草原龍膽花瓣花色素苷組成及與其花色的關(guān)系

高 嵩，李天來

（1.遼寧省經(jīng)濟(jì)作物研究所，遼寧 遼陽 111000；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，沈陽 110161）

花色是觀賞植物最重要的觀賞性狀之一[1]，花色素苷是花色形成的物質(zhì)基礎(chǔ)[2]，分析花瓣中色素的成分對于探討花色形成的機(jī)理和分子育種都有重要的意義。目前，花瓣中色素含量和組分的研究已在菊花[3]、睡蓮[4]、野百合[5]、風(fēng)信子[6]、二月蘭[7]等觀賞植物中展開，而關(guān)于草原龍膽花色苷素在花瓣中的組成和含量尚未見報(bào)道。草原龍膽[Eustoma grandiflorum（Raf.）Shinners]又名洋桔梗，是龍膽科草原龍膽屬宿根花卉，原產(chǎn)北美洲，一、二年草本植物。因其花色豐富，花型典雅，是鮮切花市場上的新興花卉[8]。目前，草原龍膽的研究多數(shù)集中在種質(zhì)遺傳多樣性[9]、栽培技術(shù)[10]、花藥離體培養(yǎng)[11]、切花保鮮[8]、表型特征和生長特性[12]以及高溫誘導(dǎo)蓮座化分析[13]等方面。草原龍膽花色繁多，是研究花色合成途徑的良好材料，關(guān)于花色素合成途徑調(diào)控基因功能的研究已經(jīng)展開[14-17]，而草原龍膽花瓣中花色素苷的類型和數(shù)量目前仍不清楚。

本研究通過對花色描述、特征顏色反應(yīng)及UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)對草原龍膽12 個(gè)品系的花色、花色素類型及其花瓣中的花色素含量、花色苷組分進(jìn)行定性和定量分析，旨在草原龍膽色素的純化、分離、鑒定等工作奠定基礎(chǔ)。運(yùn)用線性回歸方法分析CIE L*a*b*系統(tǒng)中不同色彩描述值與花色素苷的相關(guān)關(guān)系，簡單探討花色素苷含量與花色的關(guān)系，為深入闡明花色形成的生化途徑和開展草原龍膽花色的改良育種等研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試草原龍膽 12 個(gè)自育品系為 Pink02、Pink Flash02、Apricot07、Carmine03、Misty Blue01、Lavender04、Purple07、Blue01、Brown01、Yellow06、Yellow02 和 White13，其花瓣花色表型如圖1。

圖1 草原龍膽12 個(gè)品系的花色Figure 1 Flower color of Lisianthus cultivars

1.2 方法

2016 年7 月5 日8∶00，分別從盛花期的草原龍膽不同單株上剪取完全開放的花朵。每個(gè)品系分別取15～20 朵花進(jìn)行花色描述及色素定性，將剩余花朵分成3 份，每份鮮樣0.5g，用錫紙包好，液氮速凍，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 花色描述 分別取12 個(gè)品系的新鮮花瓣，放置于光線良好的室內(nèi)，避免日光直射，將花瓣中上部分與英國皇家園藝學(xué)會比色卡（Royal Horticultural SocietyColor Chart，RHSCC）進(jìn)行對比，描述花色[5]。

用色差儀（NF333 spectrophotometer，Nippon denshoku，光源C/2°）測量花瓣中上部分的亮度L*和兩個(gè)色度成分a*值（從綠到紅色）及b*值（從藍(lán)色到藍(lán)色），取平均值。使用國際照明委員會（International Commission on Illumination，CIE）系統(tǒng)進(jìn)行分析。彩度 C*=（a*2+b*2）1/2 和色度角 h=arctan（b*/a*）。在 CIE L*a*b*系統(tǒng)中，L*值從0～100，代表著明度由暗到明的變化；色相a*值由負(fù)到正，表示綠色的減退、紅色的增強(qiáng)；色相b*值由負(fù)到正，表示藍(lán)色的減退、黃色的增強(qiáng)。彩度C*是描述色彩的鮮艷程度，C*值越大，顏色越深。色相角h°是對紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫7 種顏色色調(diào)的描述，0°附近是紅色區(qū)域, 逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)經(jīng)過橙色到達(dá)90°，其附近為黃色，180°附近是綠色區(qū)域，270°附近是藍(lán)色區(qū)域，經(jīng)過紫色區(qū)域，到達(dá)360°，又回到了紅色區(qū)域[18]。

