朱頂紅花孔雀和黑天鵝離體快繁技術(shù)體系的建立

魯嬌嬌，張夢(mèng)迪，孫紅梅

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院/設(shè)施園藝省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110161；2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所，沈陽110161）

朱頂紅（Hippeastrum vittatum）植株端正、花型豐富、花朵碩大、花葉共賞，是深受人們喜愛的球根花卉，廣泛應(yīng)用于盆栽、切花及綠化，市場(chǎng)價(jià)值巨大。但迄今，我國朱頂紅的優(yōu)質(zhì)種球主要依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴是在國內(nèi)大量應(yīng)用的瓶頸。朱頂紅鱗莖的自然繁殖率較低，通常采用鱗莖扦插和刻傷等方法繁殖，但成本高、生根率低、成苗率低，難以滿足市場(chǎng)需求。用離體快速繁殖培養(yǎng)方式，不僅可以加快成苗速度、提高繁殖系數(shù)、縮短生育周期，同時(shí)可以大量獲取無病毒植株。目前，組織培養(yǎng)是國內(nèi)外關(guān)于朱頂紅研究的熱點(diǎn)問題，已有一些報(bào)道[1-9]，但朱頂紅以鱗片為外植體不同基因型之間再生條件也有顯著差異[10-17]。朱頂紅品種花孔雀為重瓣花，花瓣邊緣粉紅色，中心白色呈愛心型，極具夢(mèng)幻色彩；黑天鵝為單瓣花，花瓣深紅色具絲綢般質(zhì)感，雍容華貴，觀賞性很高，二者均具有較好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。本試驗(yàn)在總結(jié)前人研究基礎(chǔ)上，以花孔雀和黑天鵝鱗片為外植體，探究了在不同激素濃度與配比條件下對(duì)誘導(dǎo)的影響，不同鱗莖取材部位對(duì)誘導(dǎo)影響，生根培養(yǎng)和馴化移栽最佳條件等，以期系統(tǒng)地探索其離體高效再生技術(shù)體系，對(duì)該優(yōu)良朱頂紅品種推廣和應(yīng)用具有重要意義，為完善朱頂紅種球工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科研基地日光溫室種植的荷蘭朱頂紅雜交品種花孔雀和黑天鵝鱗莖，周徑25cm，常規(guī)栽培管理。試驗(yàn)中所用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 6-芐氨基腺嘌 （6-Benzylaminopurine，6-BA）、萘乙酸 （1-Naphthylacetic acid，NAA）、噻苯隆（Thidiazuron，TDZ），購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

試驗(yàn)采用 MS 固體培養(yǎng)基（含 MS 基本培養(yǎng)基，蔗糖 30g·L-1，瓊脂 7g·L-1，pH 值 5.8），在 121℃條件下，滅菌20min。組培苗培養(yǎng)室溫度為（25±1）℃，每天光照 16h，光照強(qiáng)度為 36μmol·m-2·s-1。以生長(zhǎng)健壯無病蟲害的鱗莖為材料，清洗干凈，鱗莖剝除外層鱗片，切去球莖頂部及根部，浸泡在洗衣粉水中30min，在流水中沖洗1h。在無菌條件下，先用70%酒精浸泡搖晃1min，再0.1%的升汞浸泡搖晃8min，最后無菌水清洗6 次。將消毒后的鱗片切割成約5mm2的切塊，準(zhǔn)備接種。

1.2.1 NAA 和不同濃度TDZ 對(duì)鱗片誘導(dǎo)小鱗莖的影響 將花孔雀和黑天鵝鱗片切塊培養(yǎng)在添加NAA（0.5 mg·L-1）和不同濃度的 TDZ（1，2，3，4mg·L-1）的 MS 培養(yǎng)基上，每個(gè)處理 42 個(gè)外植體，3 次重復(fù)，觀察鱗片誘導(dǎo)情況。

1.2.2 6-BA、NAA 和不同濃度TDZ 對(duì)鱗片誘導(dǎo)愈傷組織的影響 將朱頂紅花孔雀和黑天鵝鱗片切塊培養(yǎng)在添加 6-BA（2mg·L-1）、NAA（1mg·L-1）和不同濃度的 TDZ（0.5，1.0，2.0，3.0mg·L-1）的 MS 培養(yǎng)基上，每個(gè)處理 42個(gè)外植體，3 次重復(fù)，觀察鱗片誘導(dǎo)情況。

