乳量以及隨后攝入的常乳量。因此，重要的是要改善被動(dòng)免疫力在母豬與仔豬之間的轉(zhuǎn)移速度，這可以通過(guò)在分娩前給母豬注射免疫刺激物來(lái)實(shí)現(xiàn)。

海藻硫酸多糖提取物(Algal Sulfated Polysaccharide Extracts，MSPs)能為養(yǎng)豬生產(chǎn)者創(chuàng)造一個(gè)實(shí)用的替代性預(yù)防策略，刺激豬產(chǎn)生先天免疫應(yīng)答反應(yīng)，減少感染，從而減少抗生素的使用量。海藻是生物活性物(如MSP)的重要來(lái)源，海藻硫酸多糖提取物是一組復(fù)雜的大分子，具有各種各樣的重要的生物活性。這些水溶性化合物存在于海藻的細(xì)胞壁中，它們的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)因來(lái)源的不同(如綠藻綱、褐藻綱和紅藻綱，對(duì)應(yīng)的藻類分別為綠藻、褐藻和紅藻)而有所不同。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，海藻硫酸多糖提取物(MSPs)具有廣泛的有益的生物活性，如抗病毒、抗氧化、抗癌、抗凝血和抗高脂血的活性。此外，多項(xiàng)研究表明，海藻中的MSP提取物通過(guò)調(diào)節(jié)在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子和巨噬細(xì)胞的活性發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。這一作用已在小鼠巨噬細(xì)胞的體外試驗(yàn)中得到了證實(shí)，也在小鼠的體內(nèi)試驗(yàn)中觀察到。最近，Guriec等(2018)證實(shí)，無(wú)論是體外對(duì)異親細(xì)胞和單核細(xì)胞，還是體內(nèi)經(jīng)口服用，海藻中的硫酸多糖提取物對(duì)家禽而言也是如此。值得一提的是，從綠藻中提取的硫酸多糖提取物具有免疫調(diào)節(jié)功能，無(wú)論是作為粗藻提取物，還是作為不同模型中的高純度組分，如在小鼠巨噬細(xì)胞的體外試驗(yàn)、小鼠和雞的體內(nèi)試驗(yàn)以及大菱鲆白細(xì)胞和腹腔白細(xì)胞的體外和體內(nèi)試驗(yàn)中。綠藻可增加活性氧和一氧化氮的產(chǎn)生，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的分泌，如腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNFα)、白 介 素 (Interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8、IL-12、干擾素(Interferon，IFN)，以及參與總IgA漿細(xì)胞活化的細(xì)胞因子(TGF-β)和趨化因子(CCL20)的表達(dá)，趨化因子是一種已知能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道免疫機(jī)能多個(gè)方面的趨化因子。因此，海藻提取物已經(jīng)成為天然生物活性物的充足來(lái)源，可作為新一代生長(zhǎng)促進(jìn)劑，同時(shí)還可增強(qiáng)豬的免疫功能，改善它們的健康。

本研究評(píng)價(jià)了綠藻硫酸多糖提取物對(duì)母源免疫力在母豬與仔豬之間轉(zhuǎn)移的影響。具體而言，本研究分析了在母豬妊娠期的最后一個(gè)月向日糧中添加不同劑量的硫酸多糖提取物對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響以及對(duì)血液、初乳和常乳中抗支氣管博德特菌免疫球蛋白G(Immunoglobulin，IgG)的抗體水平以及母豬初乳和常乳中總IgA含量的影響。

1 材料和方法

石莼綠藻來(lái)自法國(guó)布列塔尼Plestin les Grèves海灘，硫酸多糖提取液按Berri等(2016)所述的方法進(jìn)行提取和分析。用Etoxate試劑盒(法國(guó)Sigma公司)檢測(cè)各內(nèi)毒素的含量，它們的含量低于試劑盒的檢測(cè)水平(0.05～0.1內(nèi)毒素單位/mL)。

32頭試驗(yàn)豬為“大白豬×長(zhǎng)白豬”雜交母豬，由一家采用“分娩-育肥”生產(chǎn)系統(tǒng)的商業(yè)性豬場(chǎng)的母豬分娩，并在同一場(chǎng)中飼養(yǎng)。試驗(yàn)?zāi)肛i在170日齡時(shí)轉(zhuǎn)入隔離區(qū)，隨后每頭母豬接種2 mL AR滅活苗(Porcilis AR-T DF；法國(guó)MSD動(dòng)物保健公司)進(jìn)行首次免疫，再分別于200日齡和330日齡接種同一疫苗，進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫，后一次接種日期約為母豬預(yù)產(chǎn)期前30 d(圖1)。試驗(yàn)?zāi)肛i平均分入4個(gè)處理(1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組——MSP1組、MSP2組和MSP3組)，每組8頭，每天分兩次飼喂同一種基礎(chǔ)日糧(上午8:00和下午5:00)，試驗(yàn)組的母豬按2 g/d、8 g/d和16 g/d的劑量補(bǔ)充硫酸多糖提取物，對(duì)照組母豬不補(bǔ)充。為了利用硫酸多糖提取物在日糧中的分布，將作為賦形劑的碎餅干(40 g)添加到所有處理的日糧中。賦形劑(對(duì)照組)或賦形劑+硫酸多糖復(fù)合物(試驗(yàn)組)在連續(xù)3 d的兩個(gè)時(shí)間段——最后一次接種抗AR疫苗前和分娩前一周——加入料槽中飼料的頂層喂給母豬(圖1)。該豬場(chǎng)通常在仔豬出生后的前兩天進(jìn)行交叉寄養(yǎng)。寄養(yǎng)通常在同一處理的母豬之間進(jìn)行，且不對(duì)所寄養(yǎng)的仔豬采樣或評(píng)估。