1.2.2 花色素定性分析 取草原龍膽各品系的新鮮花瓣各0.1g，分別加入5 mL 石油醚、5 mL 10% 鹽酸以及5 mL 30% 氨水，觀察并記錄提取液顏色的變化情況[19]。

1.2.3 總花色苷含量測定 花瓣中花色苷的提取參考孫衛(wèi)等的方法[20]。超高效液相色譜—二極管陣列檢測器（Ultra performance liquid chromatography with a photodiodearray detector，UPLC-PAD）為美國 Waters 公司生產(chǎn)，該系統(tǒng)裝備有高壓二元梯度泵、恒溫自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、色譜工作站（Masslynx V4.1 數(shù)據(jù)處理軟件）。色譜柱為 ACQUITYUPLC@BEH 的 C18 柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）。

UPLC 分析條件：柱溫 45℃，流速 0.4 mL·min-1，進(jìn)樣體積 3μL。流動相 A 液為 0.1%的甲酸溶液（V 甲酸︰V 水 = 0.1∶99.9）；B 液為含 0.1%甲酸的乙腈 （V 甲酸∶V 乙腈 = 0.1∶99.9）。梯度洗脫程序：0 min，95% A，5% B；0.5 min，95% A，5% B；2.5 min，82% A，18% B；7.5 min，65% A，35% B；11 min，35% A，65% B；12 min，0% A，100% B；13 min，0% A，100% B；13.5 min，95% A，5%B；15 min，95% A，5% B。

在特征吸收波長520 nm 處檢測總花色苷 （total anthocyanins，TA） 含量。以標(biāo)準(zhǔn)品氯化矢車菊（cyanidin chloride，Sigma）作為外標(biāo)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法對花瓣TA 進(jìn)行定量。TA 為每g 新鮮花瓣中含有的相對于cyanidin的含量[21]。

1.2.4 花色苷組分分析 采用超高效液相色譜—四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-Q-TOF-MS）對花瓣中花色苷結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。UPLC 配備同上，四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀為Bruker 公司生產(chǎn)，采用Hystar 工作站?；ㄉ丈V分析條件同上，質(zhì)譜分析條件：電噴霧電離，正離子檢測模式，掃描范圍為100 ～1500 m/z；毛細(xì)管電壓3000V，錐孔電壓 30V，提取錐電壓 4V；錐孔氣流量 60L·h-1，脫溶劑氣流量 600L·h-1，干燥氣（N2）流速 0.3mL·min-1；離子源溫度110℃，干燥溫度350℃。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)結(jié)果采用Microsoft Office Excel 2003 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、分析及作圖。數(shù)值為3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。使用SPSS 軟件對花色表型和總花色苷含量進(jìn)行相關(guān)性分析，利用EXCEL 對不同花色品種之間花色苷總含量的差異進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色描述

根據(jù)皇家比色卡（RHSCC）對花色的描述以及色差“CIELAB”分布（表1），12 個(gè)草原龍膽品系花色在CIE表色系統(tǒng)坐標(biāo)系上分布廣泛，亮度L* 的分布范圍介于33 到95 之間，紅綠屬性a*值的分布范圍介于-7 到62之間，黃藍(lán)屬性b*值的分布范圍介于-58 到61 之間，彩度C*值的分布范圍介于1 到75.45 之間，色相角h°值的分布范圍介于-83.45 到23.75 之間。

草原龍膽12 個(gè)品系可分為4 個(gè)色系區(qū)域 （圖2）分別是：白-黃色系（A），包括 White13、Yellow06 和 Yellow02；粉-紫色系（B），包括 Pink02、Pink Flash02、Misty Blue01 和 Lavender04；紅-橙色系（C），包括 Carmine03、Apricot07 和 Brown01；藍(lán)-紫色系（D），包括 Purple07 和Blue01。

2.2 花瓣色素類型

由表2 可知，石油醚測試中12 份草原龍膽花瓣提取液均為無色，表明花瓣含有很少含量或不含類胡蘿卜素；鹽酸測試中，除White13 品系外，其他品系花瓣提取液分別顯示粉色、粉紫色和藍(lán)紫色，表明花瓣含有花色素苷；而White13 和Yellow02 品系花瓣呈現(xiàn)無色和淡黃色表明這兩個(gè)品系中不含有花色素苷。氨水測試中，12 種材料花瓣呈現(xiàn)淡黃色、黃色和銹黃色，表明含有黃酮類色素。綜上，草原龍膽12 個(gè)品系花瓣均含有黃酮類色素，不含類胡蘿卜素；除White13 和Yellow02 品系外，均含花色素苷。

