蠶豆萎蔫病毒2號(hào)遼寧藜分離物的鑒定

李 梁，楊彩霞，侯秋實(shí)，王筠竹，于美春

（沈陽(yáng)大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院/遼寧省城市有害生物治理與生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110044）

蠶豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus, BBWV)是豇豆花葉病毒科(Comoviridae)蠶豆病毒屬(Fabavirus)的典型種，其基因組由 2 條單鏈 RNA 分子組成，分別為 6.0kb 的 RNA1 和 3.6 kb 的 RNA2。BBWV 有 2 種血清型，根據(jù)不同的血清型分為兩個(gè)種：BBWV1 和BBWV2[1]。RNA1 編碼的多聚蛋白進(jìn)一步加工成5 種功能蛋白：輔因子(protease cofactor)、解旋酶(Helicase)、蛋白酶(protease)、基因結(jié)合蛋白(NTP-binding protein)和 RNA依賴(lài)性RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)。RNA2 編碼的一種多蛋白進(jìn)一步加工形成3 種功能蛋白，1 種運(yùn)動(dòng)蛋白 (movement protein, MP) 和2 種衣殼蛋白 (large coat protein:LCP 和small coat protein:SCP)[2]。1947 年，STUBBS[3]首次從蠶豆中發(fā)現(xiàn)蠶豆萎蔫病毒。1982 年，奚仲興等[4]在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)蠶豆萎蔫病毒。周雪平等[5]測(cè)定了BBWV2 中國(guó)分離物(B935)的全基因序列，并分析了其基因表達(dá)和蛋白功能。牛顏冰等[6]在山西省泰山區(qū)植物栽培基地調(diào)查辣椒病，確定辣椒病毒病的病原體是BBWV2，并獲得BBWV2 辣椒分離株(BBWV2-Ca)的完整基因組序列。王曉燕[7]完成一串紅BBWV2 分離株S4 的分子鑒定和基因組測(cè)定，并報(bào)道BBWV2 辣椒分離株XJP1-1 和番茄分離株XI14-3a 的序列差異。本研究對(duì)侵染遼寧藜植物的病毒分離物BBWV2 進(jìn)行鑒定，首次報(bào)道BBWV2 遼寧藜分離物RNA1 和RNA2 的基因組序列，為病毒的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2016 年6 月，于遼寧省沈陽(yáng)市發(fā)現(xiàn)疑似病毒侵染的藜樣品。病株表現(xiàn)系統(tǒng)性病變，葉肉退化或消失僅存中肋，葉片僵硬，數(shù)條葉脈由葉基部延申使葉片皺縮呈扇形。采集病葉存于-80℃超低溫冰箱備用（圖1）。

大 腸 桿 菌 DH-5α 菌 株 、RNASimple Total RNA Kit、總 RNA 提取試劑盒、TIANScript Ⅱ cDNA 第一條鏈合成試劑盒和TIANgel Midi Purification Kit 普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技 (北京) 有限公司；DNA ladder DL2000、Ex Taq 酶、dNTP和PMD-18T 連接試劑盒購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。

圖1 藜皺縮癥狀葉片樣品（a.整株植物；b.單個(gè)葉片）Figure 1 The Chenopodium album L.plants showing shrink leaf symptoms（a.Whole plant; b.Single leaf）