妊娠母豬分娩時(shí)，記錄每頭母豬的窩產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)，并對(duì)所有活的仔豬稱重。給每窩仔豬中最早出生的4頭活仔豬戴上耳標(biāo)，并個(gè)體稱重，斷奶時(shí)(分娩后21 d)再次稱重。在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，對(duì)每頭試驗(yàn)?zāi)肛i和仔豬經(jīng)腔靜脈采集血樣(圖1)。用真空容器系統(tǒng)將樣本收集入9 mL塑料管中，然后在3 000×g(Labofage 200，美國(guó)賽默飛世爾科技公司)下離心2 min，隨后分離血清并在－80 ℃下保存供進(jìn)一步處理。每頭母豬分娩開始后2 h，從其前3個(gè)乳頭中手工收集20 mL初乳，并在分娩后第7天和第21天從相同的乳頭中手工收集約30 mL常乳。給母豬頸部肌肉注射2 mL(20 IU)催產(chǎn)素(Cyctovem，法國(guó)詩(shī)華動(dòng)保公司)，以便于收集母乳。初乳和常乳樣本在收集結(jié)束后立即置于－20 ℃下保存，以供后續(xù)分析。

如Adogony等(2007)所述的那樣，通過(guò)抗博德特菌ELISA試驗(yàn)(德國(guó)IBL國(guó)際公司)檢測(cè)母豬和仔豬的血液、初乳和常乳樣本中抗博德特菌的IgG。根據(jù)制造商(美國(guó)Bethyl實(shí)驗(yàn)公司)提供的說(shuō)明書，用豬專用ELISA定量試劑盒測(cè)定常乳中的總IgA濃度。這些分析工作由法國(guó)Touraine分析試驗(yàn)室進(jìn)行。

用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)的正常性，用t檢驗(yàn)比較不同組別母豬的免疫球蛋白濃度，應(yīng)用Bonferroni法對(duì)多重比較進(jìn)行校正，用F檢驗(yàn)比較回歸線的斜率，檢查各組間免疫球蛋白水平的變化；當(dāng)回歸線平行時(shí)，還需比較它們的起點(diǎn)和高度。數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)”的方式表示，P＜0.05表示同類數(shù)據(jù)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用GraphPad Prism 4.03(美國(guó)GraphPad軟件)進(jìn)行。

2 結(jié)果及討論

尋找能夠增強(qiáng)家畜免疫功能的新的天然的生物活性物已成為全球各地現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)者的一個(gè)重要目標(biāo)。綠藻細(xì)胞壁中的硫酸多糖提取物具有重要的免疫調(diào)節(jié)和免疫刺激功能，可以作為一種有應(yīng)用前景的且可以提高家畜抵抗傳染性疾病能力的預(yù)防性添加劑。本研究評(píng)價(jià)了綠藻提取物MSP對(duì)母源免疫力在母豬和仔豬間傳遞的調(diào)節(jié)作用，并證明在母豬日糧中添加硫酸多糖提取物可提高仔豬體內(nèi)的母源免疫力。

本研究表明，硫酸多糖提取物不會(huì)影響母豬的窩產(chǎn)仔性能，如窩產(chǎn)仔數(shù)以及仔豬初生和21日齡時(shí)的體重(P＝0.05)。這與Heim等(2015)和Leonard等(2011)的研究結(jié)果相一致，這可能是由于在母豬日糧中添加硫酸多糖提取物的時(shí)間太晚，因而無(wú)法顯著影響仔豬的早期生產(chǎn)性能。分娩前34 d，所有試驗(yàn)組母豬的血清含有相同水平的IgG(P＞0.05；圖2A)。分娩前 30 d對(duì)AR進(jìn)行第2次免疫接種，試驗(yàn)組母豬血清中的IgG水平呈上升的趨勢(shì)，尤其是在分娩前的第23天。此后，三個(gè)MSP組母豬血清IgG水平持續(xù)下降，直至分娩后第14天 (P＜0.05)。這些結(jié)果可能受采集血液樣本的時(shí)間影響，本研究的采樣時(shí)間可能不是檢測(cè)硫酸多糖提取物對(duì)母豬血清IgG水平影響程度的最佳時(shí)機(jī)。Kim等(2009)證明應(yīng)在接種疫苗3周后采集血清樣本來(lái)檢測(cè)IgG水平。然而，在本研究中，接種疫苗3周后在時(shí)間上非常接近母豬的預(yù)產(chǎn)期。盡管各試驗(yàn)組母豬所產(chǎn)仔豬14日齡時(shí)的血清IgG水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的相似性(表1)，但檢測(cè)結(jié)果表明仔豬血清中的IgG水平相對(duì)較高，表明在母豬日糧中添加硫酸多糖提取物會(huì)產(chǎn)生有益的作用。