圖2 不同品種花色的'CIELAB' 分布Figure 2 Distribution of 'CIELAB'of different flower colors

表1 草原龍膽12 個(gè)品系的花色數(shù)據(jù)Table 1 Petal colors and color parameters of 12 cultivars of Lisianthus

2.3 草原龍膽花色苷成分分析

草原龍膽10 個(gè)含花色素苷品系的花瓣提取液經(jīng)C18 柱分離，在520nm 波長下共檢測到6 種花色苷物質(zhì)（表3）。6 個(gè)花色苷物質(zhì)的結(jié)構(gòu)由UPLC-Q-TOF-MS分析進(jìn)一步確定。

表3 草原龍膽10 個(gè)品系花瓣中花色苷的光譜及質(zhì)譜特征Table 3 Spectrum and UPLC-MS properties of anthocyanins in petals of ten cultivars of Lisianthus

花色苷組分1，3，5，6 的A440/Avis-max值均小于0.2，表明這些花色苷的糖苷分別結(jié)合在花色苷元的3 位和5位。組分 2 和 4 的 A440/Avis-max值為 0.39 和 0.38，表明糖苷結(jié)合在花色苷元 3 位。組分 1，2，4 碎片離子 m/z303[Y0]+，是飛燕草素苷元（delphinidin）的特征質(zhì)荷比，是飛燕草素花色苷衍生物，組分3 和6 含碎片離子m/z287[Y0]+，為矢車菊素（cyaindin）的特征質(zhì)荷比，表明它們?yōu)槭杠嚲账鼗ㄉ昭苌?。組分5 含碎片離子m/z271+，為天竺葵素（pelargonidin）的特征質(zhì)荷比，是天竺葵素花色苷衍生物；花色苷所連糖苷種類通過分析各花色苷組分分子離子及碎片離子類型推定成分。花色苷組分 1 含分子離子 m/z 627[M]，碎片離子 m/z 465[M-（glucose）]+、303[Y0]+，其中m/z 303[Y0]+，是飛燕草素苷元（delphinidin）的特征質(zhì)荷比，兩個(gè)糖苷結(jié)合在花色苷元的3 位和5 位，通過與相關(guān)文獻(xiàn)[22]中花色苷質(zhì)譜特征的比對，組分1 推定為飛燕草3,5-二葡萄糖苷（delphinidin3,5-di-O-glucoside）?；ㄉ战M分2 質(zhì)譜分析得到分子離子m/z 465[M-（glucose）]，碎片離子303[Y0]+，對應(yīng)飛燕草3-葡萄糖苷（delphinidin3-O-glucoside）的質(zhì)譜特征；同理，根據(jù)質(zhì)譜特征，組分3 質(zhì)譜分析獲得分子離子m/z 757[M]，碎片離子m/z 595[M-162（glucose）]+、449[M-308（coumaroylglucose）]+，推定為矢車菊素 3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷 （cyanidin3-O-coumaroylglucoside-5-O-glucoside）；組分4 質(zhì)譜分析得到分子離子m/z 529 [M-204（acetyglucoside）]+、507 [M-（glucose）]+，碎片離子 303 [Y0]+推定為飛燕草素-3-乙酰-葡萄糖苷 （delphinidin-3-O-acetyl-glucoside）；組分 5 質(zhì)譜分析獲得分子離子 m/z 783[M]，碎片離子 m/z 579[M-204（acetyglucoside）]+、475[M-308 （coumaroylglucose）]+推定為天竺葵素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-乙酰葡萄糖苷 （pelargonidin3-O-coumaroylglucoside-5-O-acetyglucoside）；和組分 6 分子離子 m/z 843[M]，碎片離子 m/z 595[M-248（malonylglucoside）]+、535[M-308（coumaroylglucose）]+，推定結(jié)果為矢車菊素 3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-丙二酰葡萄糖苷（cyanidin3-O-coumaroylglucoside-5-O-malonylglucoside）。

綜上所述，草原龍膽10 個(gè)含花色苷的品系中一共檢測到6 種花色苷物質(zhì)，它們分別為飛燕草3,5-二葡萄糖苷、飛燕草3-葡萄糖苷、矢車菊素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-乙酰-葡萄糖苷、天竺葵素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-乙酰葡萄糖苷、矢車菊素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-丙二酰葡萄糖苷。

