玫菊口服液制備工藝及體外抗氧化活性研究初探

阿不都維力·阿不都爾尼 努爾艾里·努爾買買提 張君萍 來海中 陳夢婕 晁澤陽

（1、新疆米蘭食品開發(fā)有限公司，新疆 和田8480001 2、中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所干旱區(qū)植物資源化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊830000；3、新疆特有藥用資源利用省部共建實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊830000 4、新疆昌凱生物科技有限公司，新疆 烏魯木齊830011 5、四川大學(xué)，四川 成都610065）

近年來，抗氧化是醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域研究的重點(diǎn)內(nèi)容，玫菊口服液由玫瑰花、菊苣、大棗和枸杞4 味藥材組成。研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰花中多酚類、多糖類和黃酮類物質(zhì)是玫瑰花中的抗氧化成分[1、2]。菊苣中豐富的萜類、黃酮類、酚類等物質(zhì)是菊苣中的抗氧化成分[3]。紅事多糖能有效地清除小鼠運(yùn)動過程中產(chǎn)生的自由基，防止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[4]。大棗粗多糖、中性多糖、酸性多糖對淋巴細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，即紅棗多糖可通過直接作用于免疫細(xì)胞而增強(qiáng)免疫功能[5]。枸杞多糖是枸杞發(fā)揮功效的主要成分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，枸杞多糖具有改善睡眠、增強(qiáng)免疫功能、抗氧化、抗疲勞、降低血糖等多種功效[6-8]。將玫瑰花、菊苣、大棗與枸杞結(jié)合應(yīng)用到保健品的制備中，可共同發(fā)揮這兩種成分的功效，從而使保健品抗氧化、延緩衰老的效果得以增強(qiáng)。鑒于此，研究以玫瑰花、菊苣、大棗與枸杞為原料制備了復(fù)方口服液（以下簡稱玫菊口服液），并采用1，1- 二苯基-2- 三硝基苯肼（DPPH）法、2，2- 聯(lián)氮- 二（3- 乙基－苯并噻唑－6－磺酸）二銨鹽（ABTS）法對口服液抗氧化能力進(jìn)行測定，旨在為玫菊口服液的推廣應(yīng)用奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器試劑

1.1 試驗(yàn)材料

玫瑰花、菊苣、大棗與枸杞：購于新疆安薩爾維吾爾藥業(yè)有限公司；

1.2 儀器設(shè)備

高速萬能粉碎機(jī)FW100 型/2000r/min：天津市泰斯特儀器有限公司；

CPA124S 電子天平：德國賽多利斯；

DL-1 單聯(lián)電子可調(diào)電爐：金壇市文華儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海齊欣科學(xué)儀器公司；

高速冷凍離心機(jī)：美國基因有限公司；

UV-2100 分光光度計(jì)：尤尼柯儀器有限公司。

1.3 主要試劑

以下所列試劑均為分析純，水為蒸餾水。

重蒸酚，無水乙醇，濃硫酸，乙醚，乙酸乙酯，正丁醇，三氯甲烷，磷鉬酸均為分析純；葡萄糖對照（中國藥品生物制品檢定所），沒食子酸對照（中國藥品生物制品檢定所），ABTS（SIGMA公司）；DPPH（SIGMA 公司）；

2 試驗(yàn)方法

2.1 水提工藝研究

2.1.1 指標(biāo)及測定方法

多糖含量的測定采用苯酚- 硫酸法[9]，測定口服液總多糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。多酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu比色法[10]，測定口服液總多酚含量，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品。精密吸取提取液20ml，置已干燥至恒重并稱重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃烘箱干燥5 小時至恒重，取出，迅速置干燥器中冷卻30 分鐘，精密稱定重量，計(jì)算出膏率。

2.1.2 單因素實(shí)驗(yàn)：對影響提取效率的加水量、提取時間和提取次數(shù)進(jìn)行考察，以總多糖含量、總多酚、出膏率進(jìn)行綜合評價（權(quán)重系數(shù)為0.4、0.4、0.2）。

