富馬酸二甲酯腸溶膠囊微生物限度方法學的研究

北京市藥品檢驗所 國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室 中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室（102206）張光華 李玉立 牛振東 劉文杰 江志杰

富馬酸二甲酯腸溶膠囊由Biogen Idec公司開發(fā)，用于復發(fā)型多發(fā)性硬化癥患者的治療，F(xiàn)DA于2013年3月27日批準其上市，商品名 Tecfidera[1]。富馬酸二甲酯（DMF）具有高效的抗菌的特性，能有效抑制多種霉菌、酵母菌、細菌的生長[2][3]。DMF進入微生物體內(nèi)，抑制微生物細胞的分裂，并通過對三羧酸循環(huán)（TCAC）磷酸已糖途徑（HMP）和酵解途徑（EMP）的酶活性的抑制來抑制微生物呼吸作用，從而使微生物的生長繁殖被有效控制。微生物限度檢查是中國藥典 2015 年版膠囊劑項下的檢查項，是藥品安全性指標之一。中國藥典 2015 年版四部通則1107[4]非無菌藥品微生物限度標準規(guī)定：膠囊劑需氧菌總數(shù)不得過103cfu/g、霉菌和酵母菌總數(shù)不得過102cfu/g，1g中不得檢出大腸埃希菌。本試驗按照中國藥典 2015 年版四部通則1105、1106[4]的要求，綜合考慮消除抑菌性及簡便易操作等因素，消除了DMF的抑菌性，建立了科學的微生物限度檢查方法，極大地保證了藥品的安全性，也為其他有抑菌性的藥品建立微生物限度檢查方法起到較好的參考作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒）；電熱脈動真空滅菌器（山東新華XG1.DMXD-0.36）；生物安全柜（熱電1300SERIESA2）； PL2002電子天平（梅特勒）；Max Q 6000恒溫搖床（Thermo），電動吸引器（斯曼峰YX930D；微孔濾膜0.45 μm（Satorius）。

1.2 藥品 富馬酸二甲酯腸溶膠囊，規(guī)格：240mg，批號：GCYEDLSA00，GEREDLS900，GEREDLSC00；由Vifor Pharma,Vifor SA生產(chǎn)。

1.3 試驗菌種 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis［CMCC（B）63501］、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa ［CMCC（B）10104］、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌Escherichia coli［CMCC（B）44102］、白色念珠菌Candida albicans［CMCC（F）98001］、黑曲霉Aspergillus niger［CMCC（F）98003］。購自中國食品藥品檢定研究院，菌株傳代數(shù)為第Ⅲ代。

1.4 培養(yǎng)基和試劑 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，由美國BD公司提供。

pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，由北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司提供。

聚山梨酯80由國藥集團化學試劑有限公司提供。卵磷脂由 Sigma 公司提供。無菌十四烷酸異丙酯由北京牛?；蚬咎峁?。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 按中國藥典2015版四部通則1105[4]微生物計數(shù)法進行。

2.2 培養(yǎng)基的適用性檢查 所有培養(yǎng)基均在驗證合格的滅菌程序下滅菌，并按中國藥典 2015 版四部通則1105[4]微生物計數(shù)法進行培養(yǎng)基的適用性檢查，結(jié)果均符合要求。

2.3 供試液制備 萃取法：取本品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至500mL，振搖使供試品分散均勻，再加入十四烷酸異丙酯50mL，振搖，靜置待油水分層，取水層作為1∶50的供試液。

2.4 微生物計數(shù)方法適用性試驗(薄膜過濾法)。

2.4.1 菌液對照組 取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9mL，加入制備好的試驗菌液0.1mL（細菌、酵母菌500cfu～1000cfu，霉菌300cfu～600cfu），混勻，使每1mL稀釋液中含菌量為30cfu～100cfu。分別取上述菌懸液1mL注入平皿中，測定其每毫升的活菌數(shù)，結(jié)果見附表1。

2.4.2 試驗組 取1∶50的供試液5mL 5份，分別加至含3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，采用薄膜過濾法，用含3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液分3次沖洗（每次100mL），在最后一次沖洗液中平行加入菌液對照組（2.4.1）制備好的枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液1mL（30cfu～100cfu），取濾膜，測定需氧菌總數(shù)，結(jié)果見附表1。

另1∶50的供試液5mL 2份，分別加至含3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，采用薄膜過濾法，用含3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液分3次沖洗（每次100mL），在最后一次沖洗液中平行加入菌液對照組（2.4.1）制備好的白色念珠菌、黑曲霉菌液1mL（30cfu～100cfu），取濾膜，測定供試品的霉菌和酵母菌總數(shù)，結(jié)果見附表1。

2.4.3 供試品組 取1∶50的供試液5mL，加至含3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，采用薄膜過濾法，用含3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液分3次沖洗（每次100mL），取濾膜，測定供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，結(jié)果見附表1。

2.4.4 稀釋劑對照組 取菌液對照組（2.4.1）制備好的試驗菌液1mL（細菌、酵母菌5000cfu～10000cfu，霉菌3000cfu～6000cfu），加至pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL中，搖勻，再加入十四烷酸異丙酯10mL，振搖，靜置待油水分層，取水層作為稀釋劑對照液，取稀釋劑對照液1mL，置含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90mL中，采用薄膜過濾法，以含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液分3次沖洗（每次100mL），取濾膜，測定需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，測定結(jié)果附表1。