2.4 草原龍膽的花色苷含量

2.4.1 總花色苷含量 12 個(gè)供試品系中除了白色和淡黃色的White13、Yellow02 花瓣中未含有花色素苷之外，其他10 個(gè)品系花瓣中總花色苷含量如圖3 所示。紫色品系Blue01 和Purple07 總花色素苷含量最高，高達(dá)（1873±148）μg·g-1FW、（1531±122）μg·g-1FW，次之是紅色品系 Carmine03，總花色素苷含量（953±78）μg·g-1FW，和橙-紅品系A(chǔ)pricot07 的（427±53）μg·g-1FW。其余花瓣呈淡粉色、淡紫色和棕色的品系中總花色苷含量均在300μg·g-1FW 以下。棕色品系 Brown01 花瓣顏色很深，但花色苷含量并不高，為（312±24）μg·g-1FW，是 Blue01總花色苷含量的16.66%，黃酮類物質(zhì)在花瓣中顯色會導(dǎo)致顏色加深，棕色品系Brown01 花瓣中是否由黃酮類其他物質(zhì)含量主導(dǎo)花色需要進(jìn)一步檢測分析。

圖3 草原龍膽10 個(gè)品系花瓣中總花色苷含量Figure 3 Total anthocyanin content in the petals of 10 cultivars of Lisianthus

2.4.2 花色與總花色苷含量的關(guān)系 花色與花瓣中色素的組成、理化性質(zhì)、液泡內(nèi)pH 值以及花瓣表皮細(xì)胞性狀與組織結(jié)構(gòu)等諸多因素相關(guān)，但其中最重要的是色素組成。因此，為了探討草原龍膽花瓣色素與花色的關(guān)系，以表征花色的亮度L*值、色相a*值和b*值、彩度C*和色相角h°作為因變量，色總色素苷成分的含量作為自變量，通過回歸的方法建立花色與總色素苷含量之間的回歸方程，推導(dǎo)出二者之間的數(shù)量關(guān)系。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果為：

L*=72.81-0.19x(R=0.607,p=0.063)；a*=17.35+0.22x(R=0.574,p=0.083)；b*=22.42-0.036x(R=0.614,p=0.059)；C*=28.08+0.28x(R=0.703,p=0.013)；h°=-20.76-0.13x(R=0.258,p=0.471)。

由回歸系數(shù)R 和顯著程度P 可以看出，并不是所有花色描述值都與總花色素苷含量有相關(guān)性，只有描述花色彩度的C*值與總花色苷含量具有顯著的相關(guān)性（p=0.013），呈正相關(guān)。彩度描述意義為花色色彩的濃度，濃度越大，值越大；花色素苷總量越大，花色越濃，二者呈正顯著正相關(guān)從CIELAB 系統(tǒng)證明花色苷含量對花色的直接影響關(guān)系。

2.4.3 各花色苷組分含量比例 草原龍膽花瓣花色素苷的組成及百分含量如表4。不同品系花瓣中分別含1～3種花色素苷，6 種花色素苷不會同時(shí)出現(xiàn)在一個(gè)品系的花瓣中。紫-藍(lán)紫系中花色最深的兩個(gè)品系Purple07 和Blue01 花瓣中主要呈色花色素苷是飛燕草3,5-二葡萄糖苷，同時(shí)含有少量的飛燕草3-葡萄糖苷。粉-紫色品系Misty Blue01 花瓣中飛燕草素-3-乙酰-葡萄糖苷占總花色苷的61.87%，呈淡紫色；而同樣粉-紫色品系Lavender04 花瓣中飛燕草素-3-乙酰-葡萄糖苷占總花色苷的81.07%，而另一組分飛燕草3,5-二葡萄糖苷只占18.93%。紅-橙色系中Carmine03 和Brown01 花瓣中天竺葵素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-乙酰葡萄糖苷占總花色苷的61.09%和57.92%，比重大于矢車菊素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-丙二酰葡萄糖苷，而兩個(gè)組分均為矢車菊素糖苷。粉-紫色品系A(chǔ)pricot07 花瓣中花色苷有3 種，其中天竺葵素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-乙酰葡萄糖苷占45.1%和矢車菊素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-丙二酰葡萄糖苷占32.53%，矢車菊素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷占22.37%。而粉-紫色品系Pink02 花瓣中花色苷組分主要是飛燕草素-3-乙酰-葡萄糖苷，同時(shí)含有部分天竺葵素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-乙酰葡萄糖苷。品系Yellow06是黃-白色系中唯一具有花色苷的花瓣，花色苷為天竺葵素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-乙酰葡萄糖苷。

表4 草原龍膽10 個(gè)品系各花色苷所占比例Table 4 Distribution of anthocyanin components in 10 cultivars of Lisianthus

