鋅對斷奶仔豬腸道屏障功能的影響

■刁 慧 張錦秀 晏家友 黃崇波 魏小蘭 周夢佳 張 杰 舒妍婕

（1.四川省畜牧科學研究院動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都610066；2. 四川省畜科飼料有限公司，四川成都610066）

仔豬在斷奶階段大腦皮層發(fā)育不健全，代謝機能旺盛，受到的營養(yǎng)、環(huán)境及心理等應激大，會導致腸道消化吸收、機體免疫和行為發(fā)生變化，表現(xiàn)為腹瀉、生長發(fā)育遲緩、甚至死亡[1]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)仔豬斷奶應激會損傷腸道黏膜屏障功能和對病原菌先天免疫應答[2-3]。為了減少斷奶給仔豬造成的負面影響，通常在營養(yǎng)、飼養(yǎng)管理、環(huán)境等方面進行改進[1]。鋅是動物機體必需的微量元素，是機體多種酶的重要組成成分或激活因子，參與細胞內信號傳導和細胞增殖，對生長發(fā)育、上皮完整性、抗氧化、免疫和繁殖等具有重要的生理和營養(yǎng)意義[4-5]。鋅是繼銅之后發(fā)現(xiàn)的在斷奶仔豬上使用的又一高效微量元素促生長添加劑，能調節(jié)腸道菌群和減少組胺釋放，有效緩解仔豬斷奶應激造成的腹瀉[6-7]。然而，研究發(fā)現(xiàn)，鋅離子濃度過高會產生極大的細胞毒性[8]。因此，本文就鋅的轉運、吸收和生物學功能進行了比較全面的綜述，重點論述了鋅在斷奶仔豬腸道屏障功能中的作用及高劑量鋅對豬機體健康造成的危害。

1 鋅的吸收轉運

鋅的吸收是一個跨細胞的過程。由于鋅離子是親水性帶電離子，自身較難通過含陰離子的細胞膜，在機體內不能以簡單的被動擴散方式進行跨膜轉運，必須與配體結合從而完成腸細胞對鋅的攝取。Evans等（1975）[9]研究發(fā)現(xiàn)，鋅吸收模式分為三步：①吸收：胰腺可向腸腔中分泌一種鋅結合體，腸腔中的鋅與之結合后穿過腸黏膜細胞頂膜進入細胞；②細胞內轉運：鋅從腸黏膜細胞頂膜到基底膜；③進入血液：鋅穿過小腸黏膜細胞基底膜，釋放鋅離子進入門脈循環(huán)。飼糧中大部分未被吸收的鋅經糞便排出體外。兩大鋅轉運蛋白在機體鋅離子的吸收和轉運過程發(fā)揮重要作用，這兩大家族分別：負責降低細胞質中鋅離子的ZNT家族和負責增加細胞質中鋅離子的ZIP家族[10-11]。此外，金屬硫蛋白和金屬反應原件結合轉錄因子-1也參與到機體鋅穩(wěn)態(tài)的調控[12]。迄今為止，除了金屬硫蛋白之外還沒有發(fā)現(xiàn)其他的蛋白具有臨時存儲細胞中的鋅的功能[13]。

作為一種微量營養(yǎng)素，鋅在動物小腸被吸收入血進而轉移到各個組織器官中。Methfessel 等（1973）[14]以Zn65作為標記，同時結合腸段結扎手段來研究大鼠對鋅的吸收，結果表明鋅吸收的最大部位為十二指腸，其次為空腸和回腸。Hampton 等（1976）[15]以Zn65作為標記，同時結合小腸注射手段來研究大鼠對鋅的吸收，結果同樣發(fā)現(xiàn)在飼喂不同濃度鋅（鋅缺乏、適宜鋅、高鋅）的情況下，最大吸收部位均為十二指腸。Hill 等（2014）[16]在仔豬上的研究發(fā)現(xiàn)，飼喂不同濃度鋅（25～100 mg/kg），仔豬十二指腸金屬硫蛋白的含量高于其他腸段，表明仔豬對鋅的可利用性增加，間接說明十二指腸是鋅的主要吸收場所。綜上所述鋅在動物體內的吸收發(fā)生在整個腸段，包括十二指腸、空腸和回腸，其中十二指腸是主要吸收場所。