1.2.3 不同鱗片取材部位對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 將花孔雀和黑天鵝的鱗片切塊分成上部 （約0.5cm）、中部（約 0.5cm）、下部（帶鱗莖盤，約 0.5cm），分別接種在 MS+2mg·L-16-BA+1mg·L-1NAA+2mg·L-1TDZ 培養(yǎng)基中，每個(gè)處理36 個(gè)外植體，3 次重復(fù)，觀察鱗片不同部位誘導(dǎo)情況。

1.2.4 繼代培養(yǎng)和植株再生 將初培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)一步培養(yǎng)于原培養(yǎng)基中，每隔30 d 繼代1 次，連續(xù)繼代4 次，觀察愈傷組織的形態(tài)和繼代情況。將切成小塊的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至不添加激素的MS 培養(yǎng)基上，進(jìn)一步培養(yǎng)體細(xì)胞胚發(fā)育形成完整植株；將不定芽接種在MS+2 mg·L-16-BA+1mg·L-1NAA+1mg·L-1TDZ培養(yǎng)基中。每個(gè)處理24 個(gè)，進(jìn)行3 次繼代，每30d 繼代1 次，觀察生長(zhǎng)情況。

1.2.5 生根培養(yǎng) 朱頂紅無菌苗小鱗莖直徑大于1cm 時(shí)，分別移接到MS 和MS+NAA 1.5mg·L-1培養(yǎng)基上，20d后觀察生根情況。

1.2.6 馴化移栽 將生根培養(yǎng)20d 三角瓶置于溫室3d，然后去掉封口膜繼續(xù)放置3d 馴化。以不馴化直接移栽做對(duì)照。栽植前將無菌苗取出，洗凈根部培養(yǎng)基，注意不要傷根，處理后栽于經(jīng)高溫消毒后草炭∶珍珠巖∶蛭石（v/v/v）為1∶1∶1 的混合基質(zhì)中，栽植后進(jìn)行7d 遮蔭處理，觀察朱頂紅的生長(zhǎng)情況，30d 后調(diào)查成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAA和不同濃度TDZ 對(duì)鱗片誘導(dǎo)小鱗莖的影響

花孔雀培養(yǎng)7d 鱗片有部分變棕色（圖1A）；15d 后鱗片變綠并膨大（圖1B）；繼續(xù)培養(yǎng)30d 后鱗片膨大，邊緣變?yōu)榧t色（圖1C）；培養(yǎng)60d 后鱗片形成小球（圖1D）；至75d 小球形成小芽，小芽繼代培養(yǎng)20d 形成小鱗莖（圖1E）。黑天鵝培養(yǎng) 7d 鱗片無啟動(dòng)現(xiàn)象，15d 后鱗片變褐色（圖1a）；培養(yǎng) 30 d 鱗片膨大（圖1b）；培養(yǎng) 65d 鱗片形成白色小球（圖1c）；至85d 形成小芽（圖1d）；小芽繼代培養(yǎng)30 d 形成小鱗莖（圖1e）。將兩個(gè)品種的小鱗莖切割下來在MS 培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)生根均可形成完整植株（圖1F 和圖1f）?；兹赶鄬?duì)黑天鵝誘導(dǎo)小鱗莖、形成完整植株需要時(shí)間更短。

圖1 朱頂紅鱗片小鱗莖誘導(dǎo)進(jìn)程Figure 1 Bulbelt induction process on scales of Hippeastrum vittatum

花孔雀鱗莖誘導(dǎo)在MS 培養(yǎng)基中添加0.5mg·L-1NAA 和2mg·L-1TDZ 時(shí)，其誘導(dǎo)率最高，達(dá)到78.13%。但在3mg·L-1TDZ 時(shí)，誘導(dǎo)率為71.43%，鱗片上形成的小球數(shù)量最多，為4 個(gè)，其他3 種處理為2 個(gè)。黑天鵝鱗莖誘導(dǎo)，當(dāng)在MS 培養(yǎng)基中添加3mg·L-1TDZ 時(shí)，其誘導(dǎo)率最高為70.00%，且誘導(dǎo)的小球數(shù)量最多。由試驗(yàn)的誘導(dǎo)情況可得出花孔雀和黑天鵝最佳誘導(dǎo)小鱗莖的培養(yǎng)基均為添加0.5mg·L-1NAA 和3mg·L-1TDZ 的組合（表1）。

