一種香菇菌種保藏方法初探

姜 寧 李 玉 周 峰 李正鵬 章?tīng)t軍 于海龍 李巧珍 董浩然

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所/農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心/國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心/農(nóng)業(yè)部應(yīng)用真菌資源與利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海奉賢201403）

香菇（Lentinula edodes）又名冬菇，是一種重要的食用真菌，不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，還具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒和提高免疫力等藥用功效[1]。近年來(lái)，隨著香菇行業(yè)的迅速發(fā)展，生產(chǎn)中的一些問(wèn)題也逐漸突顯。香菇菌種作為生產(chǎn)的源頭，其質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到香菇培養(yǎng)的各個(gè)環(huán)節(jié)以及出菇子實(shí)體的產(chǎn)量和質(zhì)量。一個(gè)優(yōu)良的菌株被選育出來(lái)以后，必須保持其優(yōu)良性狀不變或盡可能地少變慢變，才不至于降低生產(chǎn)性能，才能長(zhǎng)期在生產(chǎn)中使用[2]。因此，尋找適用于香菇的菌種保藏方法，其重要性不言而喻。

目前香菇菌種常用的保藏方法主要有試管斜面?zhèn)鞔２?、液氮保藏、石蠟油封藏、冷凍干燥保藏等[3-9]。這些方法或者因?yàn)檎紦?jù)的保藏空間太大，增加了保藏成本；或者因?yàn)檗D(zhuǎn)管傳代次數(shù)過(guò)多，導(dǎo)致菌種的退化；或者因?yàn)樗柙O(shè)備價(jià)格昂貴，操作技術(shù)復(fù)雜，不適用于生產(chǎn)企業(yè)。因此，探究一種操作簡(jiǎn)便、高效廉價(jià)、不占據(jù)過(guò)大的保藏空間的香菇菌種保藏方法至關(guān)重要。

為此，筆者探索一種以小米粒為培養(yǎng)基質(zhì)，保藏容器為2 mL 離心管的香菇菌種保藏方法。該方法可以有效降低保藏菌種的成本，并且操作簡(jiǎn)單，占用保藏空間小，保藏效果良好，便于科研單位及企業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

香菇雙核體菌株滬香F2，香菇原生質(zhì)體單核體菌株220 均保藏于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所；小米粒購(gòu)自超市，試管、三角瓶均購(gòu)自江蘇省海門市三和華興實(shí)驗(yàn)玻璃儀器廠。

1.2 小米粒培養(yǎng)基質(zhì)制備

取新鮮小米粒洗凈，蒸餾水浸泡20～30 min，至小米粒微軟，散開(kāi)到干凈的紗布上，用紗布吸干表面多余水分，分裝到250 mL 三角瓶中，每瓶30 g，121 ℃高壓滅菌30 min，pH自然[10]。

1.3 保藏菌株培養(yǎng)

將供試菌株從保藏庫(kù)中取出，轉(zhuǎn)接至含PDA 的培養(yǎng)皿中，25 ℃避光培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，用勻漿杯打碎，勻漿杯預(yù)加入50 mL PDB（PDA 不加瓊脂）培養(yǎng)基，隨后加入小米粒培養(yǎng)基質(zhì)中，繼續(xù)25 ℃避光培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中每天將瓶?jī)?nèi)小米粒搖勻，使菌絲均勻分在小米?；|(zhì)上，培養(yǎng)至小米粒微白（圖1）。

圖1 待保藏菌株用小米?；|(zhì)培養(yǎng)

1.4 試驗(yàn)方法及處理

將小米粒分裝到2 mL 離心管中（圖2），每支離心管加入40～50 粒小米粒。共設(shè)置7 組處理，處理①：25 ℃保藏；處理②：4 ℃保藏；處理③：離心管中加入1 mL PDB 培養(yǎng)基，4 ℃保藏；處理④：離心管中加入 1 mL 甘油，4 ℃保藏；處理⑤：-20 ℃保藏；處理⑥：-80 ℃保藏；處理⑦：離心管中加入1 mL 甘油，-80 ℃保藏。