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上述結(jié)果表明，在母豬日糧中添加硫酸多糖提取物會(huì)顯著提高IgG從母豬血液向初乳的轉(zhuǎn)移率(圖2B)，特別是在最高添加量時(shí)(MSP3組；P＜0.05)。盡管這些發(fā)現(xiàn)與Leonard等(2010)的研究結(jié)果相似，但需要注意的是，Leonard等(2010)使用的是海藻提取物，且添加的時(shí)間較長(zhǎng)——從妊娠第109天到斷奶。IgG從母豬血液到初乳的轉(zhuǎn)移受FcRn受體的控制，且轉(zhuǎn)移率的提高可能歸因于該受體的轉(zhuǎn)移速度，或者通過(guò)增加該受體在乳腺上皮細(xì)胞上的表達(dá)。初乳是仔豬被動(dòng)免疫的主要來(lái)源，通過(guò)IgG從母豬轉(zhuǎn)移到仔豬。按16 g/d給母豬補(bǔ)充硫酸多糖提取物(MSP3組)，可顯著提高IgG從血液向初乳的轉(zhuǎn)移率，但并未在哺乳仔豬的血清中反映出來(lái)(表1)；按2 g/d(MSP1組)和16 g/d(MSP2組)給母豬補(bǔ)充，母豬初乳中IgG的相對(duì)增加與在哺乳仔豬血清中上觀察到的結(jié)果一致(表1)。值得注意的是，在任何采樣日，不同試驗(yàn)組母豬在乳中IgG含量上均無(wú)顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，這可能與之前確定的一些做法有關(guān)，如硫酸多糖提取物的補(bǔ)充時(shí)機(jī)和持續(xù)補(bǔ)充的時(shí)間。

盡管IgG是母豬血清和初乳中重要的免疫球蛋白血清型，但I(xiàn)gA在母豬初乳中占優(yōu)勢(shì)。在斷奶前，新生仔豬抵抗當(dāng)?shù)夭≡w的侵襲主要是通過(guò)乳源性免疫力來(lái)實(shí)現(xiàn)的。幾乎100%的初乳IgG和40%的初乳IgA來(lái)自母豬的血清，而大多數(shù)常乳IgA(＞90%)來(lái)自乳腺的局部合成。雖然給母豬飼喂硫酸多糖提取物不會(huì)影響初乳中IgA的濃度(表1)，但MSP2組母豬哺乳期乳汁中的總IgA水平高于對(duì)照組母豬的(P＜0.03；圖3)，這與Leonard等(2010)和Zanello等(2013年)的研究結(jié)果一致。分娩后第7天和第21天母乳IgA水平的劑量依賴性增加(圖3)表明，每天給母豬飼喂硫酸多糖提取物的最佳劑量為8 g，這可能與可以刺激IgA分泌漿細(xì)胞通過(guò)腸-乳腺連接轉(zhuǎn)移到乳腺的最佳劑量有關(guān)。盡管Berri等(2016)通過(guò)體外分析證明，硫酸多糖提取物可刺激CC亞族趨化因子配體 20(CC Chemokine Ligand 20，CCL20)[又稱巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3α(Macrophage Inflammatory Protein - 3α，MIP3-α]的表達(dá)，CCL20是一種能夠調(diào)節(jié)腸道免疫力多個(gè)方面的趨化因子，還需要進(jìn)一步研究，以更好地確定硫酸多糖提取物對(duì)免疫的腸-乳腺連接的作用。

3 小結(jié)

本研究證明，硫酸多糖提取物會(huì)對(duì)母豬和仔豬產(chǎn)生積極的免疫調(diào)節(jié)作用，不過(guò)其總體的免疫作用和更好的抗感染能力仍需通過(guò)深入的研究來(lái)驗(yàn)證。此外，這種免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制的驅(qū)動(dòng)因素尚不清楚，特定途徑(如常乳而不是初乳)上的不同免疫球蛋白滴度以及某些情況下的劑量特異性添加就證明了這一點(diǎn)。本次研究的結(jié)果有助于養(yǎng)豬生產(chǎn)者開發(fā)出可以預(yù)防豬呼吸道疾病的替代方案，不過(guò)還需要深入的研究來(lái)進(jìn)一步解釋其作用方式。