表1 NAA 和不同濃度的TDZ 對(duì)朱頂紅鱗片小鱗莖誘導(dǎo)率影響Table 1 Effects of NAA and different concentration of TDZ on bulbelt induction of Hippeastrum vittatum

2.2 6-BA、NAA 和不同濃度TDZ 對(duì)鱗片誘導(dǎo)愈傷組織的影響

花孔雀培養(yǎng)7d 鱗片邊緣變褐色，20d 后鱗片背面由白色變綠色且鱗片稍稍膨大（圖2A）；至30d 鱗片進(jìn)一步膨大增厚（圖2B）；培養(yǎng)50d 形成愈傷組織（圖2C）；繼代培養(yǎng)30d 形成體細(xì)胞胚（圖2D）；將發(fā)育的體細(xì)胞胚繼代在MS 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)35d 形成小芽（圖2E）；小芽在MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)成苗（圖2F）。

黑天鵝培養(yǎng)7d 無啟動(dòng)現(xiàn)象，15d 后鱗片邊緣微微凸起（圖2a）；培養(yǎng)30 d 鱗片膨大增厚（圖2b）；至45d 鱗片體積更加膨大（圖2c）；培養(yǎng)60d 形成愈傷組織（圖2d）；培養(yǎng)90d 愈傷組織增殖變大（圖2e）；繼代在MS 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30d 形成不定芽（圖2f）；繼續(xù)培養(yǎng)生根成完整植株。

圖2 朱頂紅鱗片愈傷組織及小植株誘導(dǎo)進(jìn)程Figure 2 Callus and plantlets induction process time on scales of Hippeastrum vittatum

兩個(gè)品種朱頂紅形成小植株的途徑不同，花孔雀在誘導(dǎo)出愈傷組織后，形成的胚性愈傷組織為100%，繼續(xù)培養(yǎng)能夠形成體細(xì)胞胚，經(jīng)過體細(xì)胞胚發(fā)育形成小植株；但黑天鵝在誘導(dǎo)出愈傷組織后，繼代培養(yǎng)能形成不定芽，之后能夠形成小植株。

在 MS＋2mg·L-16-BA+1mg·L-1NAA+2mg·L-1TDZ 條件下，鱗片誘導(dǎo)率最高，花孔雀誘導(dǎo)率達(dá) 80.00%，黑天鵝誘導(dǎo)率達(dá)64.29%（表2）。

2.3 不同鱗片取材部位對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

兩種朱頂紅鱗片基部誘導(dǎo)速率較快，20d 后出現(xiàn)膨大現(xiàn)象，花孔雀培養(yǎng)50d 形成愈傷組織，至80d 形成體細(xì)胞胚（圖3A 和圖3B）；黑天鵝培養(yǎng)60d 形成愈傷組織，至120d 形成不定芽（圖3a 和圖3b）。兩種朱頂紅鱗片中部和上部啟動(dòng)時(shí)間稍晚于鱗片基部。形成的體細(xì)胞胚或不定芽繼續(xù)培養(yǎng)可形成小植株。鱗片基部 （帶鱗莖盤）相對(duì)鱗片中部和鱗片上部不易污染褐化，鱗片上部最易褐化。

3 種鱗片部位，其中鱗片基部誘導(dǎo)效果最好，花孔雀和黑天鵝的誘導(dǎo)率分別為81.81%和68.75%（表3）。

2.4 生根培養(yǎng)與馴化移栽

朱頂紅生根相對(duì)容易，在不添加激素的MS 培養(yǎng)基中即可生根（圖4A），但添加NAA 有利于根數(shù)的增加而且根較粗壯（圖4B），為適宜生根培養(yǎng)基。

正常無菌苗在溫度恒定、較高濕度、光照微弱的環(huán)境中培養(yǎng)，移栽前需要進(jìn)行馴化以適應(yīng)外界環(huán)境條件。而朱頂紅經(jīng)過試驗(yàn)證明可以不經(jīng)過馴化直接移栽，生根好的無菌苗移栽成活率可達(dá)100%（圖4C），減少了生產(chǎn)環(huán)節(jié)和成本，有效節(jié)省了時(shí)間。