圖2 小米粒分裝到2 mL離心管中

圖3 不同保藏方法處理后的小米粒轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上

圖4 不同保藏方法處理后的菌種萌發(fā)情況

1.5 觀察記錄及數(shù)據(jù)分析

保藏6個(gè)月、12個(gè)月后，將不同方法保藏處理的小米粒菌種用鑷子單個(gè)挑出，用無(wú)菌濾紙吸干甘油和PDB 培養(yǎng)基，分別接種于PDA 平皿培養(yǎng)基上，25 ℃避光培養(yǎng)（圖3）。觀察記錄菌絲的生長(zhǎng)狀況，萌發(fā)時(shí)間和萌發(fā)率以及生長(zhǎng)速度。菌絲生長(zhǎng)速度采用菌落直徑測(cè)定法測(cè)定[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法保藏處理對(duì)菌種萌發(fā)的影響

不同方法保藏處理6 個(gè)月和12 個(gè)月后，經(jīng)解凍活化香菇單、雙核體菌種萌發(fā)情況如圖4 和表1 所示。不同方法處理后的保藏效果不同，4 ℃保藏以及離心管中加入1 mL PDB 培養(yǎng)基后4 ℃保藏，菌種萌發(fā)時(shí)間短，萌發(fā)率高，保藏效果好，在保藏6 個(gè)月后，萌發(fā)率達(dá)100%。25 ℃保藏，-20 ℃保藏以及離心管中加入1 mL 甘油后4 ℃保藏，萌發(fā)率低，保藏效果差，并且在保藏12個(gè)月后，菌種已經(jīng)無(wú)法萌發(fā)。同種方法處理保藏的香菇單、雙核體菌種，雙核體的萌發(fā)率高于單核體。

2.2 不同方法保藏處理對(duì)菌種菌絲生長(zhǎng)的影響

由表2 可知，不同方法保藏處理菌種6 個(gè)月、12個(gè)月后，其轉(zhuǎn)接后菌絲生長(zhǎng)存在差異。4 ℃保藏的菌絲濃白，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，生長(zhǎng)速度最快，其次是加入1 mL PDB 培養(yǎng)基后4 ℃保藏；離心管中加入1 mL 甘油后4 ℃保藏的菌絲生長(zhǎng)緩慢，菌絲稀疏活力差，保藏效果差。

表1 不同方法保藏處理后菌種的萌發(fā)情況

表2 不同方法保藏處理后菌種轉(zhuǎn)接培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)速度

3 小結(jié)與討論

香菇菌種在自然條件下，由于環(huán)境等因素會(huì)誘發(fā)基因發(fā)生突變，這種突變積累到一定程度后會(huì)導(dǎo)致木質(zhì)素、纖維素等酶合成和表達(dá)受到影響，酶活力下降，菌絲對(duì)木質(zhì)素和纖維素的利用降低，最終導(dǎo)致菌絲長(zhǎng)勢(shì)差，生長(zhǎng)速度減慢，影響子實(shí)體的發(fā)育。因此生長(zhǎng)速度是評(píng)價(jià)菌種保藏好壞的一個(gè)重要指標(biāo)。

綜合菌種的萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)率和生長(zhǎng)速度，4 ℃保藏效果最好，保藏12 個(gè)月后，雙核體菌株的萌發(fā)率達(dá)到95%，單核體菌株的萌發(fā)率為85%；加入1 mL PDB 培養(yǎng)基后4 ℃保藏效果次之；-20 ℃保藏6個(gè)月后，萌發(fā)率僅為30%，12 個(gè)月后，菌株不能萌發(fā)，保藏效果最差。此方法操作簡(jiǎn)單，不需要特種設(shè)備，也不需要定期轉(zhuǎn)管，耗費(fèi)大量的人力和時(shí)間，并且保藏菌種所需的空間小，極大地降低了保藏成本，可以作為一種長(zhǎng)期保藏香菇菌種的方法，適用于科研單位及企業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。

在不同處理的保藏方法設(shè)計(jì)中，作者沒(méi)有采用低溫液氮處理，因?yàn)?，在?shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用中，液氮罐投入成本較高，采用的程序降溫法操作繁瑣，并且對(duì)于日常生產(chǎn)的菌種，不需要保存的時(shí)間太久。該保藏方法也可拓展到其他的食用菌中，為食用菌的菌種保藏提供一個(gè)新思路。