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取和質(zhì)量檢測(cè) CTAB 法提取病樣總 RNA 后，利用 Nanodrop 2000 檢測(cè)總 RNA 的OD260、OD280和 OD230值，期望獲得 OD260/280≥1.8，OD260/230≥1.8 的達(dá)標(biāo)樣品。OD 值越接近標(biāo)準(zhǔn)值建庫(kù)失敗的風(fēng)險(xiǎn)越小，反之則風(fēng)險(xiǎn)越大。利用Agilent 2100 測(cè)定RNA 的完整性，期待獲得高RIN 值，RIN 值越高說(shuō)明 RNA 的質(zhì)量越好[8]。利用Agilent 2100 檢測(cè)28S/18S 判斷樣品的Total RNA 是否降解(深圳華大基因科技有限公司)。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的構(gòu)建 取一定量質(zhì)量達(dá)標(biāo)的Total RNA 樣品，DNaseI 消化樣品中存在的DNA，磁珠純化回收反應(yīng)產(chǎn)物后溶于DEPC 水中。取消化的Total RNA 樣品，用Ribo-Zero 試劑盒去除總RNA 中高含量的rRNA；在上一步回收的RNA 中加入打斷試劑形成片段化的RNA，其在隨機(jī)N6 引物的指導(dǎo)下反轉(zhuǎn)得到cDNA，進(jìn)而形成雙鏈DNA。把合成的雙鏈DNA 末端補(bǔ)平并5’端磷酸化，3' 端加上一個(gè)“A”的粘末端，再連接一個(gè)3' 端有凸出“T”的鼓泡狀的接頭。連接產(chǎn)物通過(guò)特異的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物熱變性成單鏈，再用一段橋式引物將單鏈DNA 環(huán)化得到單鏈環(huán)狀DNA 文庫(kù)，上機(jī)測(cè)序 (深圳華大基因科技有限公司)。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序原始數(shù)據(jù)處理與分析 Raw Reads 需經(jīng)過(guò)過(guò)濾去除那些低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N 含量過(guò)高的 reads，從而得到clean reads。使用CLC genomics Workbench (Aarhus, Denmark) 軟件對(duì) clean reads 進(jìn)行進(jìn)一步組裝拼接以期獲得較長(zhǎng)的contigs。基于得到的contigs，通過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中BLASTn 或者BLASTx 程序，尋找那些可能是病毒來(lái)源的contigs (高通量數(shù)據(jù)分析由西南大學(xué)曹孟籍副研究員完成）[9]。

1.2.4 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物 基于搜尋到的同源序列，把contigs 在病毒基因組上的位置標(biāo)記出來(lái)，供PCR 引物設(shè)計(jì)參考。擴(kuò)增RNA1 的引物序列見(jiàn)表1，擴(kuò)增RNA2 基因組序列的引物見(jiàn)表2。

1.2.5 病毒的RT-PCR 檢測(cè) 取藜皺縮癥狀葉片樣品10 mg，于研缽里面添加液氮之后立即研磨為粉末狀，通過(guò)RNASimple Total RNA Kit 總RNA 提取試劑盒和TIANScript Ⅱ cDNA 第一條鏈合成試劑盒提取到藜樣品的總 RNA 以及 cDNA 的合成。向 PCR 管中依次加入病樣總 RNA 3μL、Oligo-(dT)15(10μmol·L-1) 2μL和 Super Pure dNTPs (10m mol·L-1) 1μL，再加入 RNase-free H2O 補(bǔ)充至 14.5μL，混勻后置于 65℃金屬浴上孵育5min；迅速轉(zhuǎn)至冰上 2min；將上述溶液瞬離后加入 5×TIANScript Ⅱ RNase Buffer 4μL、RNasin (40units·μL-1)0.5μL、TIANScript Ⅱ RTase (200units·μL-1)1μL 混勻，于 42℃金屬浴上孵育 60min，轉(zhuǎn)入 85℃金屬浴加熱5min 終止反應(yīng)，補(bǔ)充 RNase free H2O 20μL 即得到 cDNA，置-20℃冰箱保存。以 cDNA 為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序設(shè)計(jì)7 對(duì)引物對(duì)病毒的全基因組進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為25μL，設(shè)置的PCR 程序是：94℃條件下 3min；94℃條件下 40s，50～55℃條件下 40s，72℃條件下 1min，實(shí)驗(yàn)需完成 30～40 個(gè)循環(huán)；于 72℃條件下延伸10min。

表1 用于擴(kuò)增BBWV2-RNA1 基因組的PCR 反應(yīng)引物Table 1 Polymerase chain reaction primers used for amplification of the BBWV2-RNA1 genome

表2 用于擴(kuò)增BBWV2-RNA2 基因組的PCR 反應(yīng)引物Table 2 Polymerase chain reaction primers used for amplification of the BBWV2-RNA2 genome

