黃酒酵母在黃酒發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)芳香醇差異分析

周佳冰，張雅卿，劉雙平，徐岳正，周建弟，毛 健，

（1.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122；2.江蘇省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院食品生物技術(shù)研究所（如皋江大食品生物技術(shù)研究所有限公司），江蘇南通 226500；3.國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心,浙江古越龍山紹興酒股份有限公司,浙江紹興 312000）

黃酒作為中華民族歷史最悠久、最古老的特色酒精飲料，是以稻米、黍米、小米、玉米、小麥、水等為主要原料，經(jīng)加曲和部分酶制劑、酵母等糖化發(fā)酵劑釀制而成的發(fā)酵酒，與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒[1-3]。黃酒酒性柔和，酒味醇厚，蛋白質(zhì)種類豐富，并且富含氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分[4-5]。

高級(jí)醇是含3個(gè)以上碳原子的醇類的總稱，是酒類發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物，主要由釀酒酵母代謝所產(chǎn)生[14]，芳香醇則是帶有苯環(huán)的高級(jí)醇，主要包括β-苯乙醇、酪醇與色醇，是黃酒中主要的風(fēng)味物質(zhì)，黃桂東等[11]對(duì)不同年份半干型紹興酒分析發(fā)現(xiàn)，高級(jí)醇中β-苯乙醇對(duì)香氣的貢獻(xiàn)最大。釀酒酵母體內(nèi)芳香醇的合成主要通過(guò)Ehrlich途徑和莽草酸途徑[16-19]，莽草酸途徑合成芳香醇代謝途徑長(zhǎng)、存在多種抑制作用，這也使得酵母通過(guò)該途徑合成芳香醇的量一般都偏低。較高含量的芳香醇會(huì)產(chǎn)生一定的致醉性，但適量的芳香醇可以賦予黃酒特有的醇香、豐滿圓潤(rùn)和協(xié)調(diào)的口感[6-10]；而料酒作為以黃酒為主要原料的調(diào)味品，在烹調(diào)過(guò)程中具有增加食物香味的作用[12-13]，也需要控制適宜的芳香醇含量。

不同的酵母菌種的生理特性各不相同，在發(fā)酵過(guò)程中代謝副產(chǎn)物的種類及含量存在顯著差異[15]，為了有效控制黃酒中芳香醇的含量，探究黃酒酵母與釀酒酵母模式菌產(chǎn)芳香醇差異及原因是非常有必要的。本文通過(guò)比較芳香醇高產(chǎn)菌株黃酒酵母HJ與釀酒酵母模式菌株BY4743在黃酒發(fā)酵過(guò)程中(前酵0～120 h，后酵120～480 h)的理化指標(biāo)、芳香醇與氨基酸的動(dòng)態(tài)變化，探究黃酒酵母產(chǎn)芳香醇差異及影響因素，為黃酒中芳香醇的調(diào)控提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：生麥曲、熟麥曲，古越龍山紹興酒股份有限公司；粳糯米，市售。

菌種：黃酒酵母HJ，古越龍山紹興酒股份有限公司；模式菌株BY4743，由實(shí)驗(yàn)室保存。

試劑及耗材：β-苯乙醇、色醇、酪醇、甲醇等均為色譜純；氯仿、異戊醇、冰乙酸、三氯乙酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；糖化酶（120000 U/mL）、液化酶（120000 U/mL），蘇州宏達(dá)制酶有限公司。

儀器設(shè)備：高效液相色譜Waters e2695，美國(guó)沃特世公司；Trace 1300 ISQ單四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司；超聲清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；金屬浴，杭州奧盛儀器有限公司；小型高速離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；水浴恒溫振蕩器，太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；全自動(dòng)立式蒸汽滅菌器，馳通儀器（上海）有限公司；pH計(jì)，瑞士Mettler Toledo公司；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酒制作