2 鋅的生物學功能

鋅與機體內多種酶的活性有關，是酶的重要組成部分或激活因子。這些含鋅金屬酶分為氧化還原酶、轉移酶、連接酶、水解酶、裂合酶和異構酶等，它們與機體蛋白質、糖類、脂類、礦物質和維生素等的代謝密切相關，參與基因的轉錄、翻譯，細胞增殖、分化及細胞內信號傳導，對動物生長發(fā)育和腸道保護具有重要的生理和營養(yǎng)意義[4]。鋅耗竭試驗證實，缺鋅會導致仔豬平均日增重極顯著降低，生長激素合成下降，生長激素結合蛋白表達減少，以及由生長激素誘導合成的胰島素樣生長因子1（IGF-1）合成減少，進而引起生長受阻[17]。研究發(fā)現(xiàn)，鋅缺乏會導致皮膚膠原蛋白合成減少，隨著飼糧鋅含量的增加，膠原蛋白和角蛋白增加，上皮細胞層厚度增加，有利于皮膚抗損傷，因此，鋅在膠原蛋白合成和上皮細胞增殖過程中發(fā)揮著重要的作用[18]。作為腎上腺皮質的固有成分，鋅在垂體和性腺等處富集，參與垂體-促性腺激素-性腺等諸多過程的調節(jié)，從而影響性激素分泌及性腺活動，最終影響動物繁殖性能[19]。鋅可通過參與氧化代謝相關酶類的組成，如Cu/Zn SOD，調節(jié)機體內的氧自由基的平衡，發(fā)揮抗氧化功能[20]。此外，鋅在機體免疫功能扮演者重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏會引起胸腺和淋巴組織萎縮，導致動物免疫機能紊亂，引發(fā)復雜的免疫缺陷疾病，例如腸病性肢端皮炎，通過補鋅可使機體恢復健康[21]。因此，鋅與維持機體上皮完整性和生長發(fā)育、抗氧化、免疫和繁殖功能息息相關。

3 鋅對斷奶仔豬腸道屏障功能的影響

作為動物體內最大的消化、吸收和免疫器官，腸道參與營養(yǎng)物質的消化和吸收、維持電解質平衡，同時還是阻止病原微生物感染的第一道屏障，對于機體防御功能起著重要的作用。腸道屏障由物理屏障（細胞間緊密連接）、生物屏障（腸道微生物）、免疫屏障（細胞免疫和體液免疫）和化學屏障（分泌蛋白）組成，這四種屏障各自承擔著不同的角色并結合在一起，抵抗外界有害物質對機體的侵襲[22]。當腸道屏障功能被破壞時，腸道微生物和內毒素突破腸道屏障防線，進入體內其他組織、器官和血液循環(huán)系統(tǒng)，引起腸原性感染[23]。

3.1 物理屏障

鋅可以促進腸道的發(fā)育，改善腸道黏膜形態(tài)。Zhu 等（2016）[24]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加3 000 mg/kg 氧化鋅提高斷奶仔豬十二指腸絨毛高度，降低隱窩深度，改善腸道黏膜形態(tài)。龍麗娜（2018）[25]研究指出，飼糧添加500 mg/kg多孔氧化鋅或納米氧化鋅顯著增加斷奶仔豬空腸和回腸絨毛高度以及十二指腸、空腸和回腸絨隱比，降低十二指腸和空腸隱窩深度。Wang 等（2018）[26]同樣發(fā)現(xiàn)，飼糧添加450 mg/kg 納米氧化鋅和3 000 mg/kg 氧化鋅均可提高斷奶仔豬小腸絨毛高度和絨隱比。有機鋅上的研究表明，飼糧添加100 mg/kg 乳酸鋅增加斷奶仔豬腸絨毛高度，降低隱窩深度[27]；飼糧添加300 mg/kg 蛋氨酸鋅降低仔豬小腸隱窩深度，提高絨毛高度，增加絨毛寬度，提高小腸二糖酶活性[28]。鋅可以直接調節(jié)胃底腺細胞分泌胃饑餓素（Ghrelin）和小腸黏膜細胞IGF-1的分泌，促進消化道發(fā)育，進而緩解斷奶對仔豬腸道帶來的應激，提高生長性能[29]。同時，鋅的添加可以上調斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸TFF3（三葉因子3）和Nrf2（核轉錄因子2）的mRNA 表達水平[25]，這就提示鋅可能通過調節(jié)TFF3、Nrf2和IGF-1的表達來影響腸道黏膜結構形態(tài)。

