圈養(yǎng)白額雁約翰遜不動桿菌分離鑒定與藥敏分析

黃 萃 伍思華 李 鈺 黃海玲 鄔向東

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南昌，330045；2.南昌市動物園，南昌，330029)

不動桿菌屬(Acinetobacter)為非發(fā)酵型、嚴(yán)格需氧的革蘭陰性球桿菌，無芽孢、無鞭毛、無動力，生存能力強，在環(huán)境中普遍存在，并且具有廣泛的耐藥性[1]。不動桿菌在醫(yī)院內(nèi)廣泛流行，是世界范圍內(nèi)引起院內(nèi)感染最重要的條件致病菌之一[2-3]。但是在獸醫(yī)臨床上的報道較少，1995年廣東某養(yǎng)殖場鱖魚(Sinipercachuatsi)因感染鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)而大量死亡，用多種抗生素治療無效，這一發(fā)現(xiàn)使動物源性不動桿菌令人矚目[4]。近年來，該菌在水生動物和畜禽感染上已有較多報道，如魚類感染廈門不動桿菌(Acinetobacterxiamen)爆發(fā)性死亡[5]、龜類感染鮑曼不動桿菌死亡[6]、鴨感染沃氏不動桿菌(Acinetobacterlwoffii)死亡[7]、山羊感染鮑曼不動桿菌死亡[8]等；此外，也有報道大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)感染醋酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)后急性死亡[9]、梅花鹿(Cervusnippon)感染不動桿菌連續(xù)死亡[10]等。

2018年江西省某動物園突發(fā)數(shù)羽白額雁(Anseralbifrons)死亡病例，筆者從患病白額雁的臟器中僅分離到1株細(xì)菌，經(jīng)純化、染色鏡檢、16S rDNA基因PCR擴增與測序分析，從分子水平上確定其為約翰遜不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii)。同時進行了藥敏試驗，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果篩選出相對敏感藥物進行防治，取得了較好的效果，現(xiàn)報告如下。

1 材料

1.1 病料來源

江西省某動物園送檢白額雁的肝臟、肺臟病料。

1.2 主要試劑和儀器

血瓊脂培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基，由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室自制；小牛血清，購自杭州江濱生物技術(shù)有限公司；PCR Mix、100 bp DNA Ladder，購自北京全式金生物科技有限公司；飽和酚、溴化乙錠(EB)、Tris堿、SDS等，購自Solarbio公司；瓊脂糖購自Sigma公司；藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；omega DNA回收試劑盒，購自華大基因公司。

1.3 主要儀器

SW-CJ型凈化工作臺，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQ-LS-75S11型立式壓力蒸氣滅菌器、SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；5415R型冷凍臺式高速離心機，購自Eppendorf公司；K960型PCR儀，購自杭州晶格儀器有限公司。

1.4 細(xì)菌16S rDNA基因擴增通用引物

16S(F)5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，16S(R)5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，由華大基因公司合成。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

取白額雁肝臟、肺臟病料于無菌操作臺內(nèi)，用酒精棉球?qū)ζ浔砻孢M行消毒滅菌，將無菌接種環(huán)插入肝臟及肺臟內(nèi)鉤取3—4次，劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；挑取可疑單個菌落進行涂片及純化，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，將純化細(xì)菌轉(zhuǎn)接菌種管保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)菌16S rDNA鑒定

2.2.1 細(xì)菌DNA模板提取

取蒸餾水100 μL加2接種環(huán)單個菌落于EP管混勻，煮沸10—15 min；12 000 rpm離心7 min，取上清，作為細(xì)菌DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 細(xì)菌16S rDNA的PCR擴增及序列分析

PCR反應(yīng)體系：16S(F)、16S(R)各1 μL、PCR Mix 12.5 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL，總體積25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用DNA回收試劑盒回收PCR反應(yīng)產(chǎn)物，送華大基因公司進行測序。

測序所得基因序列在NCBI上通過BLAST進行同源性檢索，將GenBank中收錄的同源性較高的同屬不同種菌株通過DNAStar進行核苷酸同源性分析，并選取同科不同屬菌株用Mega 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2.3 藥物敏感試驗

采用藥敏紙片擴散法，將分離菌株接種血清肉湯，37 ℃振蕩培養(yǎng)6—8 h，調(diào)整菌液濃度為1.5×108cfu/mL為藥敏試驗用菌液。將菌液均勻涂布于TSA平板，將藥敏紙片貼于涂有菌液的TSA平板上，置37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

細(xì)菌分離物在血瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形、光滑、灰白色、邊緣整齊的小菌落。經(jīng)革蘭氏染色為革蘭氏陰性球桿菌，單個散在排列(圖1)。

圖1 細(xì)菌鏡檢結(jié)果(G’s染色，10×100)Fig.1 Bacterioscopy results(G’s staining，10×100)

3.2 細(xì)菌16S rDNA鑒定結(jié)果

分離株16S rDNA基因PCR擴增結(jié)果見圖2，如預(yù)期獲得大小約為1 500 bp產(chǎn)物。測序結(jié)果分離株基因片段長度為1 367 bp，與NCBI基因庫BLAST中約翰遜不動桿菌16S rDNA基因序列同源性達99.85%；分離株與約翰遜不動桿菌核苷酸相似性最高達99.9%(圖3)，證實該分離株為約翰遜不動桿菌，將其命名為AJ-JX01。