（1）酵母的活化

配制一定量的YPD培養(yǎng)基，分裝，115 ℃滅菌20 min；按8 ‰的接種量將甘油保藏管的酵母菌（黃酒酵母HJ與模式菌BY4743）分別轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，在無(wú)菌操作臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)接；將轉(zhuǎn)接好的酵母在30 ℃，200 r/min條件下，培養(yǎng)24 h，備用。

（2）酒母的培養(yǎng)

米飯、水按1∶4比例混合，加入液化酶（1.1‰）、糖化酶（1.1‰）和生麥曲（10%）進(jìn)行液化與糖化，溫度控制在60 ℃，時(shí)間3～4 h，糖化結(jié)束后外觀糖度不低于12°Bx，115 ℃滅菌20 min，待冷卻至24～31 ℃，分別接入（1）中培養(yǎng)成熟的酵母種子培養(yǎng)液5%，培養(yǎng)溫度不超過(guò)31 ℃，培養(yǎng)時(shí)間20 h，培養(yǎng)成熟后備用。

（3）蒸飯

稱取一定量的米，加入常溫自來(lái)水，浸泡1 d。將蒸鍋中的水燒開(kāi)，取一定量的米均勻分散在紗布之上，蒸煮10 min，后用85 ℃以上的熱水進(jìn)行噴灑，將噴灑后的米飯?jiān)俅握糁?0 min，準(zhǔn)備出鍋。將蒸好的米飯攤冷，準(zhǔn)備落料。

（4）落料

按照表1配方將米飯、自來(lái)水、生麥曲、熟麥曲、酒母同時(shí)加入，并混合均勻，兩個(gè)發(fā)酵體系除酒母外均保持一致。前發(fā)酵：28 ℃恒溫發(fā)酵5 d，前5 d每天開(kāi)耙不少于1次，頭耙時(shí)間8～10 h。后發(fā)酵：后酵時(shí)間15 d，后酵控制溫度15 ℃±2 ℃。每2 d攪拌開(kāi)耙1次。

表1 黃酒發(fā)酵體系

（5）發(fā)酵與取樣

按照（4）中發(fā)酵體系及發(fā)酵溫度進(jìn)行發(fā)酵，黃酒酵母HJ與模式菌BY4743均取3個(gè)平行。分別在發(fā)酵24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、216 h、288 h、360 h、480 h時(shí)間點(diǎn)取樣，共計(jì)10次。

1.2.2 理化指標(biāo)的測(cè)定

總酸采用酸堿滴定法、氨基態(tài)氮采用甲醛滴定法進(jìn)行測(cè)定，具體方法見(jiàn)GB/T 13662—2018《黃酒》；還原糖含量的測(cè)定采用DNS法[22]。

1.2.3 HPLC測(cè)定酪醇與色醇

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

以水為溶劑，配制酪醇600 mg/L、色醇600 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液分別稀釋100倍、50倍、10倍、2倍后進(jìn)樣，以峰面積為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

（2）色譜條件

色譜柱：XBridge C18(250×4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。采用峰面積外標(biāo)法定量；柱溫：30 ℃；流速：0.75 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：甲醇∶水∶冰乙酸（50∶49∶1）。

（3）樣品的處理

取10 mL樣品12000 r/min離心10 min，取3 mL上清液與3 mL的10 %三氯乙酸溶液混合，渦旋混勻1 min，于4 ℃下靜置4 h，取上清液1 mL過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后可直接進(jìn)樣測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中的芳香醇含量。

1.2.4 β-苯乙醇的測(cè)定

采用氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）測(cè)定黃酒樣品中的β-苯乙醇含量，樣品預(yù)處理方法以及檢測(cè)方法參照已有文獻(xiàn)[23]。