綜合評分=（總多糖含量/最大總多糖含量）×40＋(總多酚含量/最大總多酚含量)×40+（出膏率/最大出膏率）×20

2.1.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選最佳提取條件。

表1 因素水平表

2.2 水提液的除雜

除雜方式采用高速離心法。

2.2.1 不同離心時間除雜考察

取原生藥:藥液為1:10 提取液50ml 各三份，按5000R/min轉(zhuǎn)速分別離心10、20、30min，取上清液，加水補(bǔ)足體積，測定總多糖、總多酚含量和出膏率。

2.2.2 不同離心轉(zhuǎn)數(shù)除雜考察

取原生藥:藥液為1:10 提取液50ml 各3 份，分別按3000R/min、5000R/min、8000R/min 轉(zhuǎn)速離心20min，取上清液，加水補(bǔ)足體積，測定總多糖、總多酚含量和出膏率。

2.3 水提液的澄清

根據(jù)本處方特點(diǎn)（保留多糖等天然親水膠體）,采用ZTC Ⅲ1+1 法達(dá)到分離純化的目的。提取液濃縮至生藥:藥液為1:5 時，加入ZTCⅢ1+1。

ZTCⅢ1+1 的配制：

A 組分用水配成1%溶液，先用少量水?dāng)嚦珊隣?，然后加入需要的水量，溶?4 小時，攪拌，雙層紗布過濾，即得。

B 組分用1%醋酸配成1%溶液，先用少量1%醋酸溶解組分并攪成糊狀，再加入需要量的1%醋酸，溶脹24 小時，雙層紗布過濾即得。

2.3.1 考察藥液濃縮程度對澄清效果的影響

按處方比例稱取藥材，按最佳工藝條件提取。濾液分別濃縮至生藥：水=1:3、1:5、1:8。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定在60℃時，在不斷攪拌的情況下，加入澄清劑B 組分至藥液出現(xiàn)大量絮狀沉淀，保溫2 小時，加入1/2B 量的A，保溫30 分鐘后取出，室溫放置12 小時至溶液分層，取上層液以3000R/min 轉(zhuǎn)速離心10 分鐘除雜，分別測多糖、總多酚含量和出膏率。

2.3.2 考察澄清劑加入溫度對澄清效果的影響

按處方比例稱取藥材，按最佳工藝條件提取。濾液濃縮至生藥：水=1:5 時，分別在50℃、60℃、70℃、80℃時，加入澄清劑B 組分至藥液出現(xiàn)大量絮狀沉淀，保溫2 小時，加入1/2B 量的A，保溫30 分鐘后取出，室溫放置12 小時至溶液分層，取上層液以3000R/min 轉(zhuǎn)速離心10 分鐘除雜，分別測多糖、總多酚含量和出膏率。

2.3.3 考察不同澄清劑加入量對澄清效果的影響

按處方比例稱取藥材，按最佳工藝條件提取。濾液濃縮至生藥：水=1:5 時，在70℃時，分別加入澄清劑B 的的量6%、10%、14%時，保溫2 小時，加入1/2B 量的A，保溫30 分鐘后取出，室溫放置12 小時至溶液分層，取上層液以3000R/min 轉(zhuǎn)速離心10 分鐘除雜，分別測多糖、總多酚含量和出膏率。

2.3.4 考察澄清劑A 組分加入量對澄清效果的影響

按處方比例稱取藥材，按最佳工藝條件提取。濾液濃縮至生藥：水=1:5 時，在70℃時，加入澄清劑B 的的量10%時，保溫2 小時，加入澄清劑A 的量分別為5%、8%、10%，保溫30 分鐘后取出，室溫放置12 小時至溶液分層，取上層液以3000R/min轉(zhuǎn)速離心10 分鐘除雜，分別測多糖、總多酚含量和出膏率。

2.4 滅菌

分別考察不同滅菌溫度、不同滅菌時間下的滅菌效果，并對不同滅菌條件下多糖、多酚含量及微生物數(shù)量進(jìn)行測定，確定最佳滅菌參數(shù)。

2.5 抗氧化活性測定

2.5.1 清除ABTS 自由基能力測定[11]

配制7 mmol/L 的ABTS 溶液和2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液。取等體積的兩種溶液混合。在室溫條件下避光反應(yīng)12～16h，配制成ABTS 的儲備液。臨用前用95%乙醇稀釋，使其在734nm波長處的吸光度值為0.70±0.02，此時得到ABTS 自由基工作液。在試管中加入100μl 同濃度的各樣品溶液，再加人3.9ml 的ABTS 自由基工作液，搖勻，室溫下反應(yīng)10min，于734nm 波長處測定吸光度值。用Vit C 作為陽性對照，以上實(shí)驗(yàn)平行測定3次，求其平均值。