圖1 鋅對斷奶仔豬腸道屏障功能的影響

體外試驗研究發(fā)現(xiàn)，以人上皮細胞為模型，鋅缺乏使結合于蛋白質上的鋅釋放出來，增加細胞質中的游離鋅的含量，導致細胞生長受到抑制、緊密連接蛋白被破壞，最終腸道屏障功能受損[30]。同樣地，Sarkar等（2018）[31]研究發(fā)現(xiàn)，缺鋅會改變細胞旁離子電導，加劇細菌感染，緊密連接復合體因膜融合蛋白少而增寬，形態(tài)扭曲，同時Cl-分泌減少，由此說明缺鋅破壞腸道完整性，導致腸道屏障功能紊亂和完整性改變，導致感染易感性。相反，添加鋅減少氯化物的分泌[32]，增加細胞跨膜電阻[33]，維持細胞緊密連接完整性，改善腸道的屏障功能。鋅離子能夠使緊密連接蛋白Claudin-2和Claudin-4的重新分布，并通過細胞外信號調節(jié)激酶（ERK1/2）調節(jié)緊密連接蛋白的磷酸化狀態(tài)緩解志賀氏菌病攻毒對腸道屏障造成的紊亂[34]。因此，機體需要足夠的鋅來維持腸道屏障的健康，以避免腸道感染的風險。體內試驗研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加2 000～3 000 mg/kg 氧化鋅可以通過提高腸道緊密連接蛋白Occludin 和ZO-1的基因表達改善斷奶仔豬腸道的滲透性，維持腸道屏障功能完整性[35]。Pei等（2019）[36]研究同樣指出，飼糧添加800 mg/kg 納米氧化鋅顯著降低斷奶仔豬血清中二胺氧化酶的活性，提高回腸黏膜中ZO-1 的基因表達。Shao 等（2017）[37]研究發(fā)現(xiàn)，鋅能增強CACO-2 細胞的分化，并通過激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）信號通路來提高細胞之間的緊密連接蛋白ZO-1 的表達。由此可見，鋅可能通過ERK 和PI3K/AKT/mTOR 信號通路影響細胞間緊密連接蛋白的重組和表達進而調控斷奶仔豬腸道物理屏障功能。

3.2 免疫屏障

長期鋅缺乏導致腸黏膜免疫屏障受損并伴隨炎癥細胞的浸潤，特別是上皮多核淋巴細胞在腸道黏膜上的遷移失控，誘發(fā)黏膜損傷[38]。體外試驗研究表明，氧化鋅減少了大腸桿菌腸毒素處理誘導的CACO-2細胞中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的基因表達[39]。Sarkar 等（2019）[34]研究表明，鋅離子能夠降低白介素-6（IL-6）和白介素-8（IL-8）的蛋白水平，緩解志賀氏菌病攻毒引起的炎性反應。體內試驗研究發(fā)現(xiàn)，鋅可以促進腸道上皮細胞分泌型免疫球蛋白（SIgA）和炎性因子的分泌，增強腸道免疫力[40]。Yi等（2016）[41]報道，飼糧中添加3 000 mg/kg氧化鋅提高空腸黏膜中轉化生長因子-β（TGF-β）mRNA 表達，降低促炎細胞因子白介素-1β（IL-1β）和干擾素-γ（IFN-γ）mRNA 表達。飼糧添加800 mg/kg納米氧化鋅顯著提高斷奶仔豬回腸黏膜中IL-1β、IL-10、TNF-α和腫瘤增殖抗原（KI-67）的基因表達[36]。隨著斷奶仔豬飼糧中包膜氧化鋅濃度的增加（100、200、400 mg/kg），空腸黏膜IL-10基因表達量呈線性增加，而IL-6 基因表達量呈線性降低[42]。此外，飼糧添加100 mg/kg 乳酸鋅通過提高腸道黏膜金屬硫蛋白1基因表達，誘導腸道黏膜組織C-反應蛋白（CRP）、觸珠蛋白（HP）和α1 酸性糖蛋白（AGP）基因表達上調，增加仔豬的抗病能力[27]。綜上，鋅通過調控腸道炎性因子、分泌型免疫球蛋白和組織急性期蛋白維持仔豬腸道免疫屏障功能。