反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠針對(duì)PCR 產(chǎn)物實(shí)施電泳檢測(cè)，把目的條帶用TIANgel Midi Purification Kit 普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒完成回收與純化處理。把回收產(chǎn)物和pMD-18T 克隆載體于16℃條件下實(shí)施連接3h 后轉(zhuǎn)入DH5α 菌株的感受態(tài)細(xì)胞；在LB 液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)1h 后，取100μL 轉(zhuǎn)化液均勻涂于LB 固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落至5 mL LB(Amp)液體培養(yǎng)基里，37℃下230r·min-1搖床中培養(yǎng)過(guò)夜。取出2μL 菌液實(shí)施菌液PCR 鑒定，陽(yáng)性樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 序列分析 通過(guò)DNAStar 和DNAMAN Version 6.0 軟件針對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并借助美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)當(dāng)中的BLAST 程序搜索同源序列。通過(guò)應(yīng)用DNAStar 的Clustal V 程序可完成同源性分析，并以Clustal_X version 1.83[10]實(shí)施完全比對(duì)，接著以MEGA version 5.13 軟件基于最大似然法完成親緣關(guān)系樹(shù)的繪制，設(shè)定種子重復(fù)數(shù)量為1000，分支節(jié)點(diǎn)之上的數(shù)值是后驗(yàn)概率，超過(guò)50%顯示。

1.2.7 BBWV-2 特異性檢測(cè) 選取6 株病癥明顯的藜植株提取RNA 和cDNA 的合成，利用R2/3F 引物對(duì)BBWV-2 進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，選取2 株無(wú)病癥的藜作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 質(zhì)量檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)得到 OD260/280為 2.09，OD260/230為 1.85；RIN 值為 7，28S/18S 為 1.3 的質(zhì)量合格的 RNA 樣品，可以用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建。

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及分析

使用BGISEQ-500 平臺(tái)一共測(cè)了11.83Gb 數(shù)據(jù)，得到的總Raw Reads 為132.87M，過(guò)濾后得到總CleanReads 為 118.25 M。過(guò)濾后 reads 通過(guò) CLC Genomics Workbench 生物信息軟件進(jìn)行過(guò)濾和拼接，得到的長(zhǎng)度為 5945 和 3550 的 2 個(gè) contigs。進(jìn) 行 BLASTn 和BLASTx 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與BBWV2 的高度同源。

2.3 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

利用引物 R1-1F/R1-1R、R1-2F/R1-2R、R1-3F/R1-3R、R1-4F/M4 對(duì)藜病葉的 cDNA 實(shí)施病毒 RNA1基因組的擴(kuò)增，獲得大小分別約為1700bp (泳道1)、1700bp (泳道 3)、1700bp (泳道 5)和 800bp (泳道 7)的電泳條帶。利用引物 R2-1F/R2-1R、R2-2F/R2-2R 和R2-3F/M4 對(duì)藜病葉的cDNA 實(shí)施病毒RNA2 基因組的擴(kuò)增，獲得大小分別約為1600bp (泳道9 和11)和350bp (泳道13)的電泳條帶。所有電泳條帶與預(yù)期大小相符，但沒(méi)有在健康植物中擴(kuò)到條帶(圖2)。將陽(yáng)性條帶進(jìn)行回收純化之后連接克隆載體pMD18T 進(jìn)行克隆測(cè)序。

圖2 藜病葉BBMV2 病毒全長(zhǎng)基因組的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 PCR amplification of full-length genome of BBWV2 associated with Chenopodium album L.

2.4 基因結(jié)構(gòu)分析

測(cè)得序列通過(guò)DNAMAN 生物軟件進(jìn)行拼接組裝，獲得藜樣品當(dāng)中病毒的RNA1 基因組，長(zhǎng)5891 nt(GenBank 登錄號(hào)為 MN786954)，RNA2 基因組長(zhǎng)為 3549 nt (GenBank 登錄號(hào)為 MN786955)。通過(guò) ORF finder程序分析RNA1 和RNA2 的基因結(jié)構(gòu)。RNA1 和 RNA2 分別編碼一個(gè)多聚蛋白，位于RNA1 的150-5756 nt(1868 aa) 和 RNA2 的 161-3355 nt (1064 aa)。其中，RNA2 含有 MP (161-1555 nt，465 aa)、LCP (1556-2761 nt，402 aa)和 SCP (2762-3352 nt，197aa)。

