福建梅花山圈養(yǎng)華南虎幼虎與成年虎腸道菌群結(jié)構(gòu)的比較研究

孫艷發(fā) 張 敏 陳騰騰 傅文源* 許衛(wèi)華 吳 瓊李 焰 朱雨婷 張雪梅 劉靈宇 陳東虹 林開雄* 林煒明*

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，龍巖，364012；2.福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室，龍巖，364012；3.預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高校重點實驗室，龍巖，364012；4.福建梅花山華南虎繁育研究所，上杭，364201)

動物腸道菌群含有數(shù)以萬億計的微生物細(xì)胞，形成復(fù)雜動態(tài)變化的微生物群落[1]。建立一個復(fù)雜穩(wěn)定的菌群對宿主的生長發(fā)育至關(guān)重要[2-3]。動物出生后，微生物便在胃腸道內(nèi)開始定植，幫助宿主營養(yǎng)消化，刺激免疫和腸道發(fā)育成熟，競爭性地排斥病原體[4]。在人工條件飼養(yǎng)的東北虎(Pantheratigrisaltaica)中，在門水平上，腸道中變形桿菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinomycota)和梭菌門(Clostridium)4種為主要腸道菌群；在屬水平上，大腸桿菌屬(Escherichia)、柯林斯菌屬(Collinobacteria)和梭菌屬(Fusobacterium)最為豐富；在種水平上，圈養(yǎng)的東北虎腸道菌群中，大腸桿菌(Escherichiacoli)、潰瘍梭菌(Clostridiumulcerans)和變種梭菌(Clostridiummutans)的豐度最高[5]。宿主食物的選擇也影響動物腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成，兩者互惠共生[6]。羊奶喂養(yǎng)的東北虎幼仔比母乳喂養(yǎng)的東北虎幼仔腸道內(nèi)有益菌較少，致病菌較多，微生物多樣性也較高[7]。驅(qū)蟲藥芬苯達唑片和伊維菌素片能夠破壞東北虎的腸道菌群，改變了其代謝的穩(wěn)態(tài)[8]。此外，飼養(yǎng)人員腸道微生物的組成，生活的地理位置，食物種類等也影響虎腸道微生物群落的組成[9]。

華南虎(Pantheratigrisamoyensis)也稱中國虎、廈門虎，我國獨有的虎亞種。華南虎曾是世界分布最為廣泛的虎亞種，現(xiàn)在卻已基本認(rèn)定野外絕跡[10]。為找到華南虎野外存活的證據(jù)，并對其種群進行系統(tǒng)恢復(fù)，2000年9月出臺了“拯救華南虎行動計劃”，系統(tǒng)開展華南虎的人工繁育、野外種群調(diào)查、棲息地恢復(fù)、人工種群重引入等工程[10]。在人工繁育方面，人工圈養(yǎng)華南虎已達100余只，分散在全國十幾家動物園等養(yǎng)殖單位[11]。在人工圈養(yǎng)條件下，由于個別母虎母性不好或初胎華南虎哺育幼仔經(jīng)驗的缺乏，常因棄仔導(dǎo)致華南虎幼虎存活率偏低[12]。通過人工育幼技術(shù)的發(fā)展和幼虎人工乳的開發(fā)顯著提高了華南虎幼虎存活率，為擴大華南虎種群數(shù)量提供了技術(shù)保障[12-14]。動物腸道菌群組成與宿主的健康密切相關(guān)，華南虎幼虎常因腸道內(nèi)菌群失衡，特別是一些致病菌的侵害造成其死亡[15]。因此，本研究通過對華南虎幼虎與成年虎腸道菌群多樣性與差異的研究，探索健康華南虎幼虎與成年虎腸道優(yōu)勢菌群與顯著差異菌群，為華南虎食物選擇特別是幼虎人工乳的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本試驗所用華南虎糞便樣品由福建梅花山華南虎繁育研究所工作人員采集。其中2018年8月采集3只2月齡左右華南虎幼虎糞便新鮮樣品各1份，樣本編號為M99.3，M101.3和M102.3；2019年3月采集5只10歲左右的華南虎成年虎糞便新鮮樣品各1份，樣本編號為M83，M29，M36，M55和M61。共計8份樣本于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 腸道細(xì)菌DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyl trimethylammonium bromide，CTAB)法提取華南虎腸道樣品基因組DNA(gDNA)。由賽默飛世爾科技公司的NanoDropTMOne測定華南虎腸道菌群gDNA濃度和質(zhì)量，使用滅菌蒸餾水稀釋濃度至1 ng/μL。