ABTS 自由基的清除率（%）=[1-（A2-A3）/A1]×100%

式中：A1- 乙醇代替樣品溶液測得吸光度值；A2- 加入樣品后的吸光度值；A3- 乙醇溶液代替ABTS 溶液測得吸光度值。

2.5.2 清除DPPH 自由基能力測定[12]

取不同濃度的各樣品溶液2.0ml 加入DPPH 溶液（0.08mg/ml）2ml，搖勻。于室溫避光條件下靜置20min，517nm 波長處測定吸光度值。

以Vit C 作為陽性對照，以上實(shí)驗(yàn)平行測定3 次，求其平均值。DPPH 自由基的清除率計(jì)算公式為：DPPH 自由基的清除率（%）＝[1-（A4-A5）/A6]×100%

式中：A4- 樣品溶液+DPPH 溶液；A5- 樣品溶液+乙醇；A6- 乙醇+DPPH 溶液。

3 結(jié)果與分析

3.1 水提工藝研究

3.1.1 單因素試驗(yàn)

（1）加水倍量考察

按處方比例，分別稱取玫瑰花3g、菊苣4g、大棗5g 和枸杞6g，共18 克，混勻，分別加入8、10、12、14 倍量水，煎煮提取1次，每次2 小時，濾過，濾液冷卻至室溫，測定總多糖、總多酚含量和出膏率，并計(jì)算綜合評分。結(jié)果見表2。

表2 不同加水量對提取效果的影響

（2）煎煮時間考察

按處方比例，分別稱取玫瑰花3g、菊苣4g、大棗5g 和枸杞6g，共18 克，混勻，加入10 倍量水，提取時間分別0.5、1、1.5、2小時，各提取2 次，濾過，合并濾液，冷卻至室溫后，測定總多糖、總多酚含量和出膏率，并計(jì)算綜合評分，以確定煎煮時間。結(jié)果見表3。

表3 不同煎煮時間對提取效果的影響

（3）提取次數(shù)考察

按處方比例，分別稱取玫瑰花3g、菊苣4g、大棗5g 和枸杞6g，共18 克，混勻，加入10 倍量水，分別煎煮次數(shù)為1 次、2 次、3 次和4 次，每次1 小時，濾過，冷卻至室溫后，測定總多糖、總多酚含量和出膏率，以確定煎煮次數(shù)。結(jié)果見表4。

表4 不同提取次數(shù)對提取效果的影響

從表2 可見，當(dāng)加水量在12 倍量時，綜合評分已接近100分，故選擇加水量10 倍量～14 倍量進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)。從表3 可見，綜合評分隨提取時間的增大而增大，當(dāng)提取時間為1.5小時時，綜合評分為94.35 分，故選擇1.0 小時～2.0 小時進(jìn)一步進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

從表4 可見，綜合評分隨提取次數(shù)的增加而增大，當(dāng)提取2次時，綜合評分已達(dá)80.84 分，故選擇提取次數(shù)1～3 次進(jìn)一步安排正交試驗(yàn)。

3.1.2 正交試驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)確定了各因素各水平的用量范圍，在此基礎(chǔ)上，以加水量、提取時間和提取次數(shù)為因素分配各水平。因素水平安排見表1，結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表5 L9（34）正交試驗(yàn)表

表6 方差分析表

由直觀分析結(jié)果可知：各因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響程度分別為C＞A＞B，各因素的最佳水平為A1B2C3。方差分析結(jié)果表明：A因素、C 因素對試驗(yàn)結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性影響（P＜0.05），而B 因素對試驗(yàn)結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性影響（P＞0.05）。為降低成本、節(jié)省工時，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最佳提取工藝為：A1B2C2，即加水量為10 倍，提取時間為1.5h，提取次數(shù)為2 次。