2.5 同源性分析和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

基于RNA1 序列在Blast 中查找同源序列，發(fā)現(xiàn)與Broad bean wilt virus 2 (BBWV2) RNA1 序列的同源在79.70%～84.00%。挑選代表性的RNA1 序列，基于全序列利用DNASTAR 軟件Clustal W 進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與BBWV2 遼寧芝麻分離物BBWV2-[CN:Sesamum indicum](MK116519)最同源，達(dá)到83.4%，其次是跟中國(guó)白術(shù)分離物BBWV2-[CN:atractylodes macrocephala](JX575182)，同源性達(dá)到80.99%。同源性最低的是新加坡分離物 BBWV2-[Singapore]，為 78.03%（表3）。

基于RNA2 序列在Blast 中查找同源序列，發(fā)現(xiàn)與Broad bean wilt virus 2 (BBWV2)RNA2 序列的同源在77.59%～88.83%，其中同源性最高的是BBWV2 中國(guó)生地分離物BBWV2-[CN:Rehmannia](GQ20221)，其次是中國(guó)山西辣椒分離物BBWV2-[CN:Sx:Capsicum](KF498697)，為86.55%。挑選代表性的RNA2 序列進(jìn)行cp基因的同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，基于氨基酸序列時(shí)藜分離物與韓國(guó)益母草分離物BBWV2-[SK:AD:Leonurus](KM076649)的同源性最高，為96.5%；其次與中國(guó)新疆辣椒分離物BBWV2-[CN:XJ:Pepper](HQ283390)同源性為95.8%?；诤塑账岜葘?duì)時(shí)，與山西辣椒分離物BBWV2-[CN:Sx:Capsicum](KF498697)同源性最高的，為85.9%；其次是與中國(guó)山西辣椒分離物BBWV2-[CN:XJ;pepper](HQ283390)同源性為84.9%(表4)。BBWV2 藜分離物CP 氨基酸序列與報(bào)道的BBWV2 分離物CP 同源性高于標(biāo)準(zhǔn) (CP 氨基酸序列相似性小于75%)，可見(jiàn)，其為BBWV2 的遼寧藜分離物 (BBWV2-LNSY)。

基于RNA1 全序列構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)(圖3)，BBWV2 藜分離物與遼寧芝麻分離物BBWV2-[CN:LN:Sesamum](MK118749)、韓國(guó)安東益母草分離物BBWV2-[SK: AD: Leonurus sibiricus](KM076648)系統(tǒng)關(guān)系最近，聚集在同一個(gè)分支上?；赗NA2 的cp 基因構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系樹(shù) (圖4)，BBWV2 藜分離物與新疆辣椒分離物BBWV2-[CN:XJ;pepper](HQ283390)、韓國(guó)安東益母草分離物BBWV2-[SK:AD:Leonurus](KM076649)、遼寧芝麻分離物BBWV2-[CN:LN:Sesamum](MK118749)、山西辣椒分離物BBWV2-[CN:Sx:Capsicum](KF498697)、山西白術(shù)分離物BBWV2-[CN:SX:Atractylodes](KC110085)關(guān)系最近，聚類(lèi)在一個(gè)分支上。而中國(guó)其他地區(qū)分離物，例如中國(guó)浙江豇豆分離物BBWV2-[CN:ZJ:cowpea](AJ312437)、中國(guó)安徽蠶豆分離物BBWV2-[CN:AH:Via](KY606993)、中國(guó)山東山藥分離物BBWV2-[CN:SD:Dioscorea (KJ789137)、中國(guó)湖南辣椒分離物BBWV2-[CN:Hu:Chi](KJ825857)、中國(guó)浙江豇豆分離物 BBWV2-[CN:ZJ:cowpea](AJ312437) 則在其他分支上。MN786956 作為群外組單獨(dú)一個(gè)分支。BBWV2 分離物所在分支既存在中國(guó)遼寧芝麻分離物也有韓國(guó)安東益母草分離物，說(shuō)明其間親緣關(guān)系較近，可能來(lái)源于韓國(guó)[11]。

表3 BBWV2-RNA1 與相關(guān)的病毒核苷酸序列的同源性比對(duì)Table 3 Homology comparison of BBWV2-RNA1 with related viral nucleotide sequences

2.6 BBWV 與藜病害伴隨檢測(cè)

利用R2/3F 引物對(duì)6 株病癥明顯的藜植株進(jìn)行BBWV2 的特異性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)6 株樣品均有350bp 的目的片段出現(xiàn)。但是，在無(wú)病癥的兩株藜樣品中沒(méi)有擴(kuò)增到該特異片段?？梢?jiàn)，BBWV2 與藜病害相伴隨。