圖2 細(xì)菌16S rDNA基因PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of bacterial 16S rDNA gene 注：1為細(xì)菌16S rDNA擴增結(jié)果；M為100 bp Labber DNA Note：1 is the result of bacterial 16S rDNA amplification，M is 100 bp Labber DNA

圖3 分離株16S rDNA基因序列的同源性分析Fig.3 Homology analysis of the 16S rDNA gene sequence of the isolate

系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果(圖4)，顯示菌株AJ-JX01與約翰遜不動桿菌屬于同一聚類分支，親緣關(guān)系最近，與波氏不動桿菌(Acinetobacterbouvetii)的親緣關(guān)系較近，而與信氏不動桿菌(Acinetobacterschindleri)等親緣關(guān)系較遠，尤其與常見的鮑曼不動桿菌親緣關(guān)系最遠。莫拉氏菌屬(Moraxella)屬于另一分支，但與菌株AJ-JX01的親緣性較高。

3.3 藥敏試驗結(jié)果

分離株AJ-JX01對丁胺卡那、四環(huán)素、阿奇霉素、環(huán)丙沙星和氧氟沙星敏感，對阿莫西林、頭孢哌酮、卡那霉素、妥布霉素、氟苯尼考和復(fù)方新諾明中度敏感，對青霉素、林可霉素和桿菌肽耐藥(表1)。

4 小結(jié)與討論

4.1 不動桿菌是由荷蘭微生物學(xué)家Beijerinck于1911年首次發(fā)現(xiàn)，到目前為止該菌屬已發(fā)現(xiàn)31個基因種，被命名的有17種[11]。本試驗從動物園白額雁的肝臟分離到1株細(xì)菌，經(jīng)培養(yǎng)形態(tài)學(xué)、細(xì)菌16S rDNA基因序列分析證實該菌為約翰遜不動桿菌。

圖4 分離株16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the 16S rDNA gene sequence of the isolate 參考菌株：約翰遜不動桿菌(Acinetobacter johnsonii)，波氏不動桿菌(Acinetobacter bouvetii)，信氏不動桿菌(Acinetobacter schindleri)，溶血不動桿菌(Acinetobacter haemolyticus)，滕氏不動桿菌(Acinetobacter tjernbergiae)，坦氏不動桿菌(Acinetobacter tandoii)，沃氏不動桿菌(Acinetobacter lwoffii)，抗輻射不動桿菌(Acinetobacter radioresistens)，瓊氏不動桿菌(Acinetobacter junii)，鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)，奧斯陸莫拉氏菌(Moraxella osloensis)，林氏莫拉氏菌(Moraxella lincolnii)，延髓莫拉氏菌(Moraxella oblonga)，腔隙莫拉氏菌(Moraxella lacunata)，牛摩拉菌(Moraxella bovis)

表1 分離菌株AJ-JX01藥物敏感試驗結(jié)果

4.2 16S rDNA基因為細(xì)菌的高度保守基因，具有細(xì)菌種、屬特異性。目前，16S rDNA序列分析技術(shù)已成為鑒定細(xì)菌種屬及分類的標(biāo)準(zhǔn)方法[12]。本試驗運用DNAstar軟件對分離株AJ-JX01與參考菌株16S rDNA序列進行核苷酸同源性比對分析，結(jié)果顯示，分離株AJ-JX01與約翰遜不動桿菌核苷酸相似性高達99.6%以上，最高達99.9%，說明分離株AJ-JX01為A.johnsonii。分離株與不動桿菌屬其他菌株的同源性達96.3%—99.0%，結(jié)果表明約翰遜不動桿菌16S rDNA序列呈現(xiàn)較高的保守性和穩(wěn)定性，差異較??；而分離株AJ-JX01與波氏不動桿菌的核苷酸同源性高達99.0%，說明其與A.bouvetii的差異性不大。系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果顯示分離株AJ-JX01與A.johnsonii屬于同一聚類分支，親緣關(guān)系最近，而與信氏不動桿菌、溶血性不動桿菌(A.haemolyticus)、滕氏不動桿菌(A.tjernbergiae)、坦氏不動桿菌(A.tandoii)、沃氏不動桿菌、抗輻射不動桿菌(A.radioresistens)、瓊氏不動桿菌(A.junii)親緣關(guān)系較遠，尤其與常見的鮑曼不動桿菌親緣關(guān)系最遠，說明該菌的16S rDNA基因高度保守，具有種屬特異性。

雖然該菌為機會致病菌，在自然界廣泛存在，但近年來由其引起的各種動物的感染不斷出現(xiàn)[5-10]。本次試驗從死亡白額雁內(nèi)臟中僅分離到約翰遜不動桿菌，并進行了藥敏試驗。結(jié)果該分離株對丁胺卡那、四環(huán)素、阿奇霉素、環(huán)丙沙星和氧氟沙星等大部分的抗生素均較敏感，僅對青霉素、林可霉素和桿菌肽耐藥，臨床用藥仍取得較好效果，說明該分離株耐藥性并不強，但出現(xiàn)在死亡白額雁內(nèi)臟仍值得關(guān)注。