1.3 腸道細(xì)菌16S rRNA基因的擴增、文庫制備與測序

利用引物528F(GCGGTAATTCCAGCTCCAA)和706R(AATCCRAGAATTTCACCTCT)擴增16S rRNA基因V4區(qū)域。30 μL PCR反應(yīng)體系包括上下游引物各0.2 μm、10 ng模板DNA和15 μL新英格蘭生物學(xué)實驗室的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃條件下1 min預(yù)變性，30個循環(huán)包括98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物與1×相同體積含有SYBR的加樣緩沖液混合后進行2%瓊脂糖凝膠電泳。采用賽默飛世爾科技公司Gene JETTM膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化。

采用賽默飛世爾科技公司的Ion Plus Fragment Library Kit制備測序文庫。由賽默飛世爾科技公司的Qubit?2.0熒光計評估文庫質(zhì)量。文庫質(zhì)量合格后由Ion S5TMXL測序平臺進行400 bp單末端測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)的處理與分析

去除原始數(shù)據(jù)的接頭、引物和嵌合體序列得到有效序列。將具有高度相似性(97%)的有效序列聚類成為OTU(operational taxonomic units)?；贠UT結(jié)果，利用QIIME V1.7.0軟件進行華南虎腸道微生物Alpha多樣性分析。本研究中分析7個Alpha 多樣性指數(shù)，包括ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、goods coverage指數(shù)、observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和PD whole tree指數(shù)。這些指數(shù)的高低可反映華南虎腸道樣品群落內(nèi)的復(fù)雜度大小。同時進行華南虎幼虎和老年虎腸道微生物Alpha多樣性指數(shù)顯著性檢驗，找到物種多樣性顯著增高或降低的分組。

Beta多樣性分析可以評價華南虎幼虎和成年虎腸道樣品間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異。使用Jaccard樣本間物種距離計算方法計算樣本間距離，獲得距離矩陣，進行Wilcox秩和檢驗。使用QIIME V 1.7.0軟件計算華南虎幼虎和老年虎腸道樣品微生物間Unifrac值，得到微生物的群落結(jié)構(gòu)差異程度。使用RV 2.15.3軟件進行主成分分析(principal component analysis，PCA)分析展示華南虎幼虎和老年虎腸道樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)二維的差異。為了尋找各分類水平下組間的差異物種，進行華南虎幼虎和成年虎腸道微生物豐度組間t-test檢驗，鑒定差異顯著(P<0.05)的物種。使用QIIME V1.7.0軟件進行華南虎幼虎和老年虎腸道樣品微生物非加權(quán)組平均聚類分析(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA，)分析以及Beta多樣性指數(shù)組間差異分析，鑒定華南虎幼虎和老年虎腸道樣品間微生物的差異。使用LEfSe(LDA effect size)分析華南虎幼虎與成年虎腸道菌群間差異顯著的物種。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中的OTU數(shù)目與物種豐度

本研究共計對8只華南虎腸道樣本進行16S rRNA測序，基于相似度大于97%的原則，去除noblasthit和unknown結(jié)果共獲得501個OTUs，分布于17個門(phylum)、28個綱(class)、58個目(order)、104個科(family)、176個屬(genus)和109個種(species)。所有糞便樣品共有72個的OTUs(圖1)。

圖1 OTUs韋恩圖Fig.1 Venn diagram of OTUs

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取各組門和屬水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖，查看各組樣品在不同分類水平上相對豐度較高的物種及其比例。由圖2可知，在門水平上，華南虎幼虎和成年虎腸道微生物主要由厚壁菌門(75.31%和75.11%)、糞便變形菌門(Proteobacteria，16.92%和16.43%)、放線菌門(Actinobacteria，2.90%和3.48%)以及梭桿菌門(Fusobacteria，0.27%和8.57%)等組成，其中華南虎幼虎腸道變形菌門細(xì)菌豐度高于成年虎，梭桿菌門細(xì)菌含量低于成年虎。在屬水平上，華南虎幼虎與成年虎腸道細(xì)菌豐度差異較大，幼虎腸道細(xì)菌主要由巨單胞菌屬(Megamonas，45.42%)、鏈球菌屬(Streptococcus，15.32%)、腸桿菌科某屬(Enterobacteriaceae，7.18%)、乳酸菌屬(Lactobacillus，7.05%)以及毛螺菌科某屬(Lachnospiraceae，5.12%)等細(xì)菌組成。成年虎腸道細(xì)菌主要由梭菌屬(33.13%)、布勞特氏菌屬(Blautia，8.73%)、艱難梭菌屬(Peptoclostridium，8.73%)、梭桿菌屬(Fusobacterium，8.56%)、Paeniclostridium屬(3.95%)以及腸桿菌屬(1.02%)等組成。