1.2.5 發(fā)酵醪中20種游離氨基酸與水解氨基酸含量的測(cè)定方法

（1）游離氨基酸處理方法

利用異硫氰酸苯酯衍生劑與游離氨基酸進(jìn)行衍生反應(yīng)，采用HPLC測(cè)定發(fā)酵醪中游離氨基酸，具體方法參照文獻(xiàn)[27]。

（2）酸水解氨基酸測(cè)定方法

稱取150 mg左右均質(zhì)后的黃酒發(fā)酵醪于水解管中，加8 mL HCl（6 mol/L）搖勻，充氮?dú)? min，擰緊水解管，放入120 ℃烘箱水解22 h，將水解管樣品轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加4.8 mL NaOH（10 mol/L）中和，定容至25 mL，雙層濾紙過(guò)濾，取1 mL澄清液離心(15000 r/min，30 min)，上清液過(guò)膜待測(cè)，測(cè)定方法同1.2.5.1。

（3）堿水解氨基酸(色氨酸)測(cè)定方法

稱取150 mg均質(zhì)后的黃酒發(fā)酵醪于水解管中，加8 mL NaOH（5 mol/L）搖勻，充氮?dú)? min，擰緊水解管，放入120 ℃烘箱水解22 h，將水解管樣品轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加6.7 mL HCl（6 mol/L）中和，定容至25 mL，雙層濾紙過(guò)濾，取1 mL澄清液離心(15000 r/min，30 min)，上清液過(guò)膜待測(cè)，測(cè)定方法同1.2.5(1)。

1.2.6 酸性蛋白酶活力測(cè)定

酸性蛋白酶活力的測(cè)定參考《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》，定義1 g黃酒發(fā)酵醪在30 ℃、pH 3.0的條件下，1 min水解酪蛋白為1 μg酪氨酸，為1個(gè)酶活力單位，單位是U/g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，采用Excel 2013和origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，測(cè)試結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示；采用R 3.5.1中的corrplot包繪制相關(guān)性分析圖；SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程理化指標(biāo)變化曲線

不同的酵母有著不一樣的發(fā)酵特性[15]，因此它們?cè)谙嗤瑮l件下發(fā)酵產(chǎn)生的酒精度等理化指標(biāo)也有著一定的差異。由圖1可知，黃酒酵母HJ還原糖的消耗速率明顯快于模式菌BY4743，黃酒酵母HJ在發(fā)酵第96 h還原糖已消耗殆盡，而模式菌BY4743直到120 h才被消耗完；黃酒酵母HJ具有較高的發(fā)酵效率，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)其酒精度比模式菌BY4743高1 %vol左右；氨基態(tài)氮的含量均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到最高。結(jié)果表明，黃酒酵母HJ在黃酒發(fā)酵過(guò)程中還原糖消耗能力與產(chǎn)酒精能力要強(qiáng)于模式菌株BY4743。

2.2 總氨基酸與游離氨基酸的變化

2.2.1 黃酒發(fā)酵過(guò)程總氨基酸變化

黃酒中的氨基酸是一類重要的營(yíng)養(yǎng)素，主要來(lái)自原料及微生物的代謝作用[30]，且酵母能夠利用氨基酸通過(guò)Ehrilch途徑合成相應(yīng)的醇[17]。由表2可知，黃酒在發(fā)酵初期有較為豐富的總氨基酸，黃酒酵母HJ與模式菌BY4743在發(fā)酵過(guò)程中總氨基酸均有一定的降低，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在HJ的黃酒體系中總氨基酸的消耗量達(dá)到1.208 g/L，高于BY4743(0.696 g/L)，與模式菌BY4743相比，黃酒酵母HJ發(fā)酵醪中苯丙氨酸、酪氨酸與色氨酸的消耗量分別提高了65.3%、34.9%、76.5%。說(shuō)明黃酒酵母HJ對(duì)于氨基酸的利用能力要高于模式菌BY4743。