3.2 水提液除雜結(jié)果

3.2.1 不同離心時間除雜結(jié)果

表7 離心時間的考察

3.2.2 不同離心轉(zhuǎn)數(shù)除雜結(jié)果

由表7、8 結(jié)果可知，雖然轉(zhuǎn)速為3000R/min 時，綜合評分高，但提取液澄清效果不如轉(zhuǎn)速為5000R/min 時，因此提取液濃縮至生藥:藥液為1:10 時，選擇5000R/min 轉(zhuǎn)速離心10 分鐘除雜。

表8 離心轉(zhuǎn)數(shù)的考察

3.3 水提液的澄清結(jié)果

3.3.1 水提液的濃縮對澄清效果的影響

表9 藥液濃縮程度考察表

表9 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)藥液濃度過大時，對有效成分損失較多，濃度較小時損失較少。因此，選擇藥材:藥液為1:5 較為合適。

3.3.2 澄清劑加入溫度對澄清效果的影響

表10 澄清劑加入溫度對澄清效果的影響

表10 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)濾液濃縮至生藥：水=1:5 時，在70℃時加入澄清劑，澄清效果最好。

3.3.3 不同澄清劑加入量對澄清效果的影響

表11 不同澄清劑加入量對澄清效果的影響

由表11 結(jié)果可知，當(dāng)澄清劑B 的加入量為6%，A 的加入量為3%時，提取液綜合評分最高，但提取液分層效果不好；當(dāng)澄清劑B 的加入量為10%，A 的加入量為5%時，提取液綜合評分較高，且溶液分層效果好。因此當(dāng)濾液濃縮至生藥：水=1:5時，在70℃時加入澄清劑B 的量為10%，A 的量為5%時，澄清效果最好。

3.3.4 澄清劑A 組分加入量對澄清效果的影響：

表12 澄清劑A 的量對澄清效果的影響

由表12 結(jié)果可知，當(dāng)濾液濃縮至生藥：水=1:5 時，在70℃時加入澄清劑B 的量為10%，A 的量為5%時，澄清效果最好。

3.4 滅菌

按處方比例稱取藥材，按最佳工藝條件提取。水提液濃縮、澄清、除雜后，移入25mL 具塞試管中，采用巴氏殺菌法，通過改變殺菌溫度和時間對樣品進(jìn)行處理，測定殺菌前后的口服微生物數(shù)量、PH、多糖含量和感官得分，確定最佳殺菌條件。

表13 滅菌方法對口服液指標(biāo)的影響結(jié)果

由表13 結(jié)果可知，在能完全殺滅微生物的條件下，采用三種條件的巴氏殺菌處理后，口服液的多糖、多酚含量方面，符合隨溫度升高而降低的趨勢，105℃/30min 條件下處理得到的口服液多糖、多酚含量顯著高于其他兩種殺菌水平。色澤口感方面，三種殺菌條件幾乎無差別。所以，巴氏殺菌法的最佳殺菌條件為化105℃/30min。

3.5 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

表14 口服液對ABTS、DPPH 的抑制活性

IC 50 值越小，玫菊口服液清除自由基的能力越強(qiáng)。由表14結(jié)果可知，玫菊口服液對對ABTS、DPPH 有明顯的清除作用，與陽性對照VC 相比，玫菊口服液清除ABTS 自由基的效果明顯高于清除DPPH 自由基。

4 結(jié)論

采用單因素實(shí)驗(yàn)，對影響提取效率的加水量、提取時間和提取次數(shù)進(jìn)行考察，以總多糖含量、總多酚、出膏率進(jìn)行綜合評價。在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定了玫菊口服液的最佳提取工藝：加水量為10 倍，提取時間為1.5h，提取次數(shù)為2 次。在此工藝條件下，將水提液濃縮至生藥：水=1:5，在70℃時加入澄清劑B 的量為10%，A 的量為5%時澄清效果最好，經(jīng)過5000R/min 轉(zhuǎn)速離心10 分鐘除雜，灌裝后，經(jīng)105℃/30min 條件下滅菌，既得玫菊口服液。采用DPPH 法、ABTS 法測定玫菊口服液抗氧化活性，結(jié)果表明玫菊口服液對DPPH 和ABTS 自由基均有一定的清除作用。從天然產(chǎn)物中探索新的清除人體自由基的抗氧化劑成為醫(yī)藥和保健事業(yè)發(fā)展的趨勢。

通過本試驗(yàn)研究，表面玫菊口服液在保健藥品上有潛在開發(fā)利用價值。