3 討論與結(jié)論

藜(Chenopodium album L.)為藜科藜屬植物，是危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要雜草之一[12]。目前，在歐洲和北美均有藜自然條件下被馬鈴薯Y 病毒(Potato Y Virus, PVY)[13]侵染的報(bào)道，但在中國(guó)尚無(wú)藜病毒病發(fā)生的報(bào)道。前期病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)沈陽(yáng)地區(qū)常見(jiàn)雜草藜上表現(xiàn)嚴(yán)重的皺縮癥狀，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和RT-PCR 驗(yàn)證確定該分離物具有2 條RNA，均與BBWV2 最同源。分析RNA1 和RNA2 的基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其具有典型的豇豆花葉病毒科(Comoviridae)病毒基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?；赗NA2 編碼的CP 氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與其他已經(jīng)發(fā)表的BBWV2 分離物的同源性均在80%以上。因此，根據(jù)國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(ICTV)第十次報(bào)告中報(bào)道的Fabavirus 分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)(CP 氨基酸序列相似性小于75%，可認(rèn)為是不同病毒種) ，可判定侵染沈陽(yáng)藜植物的病毒為BBWV2 的遼寧分離物，這是國(guó)際上有關(guān)BBWV2 自然侵染藜的首次報(bào)道。此外，本研究通過(guò)特異性片段檢測(cè)初步判斷BBWV2 與藜病害相伴隨。但是，由于缺少柯赫氏法則的驗(yàn)證，尚不能斷定藜病害由BBWV2 所致，不排除BBWV2 自然條件下與其他種類(lèi)病毒復(fù)合侵染所致。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將嘗試構(gòu)建BBWV2 的侵染性克隆，為更多地了解其致病特性提供數(shù)據(jù)。

表4 BBWV2 遼寧分離物與其他報(bào)道BBWV2 分離物的cp 基因的氨基酸與核苷酸序列同源性Table 4 Percentage of amino acid and nucleotide sequence identities between cp gene of isolates of Liaoning and other published BBWV2 isolates

圖3 基于已報(bào)道的BBWV2 RNA1 基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 3 Phylogenetic trees based on RNA1 sequences of the previously reported BBWV2

圖4 基于已報(bào)道的BBWV2 cp 基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 4 phylogenetic trees based on cp nucleotide sequences of the previously reported BBWV2

BBWV2 寄主范圍很廣，可侵染44 科 186 屬328 種植物，是世界流行性病毒病原[14-16]。在中國(guó)，BBWV2已經(jīng)在新疆、安徽、云南、山西和湖南等地區(qū)發(fā)生和危害，不僅能侵染蠶豆、青椒、煙草、花卉和中草藥[17-21]，還能侵染葡萄等多種木本植物，引起花葉、矮化、萎蔫和植株枯死，導(dǎo)致明顯的負(fù)面危害[22]。劉勇等[23]于2013～2017 年間對(duì)我國(guó) 31 個(gè)省(市、自治區(qū))開(kāi)展的蔬菜作物主要病毒病發(fā)生情況進(jìn)行普查，發(fā)現(xiàn)BBWV2 在23個(gè)地區(qū)的蔬菜作物有4.82%的高檢出率，指出BBWV2 是當(dāng)前危害我國(guó)蔬菜作物的四種優(yōu)勢(shì)病毒之一，也是遼寧地區(qū)蔬菜的四種優(yōu)勢(shì)病毒之一。在遼寧地區(qū)，徐千惠等[24]首次調(diào)查了5 個(gè)蔬菜種植區(qū)BBWV2 的危害情況，發(fā)現(xiàn)其檢出率為0.9%，嚴(yán)重為害番茄、辣椒和菜豆等多種蔬菜作物。鑒于BBWV2 的高危害性以及藜在中國(guó)各地廣泛分布，極易造成BBWV2 的大面積蔓延進(jìn)而嚴(yán)重危害遼寧地區(qū)蔬菜生產(chǎn)，有必要繼續(xù)系統(tǒng)地針對(duì)BBWV2 病害實(shí)施調(diào)查與檢測(cè)，為該病害防治工作奠定基礎(chǔ)支撐。