3.3 生物屏障

鋅作為機體必需的微量元素參與體內蛋白質的合成同時也是宿主體內微生物定植和增殖所必需的礦物元素，因此，鋅與腸道微生物息息相關。體外研究發(fā)現(xiàn)，氧化鋅具有較強的殺菌作用，通過破壞大腸桿菌K88的菌體細胞膜，使內容物外泄致使細菌死亡[43]，同時還能抑制大腸桿菌對腸細胞的黏附，避免大腸桿菌對腸細胞的破壞[39]。仔豬腸道食糜中加入氧化鋅抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的增殖[44]。然而，關于鋅對仔豬腸道微生物影響的體內試驗研究結果存在一定的差異。藥理性劑量（3 042 mg/kg）氧化鋅飼喂仔豬增加其腸道中兼性厭氧細菌的增殖，改變腸道微生物的豐度和多樣性[45]。Ciesinski等（2018）[46]研究表明，高劑量氧化鋅（2 013 mg/kg）增加仔豬腸道多耐藥性大腸桿菌的數(shù)量。然而，Li等（2001）[47]發(fā)現(xiàn)日糧中添加3 000 mg/kg氧化鋅對斷奶仔豬腸道食糜中大腸桿菌、梭狀芽孢桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量均無顯著影響。Wang等（2018）[26]用氧化鋅和納米氧化鋅飼喂仔豬，結果發(fā)現(xiàn)飼糧添加450 mg/kg 納米氧化鋅顯著降低斷奶仔豬盲腸、結腸和直腸糞便中大腸桿菌的數(shù)量，而3 000 mg/kg 氧化鋅對腸道食糜中大腸桿菌的數(shù)量無顯著影響。Pei等（2019）[36]考察鋅對斷奶仔豬腸系膜淋巴結中微生物的影響，結果發(fā)現(xiàn)飼糧添加800 mg/kg納米氧化鋅顯著降低斷奶仔豬腸系膜淋巴結中總厭氧菌的數(shù)量。有機鋅上的研究發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬飼喂100 mg/kg殼聚糖鋅盲腸和結腸內容物中大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量顯著降低，而有益菌乳酸桿菌數(shù)量顯著提高[48]。體內試驗不一致的原因可能與鋅的添加形式、添加量、動物的生理階段和健康狀況以及微生物檢測本身的不穩(wěn)定性有關。腸道內的有害菌可以通過黏附腸上皮細胞破壞腸黏膜上皮細胞的完整性，使腸道內有害物質及菌群通過血液進入體內進入循環(huán)，進而造成動物全身性感染而死亡。Roselli等（2003）[49]在體外試驗中發(fā)現(xiàn)添加1 mmol/l氧化鋅可以抑制大腸桿菌在CACO-2細胞的黏附。Broom等（2006）[50]同樣發(fā)現(xiàn)添加高鋅抑制細菌移位。因此，鋅可能通過減少大腸桿菌等有害菌對腸上皮細胞的黏附和移位改善腸道的生物屏障功能，進而維持機體健康。