3 討論與結(jié)論

花色素苷是花色素苷元與一個(gè)或多個(gè)糖苷等通過糖苷鍵結(jié)合而成，是花朵呈現(xiàn)紅色、橙色、粉色、紫色的主要色素來源，由于環(huán)上不同位置的羥基化和甲基化修飾，在自然界中鑒定到的花色素至少有27 類，但是其中常見的只有6 類，分別是矢車菊素（cyanidin）、芍藥素（peonidin）、天竺葵素(pelargonidin)、錦葵素(malvidin)、飛燕草素(delphinidin)和矮牽牛素(petunidin)[2，22]。天竺葵素通常呈現(xiàn)橙紅至紅色，矢車菊素則通常呈現(xiàn)粉色，飛燕草素通常呈現(xiàn)藍(lán)色至藍(lán)紫色[1]。本研究鑒定到藍(lán)、藍(lán)紫色系Purple07 和Blue01 花瓣主要呈色花色素苷為兩種飛燕草素衍生物；粉色系Pink02 和Pink Flash02 花瓣中呈色花色素苷為矢車菊素衍生物；兩個(gè)淡粉紫品系Misty Blue01 和Lavender04 花瓣呈色花色素苷為三種飛燕草素衍生物；黃色品系Yellow06 花瓣呈色花色素苷為天竺葵衍生物。這些結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[3-7，23]。Yellow06 花瓣花色素苷總含量不高，但花色彩度很高，是否由于含有類黃酮類其他物質(zhì)積累顯色而成的，需要進(jìn)一步對類黃酮類物質(zhì)進(jìn)行測定分析研究。

白新祥等在菊花中發(fā)現(xiàn)白色系僅由黃酮和黃酮醇組成；紅色系和紫色系的色素是花色素苷、黃酮、黃酮醇等[3]；橙色系色素比較復(fù)雜，除了含有類胡蘿卜素外，還含有黃酮和花色素苷。本研究結(jié)果與之符合，白色系中兩個(gè)品系White13 和Yellow02 只含有黃酮類物質(zhì)不含花色素苷，在其他10 個(gè)草原龍膽品系花瓣中鑒定到6種花色素苷成分，藍(lán)紫色品系中含有飛燕草3,5-二葡萄糖苷、飛燕草3-葡萄糖苷和飛燕草素-3-乙酰-葡萄糖苷；黃色品系中鑒定到天竺葵素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-乙酰葡萄糖苷；粉色品系中含有矢車菊素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷和矢車菊素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-丙二酰葡萄糖苷。本實(shí)驗(yàn)中藍(lán)紫色系兩個(gè)品系Purple07 和Blue01 主要含有花色苷成分是飛燕草3,5-二葡萄糖苷，其次為飛燕草3-葡萄糖苷，而淡紫色系中含有飛燕草素-3-乙酰-葡萄糖苷，這些花色素苷均為飛燕草衍生物。

花朵的顏色被不少研究證實(shí)與花色苷種類及花色素苷含量密切相關(guān)。在本研究中，花色最深的兩個(gè)品種Purple07 和Blue01 花瓣花色素苷總含量最高，其他品種花瓣中總花色素苷含量則相對較低，花色則相應(yīng)較淺。同一色系的不同品種，花色素苷組分存在差異。如粉、粉紫色系4 個(gè)品種中Pink Flash02 含3 個(gè)組分，而Pink02、Misty Blue01 和Lavender04 則含2 個(gè)組分，且組分種類和相對含量均存在差異。同樣，紅-橙色系中Carmine03和Brown01 花色相近，含相同組分花色素苷，但含量不同；而Apricot07 含多一種組分，但其花瓣顏色反而淺，花色素苷組分差異從而產(chǎn)生花色的差異顯著?；ò曛泻懈罅康钠渌慄S酮類色素會影響花色素苷對花瓣著色的表型影響[24]，同時(shí)，花瓣細(xì)胞形狀、液泡內(nèi)酸堿度、細(xì)胞內(nèi)金屬離子種類和濃度、甚至是外部環(huán)境因子等因素也將對花色產(chǎn)生影響[25]。因此，后續(xù)將進(jìn)一步圍繞草原龍膽花色素苷穩(wěn)定性分析以及黃酮類色素組分的分離展開研究。

綜上所述，本研究分析了12 個(gè)草原龍膽品系花瓣花色類型，并從中檢測出6 種花色素苷物質(zhì)，通過比較不同色系花色素苷組成和含量以及花色之間的差異，深入探討了花色差異的形成機(jī)制，為后續(xù)開展草原龍膽花色分子調(diào)控機(jī)理研究以及新花色品種培育提供依據(jù)。