圖2 華南虎幼虎(m)和成年虎(y)糞便微生物在門(A)和屬(B)水平上物種相對豐度柱形圖Fig.2 A histogram of species differences at the phylum(A)and genus(B)levels of fecal bacteria between cub(m)and adult(y)tigers

表1 華南虎幼虎和成年虎腸道微生物多樣性指數(shù)

2.2 Alpha多樣性分析

通過Alpha 多樣性分析進行華南虎幼虎和成年虎腸道微生物的豐富度和多樣性進行比較。華南虎幼虎和成年虎腸道微生物Alpha多樣性指數(shù)見表1。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用于衡量樣本的多樣性，其中Shannon指數(shù)為2.857—4.734，Simpson指數(shù)為0.704—0.936。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反應(yīng)樣本物種的豐度，M101.3樣本的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)較小，分別為168.345，181.498。PD whole tree指數(shù)反應(yīng)了樣品中物種對進化歷史保存的差異，各樣本差異較小。所有樣品的覆蓋度(goods coverage)大于99.99%，說明本研究中文庫的大小足以代表大多數(shù)細(xì)菌。指數(shù)組間差異檢驗(t-test)表明，華南虎幼虎和成年虎腸道微生物Alpha多樣性差異不顯著(P=0.717 6，圖3)。

圖3 華南虎幼虎和成年虎腸道微生物Alpha多樣性Fig.3 The Alpha diversity of fecal microbiota between cub and adult tigers

2.3 Beta多樣性分析

2.3.1 Beta指數(shù)組間差異分析

Beta多樣性通過微生物群落構(gòu)成的比較，評估微生物群落間的差異。Wilcox秩和檢驗分析結(jié)果表明，華南虎幼虎糞便樣品物種Beta多樣性顯著高于成年虎(P=0.048 9，圖4)。

圖4 華南虎幼虎(m)和成年虎(y)腸道微生物Beta多樣性Fig.4 The Beta diversity of fecal microbiota between cub(m)and adult tigers(y)

2.3.2 主成分分析

主成分分析(principal component analysis，PCA)能夠?qū)⒍嗑S數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上。如果樣品的群落組成越相似，則它們在PCA圖中的距離越接近。由圖5可知，華南虎幼虎和成年虎腸道微生物能夠明顯分為兩組，說明年齡相近的華南虎腸道微生物的組成相似。其中PC1和PC2分別解釋了31.2%和23.38%糞便微生物的組成。

2.3.3 組間t-test檢驗

華南虎幼虎和成年虎腸道微生物豐度組間t-test檢驗結(jié)果見圖6。由圖6可知，在綱、目、科和屬水平上，成年虎腸道梭菌綱(Clostridia)、梭菌目(Clostridiales)、梭菌科(Clostridiales)和梭菌屬(Clostridiales)微生物豐度均顯著高于幼年華南虎(P=0.001，0.001，0.03和0.03)。此外，成年虎腸道消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、Lachnoclostridium屬細(xì)菌豐度也顯著高于幼年華南虎(P=0.008，0.035)。

圖5 華南虎幼虎(m)和成年虎(y)腸道微生物主成分分析Fig.5 The principal component analysis of fecal microbiota between cub(m)and adult tigers(y)

2.3.4 基于LefSe(LDA effect size)分析華南虎幼虎與成年虎腸道菌群間的物種差異

LEfSe分析華南虎幼虎與成年虎腸道菌群間差異顯著的物種結(jié)果見圖7。其中LDA值分布柱狀圖(圖7A)顯示華南虎幼虎與成年虎糞便微生物之間具有顯著差異的微生物類群(LDA score >4)。在幼虎糞便微生物具有顯著豐度差異的物種有：Gaiellales目、魯氏不動桿菌(Acinetobacterlwoffii)、Solirubrobacterales目、嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)、約翰不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)、雙歧桿菌目(Bifidobacteriales)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)。在成年虎糞便微生物具有顯著豐度差異的物種有：梭狀芽胞桿菌綱、梭菌目、梭菌科、梭菌屬、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)、Blautia屬、梭桿菌目(Fusobacteriales)、梭桿菌綱(Fusobacteriia)、梭桿菌科(Fusobacteriaceae)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、梭桿菌門(Fusobacteria)、死亡梭桿菌(Fusobacteriummortiferum)、Paeniclostridium屬、漫游球菌屬(Vagococcus)和托伊貝爾漫游球菌(Vagococcusteuberi)。進化分支圖(6B)由內(nèi)至外輻射的圓圈，顯示了華南虎幼虎與成年虎在門至種屬水平的分類群相對豐度差異。每個不同分類的小圓圈表示一個分類單元，而每個圓圈的直徑的大小反映了相對豐度的高低。由圖7可知，LDA 值分布柱狀圖與進化分支圖的結(jié)果相近。