2.2.2 黃酒發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸的變化

從圖2可知，兩株酵母發(fā)酵液中游離氨基酸的含量均隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其中黃酒酵母HJ中的游離氨基酸在發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到2700 mg/L，是模式菌BY4743的1.5倍。游離氨基酸在前酵期間的增加是由發(fā)酵醪中酵母產(chǎn)生的蛋白酶水解原料中的氨基酸導(dǎo)致的，而后酵期間游離氨基酸的增加是由于后酵期間部分酵母菌自溶，伴隨著大量氨基酸和多肽產(chǎn)生[25]。

在黃酒發(fā)酵體系中，氨基酸釋放的量主要由發(fā)酵醪中游離氨基酸的含量和微生物消耗的氨基酸含量組成。由圖2可知，發(fā)酵結(jié)束后，黃酒酵母HJ發(fā)酵醪中芳香族游離氨基酸含量達(dá)到0.38 g/L，結(jié)合2.2.1中芳香族氨基酸的消耗量0.315 g/L可知，黃酒酵母HJ發(fā)酵醪中芳香族氨基酸的釋放量為0.695 g/L，芳香族游離氨基酸的釋放率達(dá)25.16%，其中有45.32 %的芳香族游離氨基酸被HJ用于自身代謝與芳香醇的合成，同理可知，BY4743的芳香族游離氨基酸釋放率只有10.75%，其中有41.75%被BY4743用于自身代謝與芳香醇的合成。黃酒酵母HJ的芳香族游離氨基酸釋放率是模式菌BY4743的2.34倍，說(shuō)明相比較于模式菌BY4743，黃酒酵母HJ有更高的氨基酸釋放率。

表2 發(fā)酵醪中總氨基酸含量變化

2.3 發(fā)酵過(guò)程芳香醇變化曲線

芳香醇是酵母合成細(xì)胞蛋白質(zhì)時(shí)的副產(chǎn)物[14]，由于不同的酵母有著不同的理化特性，因此在相同條件下兩株酵母產(chǎn)生的芳香醇也存在著一定的差異。如圖3所示，兩株酵母在前酵過(guò)程中芳香醇隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)都有不同程度的提升，黃酒酵母HJ在黃酒發(fā)酵過(guò)程中3種芳香醇的含量均高于模式菌BY4743，前酵結(jié)束時(shí)，黃酒酵母HJ中β-苯乙醇、酪醇以及色醇的含量分別為100.71 mg/L、66.24 mg/L、2.05 mg/L，總芳香醇含量相比模式菌BY4743提高了20%。在后酵期間，兩株酵母的發(fā)酵體系中芳香醇的含量均有所下降，RODMAN等[24]認(rèn)為，當(dāng)發(fā)酵溫度低于30 ℃時(shí)，溫度越高，發(fā)酵速度越快，因此后酵溫度(16 ℃)不利于酵母的生長(zhǎng)代謝，使酵母無(wú)法正常利用氨基酸來(lái)合成芳香醇，并且芳香醇具有一定的揮發(fā)性，由此導(dǎo)致了發(fā)酵中后期黃酒發(fā)酵醪中芳香醇含量的降低。

由2.2可知，相比較于模式菌BY4743，黃酒酵母HJ具有更高的氨基酸釋放率和利用能力，這也使得黃酒酵母HJ總芳香醇含量比模式菌BY4743提高了20 %，說(shuō)明除了選用不同品種的釀酒酵母來(lái)控制芳香醇之外，黃酒發(fā)酵過(guò)程中原料氨基酸的釋放也是控制芳香醇濃度的重要切入點(diǎn)。