需氧菌總數(shù)測定，取濾膜貼于含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，置33℃培養(yǎng)5天，逐日觀察結(jié)果。霉菌和酵母菌總數(shù)測定，取濾膜貼于含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，置23℃培養(yǎng)7天，逐日觀察結(jié)果。

由附表1數(shù)據(jù)可見，稀釋劑對照組回收比值均在0.5～2.0范圍內(nèi)，表明用十四烷酸異丙酯萃取和用含3% Tween 80和0.3%卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗及培養(yǎng)基中添加3% Tween 80和0.3%卵磷脂對微生物回收無影響[6][7][8]。

富馬酸二甲酯腸溶膠囊的枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收比值均在0.5～2.0范圍內(nèi)，表明采用稀釋法、萃取法、中和法及薄膜過濾法聯(lián)用在本試驗中是有效性的，該法進行富馬酸二甲酯腸溶膠囊的需氧菌總數(shù)計數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)總數(shù)計數(shù)方法準確、可行。

2.5 控制菌檢查方法適用性試驗

2.5.1 供試品組 取1∶50的供試液10mL，加至含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90mL中，采用薄膜過濾法，以含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液分3次沖洗（每次100mL），取濾膜，置含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100mL中，制備5份，33℃培養(yǎng)24小時。

2.5.2 陰性對照組 取稀釋液10mL，置含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100mL中，33℃培養(yǎng)24小時。

2.5.3 陽性對照組 取1∶50的供試液10mL，加至含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90mL中，采用薄膜過濾法，以含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液分3次沖洗（每次100mL），在最后一次沖洗液中加入不大于100cfu的大腸埃希菌，置含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100mL中， 33℃培養(yǎng)24小時。分別取上述預培養(yǎng)物1mL ，加至麥康凱液體培養(yǎng)基100mL中，42℃培養(yǎng)24小時后，再分別劃線于麥康凱瓊脂平板上，33℃培養(yǎng)24小時，觀察結(jié)果，具體情況見附表2。

從附表2結(jié)果可以看出，陽性對照菌生長良好，表明富馬酸二甲酯腸溶膠囊在該條件下對大腸埃希菌無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計。說明采用該法進行富馬酸二甲酯腸溶膠囊的大腸埃希菌檢查可行。

3 討論

3.1 無菌十四烷酸異丙酯的應用 富馬酸二甲酯（DMF）為白色結(jié)晶或結(jié)晶粉末，溶于乙酸乙酯、氯仿、丙酮和醇類，微溶于乙醚，不溶于水?；谶@一特性，本試驗選取無菌十四烷酸異丙酯作為萃取液[5][6]，使供試液中的DMF含量達到最低。

3.2 中和劑Tween80和 卵磷脂的應用Tween 80和卵磷脂是中國藥典、歐洲藥典收載的常用中和劑，可添加至稀釋劑、沖洗液、或培養(yǎng)基中。Tween 80為非離子表面活性劑，卵磷脂為兩性離子表面活性劑，可降低季按類化合物、酚、醛、對羥基苯甲酸類、碘酒、洗必太類、石炭酸類的藥物的活性[4]。

附表1 微生物計數(shù)方法適用性試驗回收結(jié)果

附表2 控制菌檢查方法適用性試驗結(jié)果

卵磷脂是細胞膜上最主要的脂質(zhì)，其所擁有的脂肪酸種類會影響細胞的流動性及通透性；卵磷脂也通過影響細胞膜上許多酵素的功能來調(diào)控細胞生長；卵磷脂能改變細胞膜功能；是細胞膜修復的營養(yǎng)劑[7][8]。實驗證明沖洗液和培養(yǎng)基中添加3% Tween 80、0.3% 卵磷脂起到了降低抑菌作用的效果。

3.3 試驗中遇到的問題 微生物計數(shù)適用性試驗初期采用了單一的平皿法、培養(yǎng)基稀釋法進行，各驗證菌株回收率均為0，改用普通薄膜過濾法，并用不同的沖洗量進行試驗，各驗證菌株回收率仍小于0.5，查閱DMF的特性后增加了萃取步驟。為了使萃取效果達到最佳，將供試液制備為1∶50的供試液。沖洗液和培養(yǎng)基中添加3% Tween 80、0.3%卵磷脂起到了增加DMF的溶解性及中和作用兩種效果。

控制菌檢查要求1g中不得檢出大腸埃希菌，驗證試驗中曾嘗試過濾1∶50的供試液50mL，并用不同的沖洗量進行試驗，沖洗量達到1000mL時，陽性對照菌大腸埃希菌仍然不能生長，說明濾膜上殘留的DMF對大腸埃希菌仍有抑制。由于藥典規(guī)定每張濾膜沖洗量不得大于1000mL，故將1∶50的供試液50mL分5張膜進行薄膜過濾，制備5份進行試驗。

本文只將最后確認的方法進行了體現(xiàn)。