表2 6-BA、NAA 和不同濃度的TDZ 對(duì)朱頂紅鱗片愈傷組織誘導(dǎo)率影響Table 2 Effects of 6-BA, NAA and different concentration of TDZ on callus induction of Hippeastrum vittatum

表3 6-BA、NAA 和不同濃度的TDZ 對(duì)朱頂紅鱗片愈傷組織誘導(dǎo)率影響Table 3 Effects of 6-BA, NAA and different concentration of TDZ on callus induction of Hippeastrum vittatum

圖3 朱頂紅不同鱗片部位誘導(dǎo)的影響Figure 3 Effects of different scales parts on induction process of Hippeastrum vittatum

3 討論

本試驗(yàn)中花孔雀和黑天鵝在同一條件下的誘導(dǎo)率有差異，分別為81.81%和68.75%；張松等[11]利用自選品種成功誘導(dǎo)鱗莖形成愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)93.3%；婁曉鳴等[13]研究朱頂紅‘蘋果’和‘雜交后代18 號(hào)’的組培繁殖，二者的誘導(dǎo)率差異顯著；張曉燕[18]等指出‘哈庫’，‘奇妙的丁香’的誘導(dǎo)率分別為35.1%和68.9%；高年春等[12]研究指出，對(duì)‘哈庫’，‘奇妙的丁香’和‘橙色賽維’進(jìn)行誘導(dǎo)，品種‘奇妙的丁香’誘導(dǎo)效率顯著高于其他品種。由此可見相同的培養(yǎng)基對(duì)不同基因型的朱頂紅誘導(dǎo)率是不同的。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示不同基因型朱頂紅的誘導(dǎo)率有較大差別，誘導(dǎo)成苗時(shí)間也不同。今后還需要對(duì)不同基因型朱頂紅進(jìn)行大量試驗(yàn)，對(duì)快繁體系進(jìn)一步優(yōu)化。

鱗片取材部位會(huì)影響誘導(dǎo)率，鱗片基部（帶鱗莖盤）誘導(dǎo)率高于鱗片中部和鱗片上部，而只使用鱗莖盤進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率卻較低[19-20]。張亞玲[3]研究結(jié)果顯示鱗片中部誘導(dǎo)率高于鱗片上部。這與本試驗(yàn)誘導(dǎo)結(jié)果利用鱗片基部（帶鱗莖盤）誘導(dǎo)率最高，鱗片中部誘導(dǎo)率次之結(jié)果相同。

圖4 生根與移栽Figure 4 Rooting and transplantation

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)誘導(dǎo)的效果不同，本試驗(yàn)利用6-BA 和NAA 這兩種激素，鱗片啟動(dòng)率很低。TDZ 能促進(jìn)芽再生和芽增殖，當(dāng)添加高濃度TDZ 時(shí)，對(duì)于體細(xì)胞胚形成有益，TDZ 在低濃度時(shí)對(duì)芽誘導(dǎo)具有促進(jìn)效果[21]。本試驗(yàn)研究在NAA 和6-BA 配合使用的基礎(chǔ)上添加TDZ 效果較好，最佳誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基為MS＋2mg·L-16-BA＋1mg·L-1NAA＋2mg·L-1TDZ，最佳誘導(dǎo)小鱗莖培養(yǎng)基為 MS＋1mg·L-1NAA＋3mg·L-1TDZ。本試驗(yàn)在不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑條件下成苗通過兩種途徑，可以直接誘導(dǎo)小鱗莖快速成苗，增殖系數(shù)最高能達(dá)到3.13，生產(chǎn)周期最短155d 可以下地移栽；可以通過愈傷組織途徑進(jìn)行繼代培養(yǎng)，增殖系數(shù)最高達(dá)到7.31，繁殖數(shù)量多，生產(chǎn)周期最短145d 可以下地移栽，此途徑適合進(jìn)行工廠化育苗生產(chǎn)。同樣的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑條件下不同基因型朱頂紅反應(yīng)也不相同，本試驗(yàn)中花孔雀可100%形成的胚性愈傷組織，經(jīng)過體細(xì)胞胚發(fā)育形成小植株；但黑天鵝在誘導(dǎo)出愈傷組織后，繼代培養(yǎng)通過形成不定芽途徑形成小植株，形成植株不同途徑的分子機(jī)制還有待研究。