圖6 華南虎幼虎(m)和成年虎(y)腸道微生物豐度在綱(A)、目(B)、科(C)和屬(D)水平上組間t檢驗Fig.6 The t-test of fecal microbiota abundance at class(A)，order(B)，family(C)and genus(D)levels between cub(m)and adult tigers(y)

圖7 華南虎幼虎(m)和成年虎(y)腸道微生物L(fēng)DA值分布柱狀圖(A)和進化分支圖(B)Fig.7 Distribution histogram based on LDA value(A)and evolutionary branch graph(B)of fecal microbiota between cub(m)and adult tigers(y)

3 討論

動物出生后，腸道菌群隨著哺乳、采食等逐漸在胃腸道內(nèi)定植，經(jīng)過生長繁殖逐漸形成優(yōu)勢菌群[16]。這些在腸道內(nèi)定植的菌群與宿主相互作用，對宿主的營養(yǎng)物質(zhì)代謝和免疫系統(tǒng)的發(fā)展至關(guān)重要[4]。本研究通過對華南虎幼虎和成年虎腸道菌群進行16S rRNA V4基因進行測序，探索華南虎幼虎和成年虎腸道菌群組成和差異。本研究發(fā)現(xiàn)，華南虎幼虎和成年虎腸道菌群主要來自4個門，包括厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和梭桿菌門，這與東北虎腸道中優(yōu)勢菌群一致[6，17]。華南虎幼虎腸道中變形菌門的細(xì)菌豐度高于成年虎，這個門下的細(xì)菌主要包括大腸桿菌、嗜根寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)、糞嗜冷桿菌(Psychrobacterfaecalis)等多中致病菌。華南虎幼虎腸道致較高的病菌豐度，可能是其高死亡率的原因之一。華南虎幼虎腸道中的梭菌在綱、目、科、屬水平上的豐度均顯著低于華南虎成年虎。梭菌屬于厚壁菌門是腸道內(nèi)一大類正常的、能產(chǎn)生芽孢的兼性厭氧細(xì)菌，包含有益的梭菌和有害的梭菌兩類[18]。由于梭桿菌門細(xì)菌多為消化道細(xì)菌，華南虎幼虎消化系統(tǒng)發(fā)育未完善，這可能是定植于消化道內(nèi)的梭桿菌門細(xì)菌豐度較低的原因。

主成分分析表明根據(jù)腸道菌群的組成可明顯區(qū)分華南虎幼虎與成年虎。幼虎腸道細(xì)菌差異顯著的物種，如乳酸桿菌科、屬與雙歧桿菌科、目、屬細(xì)菌。華南虎幼虎腸道中乳酸菌、雙歧桿菌這些有益菌的含量較高，可以維持腸道酸性環(huán)境，競爭性地排除病原體，有利于幼齡虎對乳汁、人工乳和肉糜的消化吸收[19]。成年虎腸道細(xì)菌差異顯著的物種主要是梭菌綱、目、科屬的細(xì)菌，這一結(jié)果與華南虎幼虎與成年虎腸道菌群差異分析結(jié)果基本一致。

華南虎數(shù)量稀少，通過增加母乳喂養(yǎng)的頻率或者提供高品質(zhì)的人工乳，可改善幼虎的腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高幼虎的成活率。本研究通過16S rRNA測序評估華南虎幼虎與成年虎腸道菌群的組成和差異。華南虎幼虎和成年虎腸道菌群主要來自厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和梭桿菌門4個門。華南虎幼虎腸道菌群的Beta多樣性顯著高于成年虎，群落組成更加復(fù)雜。華南虎幼虎與成年虎腸道菌群存在差異顯著的物種。這些發(fā)現(xiàn)揭示了華南虎幼虎與成年虎腸道菌群的組成和差異，為人工飼養(yǎng)條件下華南虎的飼喂以及幼虎人工乳的研制提供了理論基礎(chǔ)。