2.4 發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

本文對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)以pearson相關(guān)系數(shù)為基礎(chǔ)。前酵如圖4所示。可以發(fā)現(xiàn)黃酒酵母HJ前酵過(guò)程中酒精度與酸度（r=0.9）、氨基態(tài)氮（r=0.76）、苯乙醇（r=0.92）、酪醇（r=0.99）和色醇（r=0.86）呈極強(qiáng)的正相關(guān)，這些物質(zhì)均是釀酒酵母發(fā)酵過(guò)程中正常的代謝產(chǎn)物[29]，分析可知其產(chǎn)量有一定的相關(guān)性。黃酒酵母HJ發(fā)酵液中苯丙氨酸、酪氨酸與對(duì)應(yīng)的β-苯乙醇（r=0.8）、酪醇（r=0.77）之間存在著強(qiáng)相關(guān)性，但是色氨酸與色醇的相關(guān)系數(shù)（r=0.09）并不高，由2.3可知，色醇在發(fā)酵前48 h的增長(zhǎng)是很緩慢的，在發(fā)酵72 h才開(kāi)始快速增長(zhǎng)，從而導(dǎo)致了兩者的相關(guān)性并不高。

由圖5可知，后酵期間黃酒酵母HJ與模式菌BY4743發(fā)酵體系中芳香族氨基酸和芳香醇的含量均呈負(fù)相關(guān)。其中黃酒酵母HJ后酵過(guò)程中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸與β-苯乙醇、酪醇和色醇的相關(guān)系數(shù)分別為-0.42、-0.9和-0.92，這是由于后酵期間酵母大量死亡，體內(nèi)的氨基酸釋放到發(fā)酵液中，使得游離氨基酸的含量大量升高[25]，而芳香醇的合成需要完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致了后酵期間芳香族氨基酸和芳香醇的含量呈一定的負(fù)相關(guān)。

2.5 酸性蛋白酶活的變化

由表3可知，在發(fā)酵第24 h和120 h時(shí)黃酒酵母HJ發(fā)酵醪中的酸性蛋白酶活均顯著高于BY4743（P＜0.05），分別為3.39 U/g和13.33 U/g，是BY4743的2.04倍和3.11倍。由于酸性蛋白酶具有超強(qiáng)的蛋白質(zhì)內(nèi)切和外切酶活力，可使自由氨基氮快速釋放[28]，因此較高的酸性蛋白酶活是黃酒酵母HJ芳香族游離氨基酸釋放率高于BY4743的主要原因之一，可以通過(guò)控制黃酒發(fā)酵過(guò)程中酸性蛋白酶的含量以及酶活的高低來(lái)控制原料中游離氨基酸的釋放，從而控制黃酒中芳香醇的含量。

表3 發(fā)酵醪中酸性蛋白酶酶活變化

3 結(jié)論

芳香醇是影響黃酒及料酒香氣的重要化合物，其濃度對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)影響較大。探究黃酒酵母產(chǎn)芳香醇的差異及影響因素，為黃酒中芳香醇的調(diào)控提供重要的理論基礎(chǔ)。本文通過(guò)對(duì)比分析添加不同釀酒酵母（黃酒酵母HJ和模式菌株BY4743）的黃酒發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)，芳香醇和氨基酸的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在前酵過(guò)程中，芳香族氨基酸的釋放與芳香醇的含量呈正相關(guān)。黃酒發(fā)酵結(jié)束時(shí)，HJ發(fā)酵醪中芳香族游離氨基酸的釋放率達(dá)25.16 %，是BY4743的2.34倍，其中有45.32%的芳香族游離氨基酸被HJ用于自身代謝與芳香醇的合成，較高的氨基酸釋放率和利用率也使得HJ芳香醇含量比BY4743提高1.26倍。在發(fā)酵第120 h時(shí)，HJ的蛋白酶活力是BY4743的3.11倍，結(jié)果表明，較高的蛋白酶活力使得黃酒酵母HJ有更強(qiáng)的芳香族游離氨基酸釋放率和利用率，從而促進(jìn)了芳香醇的合成。這也說(shuō)明在黃酒發(fā)酵過(guò)程中除了選擇優(yōu)質(zhì)的酵母來(lái)控制芳香醇含量外，也可以通過(guò)控制蛋白酶活力的高低來(lái)控制氨基酸的釋放，從而達(dá)到控制芳香醇含量的目的，這對(duì)黃酒中芳香醇的調(diào)控具有重要的指導(dǎo)作用。