3.4 化學屏障

短期缺鋅導致腸黏膜杯狀細胞數(shù)量減少，黏膜蛋白含量降低，而長期缺鋅使杯狀細胞數(shù)量、面積和直徑、黏膜厚度以及蛋白含量均降低，說明缺鋅可引起腸道黏液分泌細胞的超微結構遭受損害[51]。在機體黏膜的化學屏障中，分泌蛋白作為其中重要的組成部分，鋅會促進腸上皮細胞分泌抗菌肽[52]?？咕腖L-37 具有潛在的廣譜抗菌活性，包括金黃色葡萄球菌，大腸埃希氏菌和真菌等，補鋅可以增加CACO-2細胞分泌抗菌肽LL-37，并且具有劑量效應[53]。豬抗菌肽PR-39對細菌、真菌有廣譜抗菌能力，對病毒、原蟲及癌細胞也有一定的作用，研究發(fā)現(xiàn)，斷奶對仔豬PR-39 mRNA 表達有較大影響，斷奶后仔豬腹瀉率和死亡率高可能與抗菌肽表達下降有關，補充鋅顯著增加了仔豬斷奶后15 d PR-39 mRNA 的表達[54]。由此可知，鋅可通過調控腸上皮細胞分泌蛋白的表達進而維護其化學屏障功能。

4 高劑量鋅的負面影響

鋅缺乏會導致機體出現(xiàn)一系列的功能障礙，但急性或慢性的鋅暴露，導致鋅離子濃度過高也會產生極大的細胞毒性[8]。給予巴馬豬藥理劑量的硫酸鋅（1 500 mg/kg）提高十二指腸和空腸Bcl 相關X 蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8（Caspase-8）的基因表達量，刺激細胞凋亡，導致腸道上皮損傷[55]。飼糧添加2 000 mg/kg碳酸鋅顯著降低仔豬采食量，同時出現(xiàn)胃炎、卡他性腸炎和腸系膜充血等各種癥狀[56]。體外試驗研究發(fā)現(xiàn)，適宜劑量的氧化鋅降低了CACO-2的通透性，而高劑量的氧化鋅可能會對CACO-2細胞產生毒性，使通透性增加[49]。目前，畜禽飼糧中最常用的鋅添加形式為高劑量無機鋅，主要包括氧化鋅和硫酸鋅。高劑量無機鋅易吸潮、生物學利用率極低，大量鋅隨糞便排出體外，造成資源的浪費，同時對環(huán)境造成極大的壓力。Meyer等（2002）[57]研究表明日糧添加2 000～3 000 mg/kg氧化鋅顯著增加糞樣中鋅的排放量，是飼喂基礎飼糧的33倍。Jondreville等（2003）[58]指出，以糞便作為肥料應用時，糞便中殘留的鋅會隨著糞便進入土壤并蓄積，產生嚴重的金屬毒性，這對周圍植物的生長、土壤中的微生物和生態(tài)環(huán)境產生威脅。此外，在飼糧中添加4 000 mg/kg氧化鋅會抑制其他微量元素的吸收，降低植酸酶的活性[59]。因此，長期使用高劑量鋅不僅不利于仔豬健康，還加劇了生態(tài)環(huán)境的壓力。

5 結語

鋅作為必需微量元素，參與機體內多種酶的組成，對斷奶仔豬腸道屏障功能具有重要的作用（圖1）。高劑量氧化鋅能有效控制仔豬腹瀉，緩解斷奶應激，但高鋅的使用會給生態(tài)環(huán)境帶來巨大的壓力。目前，有關鋅對腸道屏障功能保護作用的分子機制尚不完全清楚，在各種應激條件下的最佳添加來源、添加量和最佳投喂方式也研究甚少，鋅對腸道微生物影響的研究結果不一致。因此，從腸道屏障入手，用分子生物學手段進一步研究鋅源和鋅水平對仔豬斷奶應激緩解的作用機制，弄清鋅對腸道微生物的調控途徑，有利于尋找高鋅替代物，緩解生產和生態(tài)之間的矛盾，提高經濟效益。