山楂中木質(zhì)素合成調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子MYB46的克隆及功能鑒定

陳可欽，雷瑩瑩，郭運(yùn)娜，宋夢(mèng)如，劉麗馥，代紅艷

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，沈陽110161）

植物次生壁主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成[1]。在志留紀(jì)時(shí)期，維管束植物首次出現(xiàn)在陸地上，這些維管束植物中的次生壁幫助它們建立起堅(jiān)固的機(jī)械組織來支撐和運(yùn)輸水，并適應(yīng)干旱的土地和惡劣的環(huán)境[2]。

在擬南芥中，多個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子作為植物中次生壁生物合成基因的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[3-7]。轉(zhuǎn)錄因子MYB46是控制擬南芥中整個(gè)次生壁生物合成的主要和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄開關(guān)[8-9]。在擬南芥和水稻中，MYB46 啟動(dòng)子的SNBE基序是NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族成員SND1 的直接靶標(biāo)[7,10]。AtMYB46 在花序莖的纖維和導(dǎo)管中高水平表達(dá)，從而產(chǎn)生含有次生壁的束間纖維和木質(zhì)部細(xì)胞。擬南芥中MYB46 的過表達(dá)導(dǎo)致次生壁在許多表皮和葉肉細(xì)胞中異位沉積，從而表現(xiàn)出生長(zhǎng)矮小，葉片嚴(yán)重向上卷曲的表型[8]。已有證據(jù)表明，MYB46 轉(zhuǎn)錄因子不僅與次生壁的所有3 個(gè)主要成分（纖維素、半纖維素和木質(zhì)素）的生物合成基因的啟動(dòng)子直接結(jié)合，而且還與轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子結(jié)合[11]。另外，MYB46 及其緊密同源物MYB83 在調(diào)節(jié)次生壁的形成上具有功能冗余。在擬南芥中，MYB83 的過表達(dá)導(dǎo)致與MYB46 過表達(dá)相同的表型。與單一的myb46 或myb83 功能缺失的突變體相比，myb46/myb83 雙重突變體顯示出“幼苗致死”表型，并且在導(dǎo)管和纖維中均缺乏次生壁形成[12]。研究者對(duì)MYB46 轉(zhuǎn)錄因子的直接靶標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析[9,13]，鑒定出順式作用元件（M46RE），它是由8 個(gè)核苷酸（[A/G][G/T]T [A/T]GGT [A/G]）組成的基序。M46RE 對(duì)于MYB46 介導(dǎo)的靶基因的轉(zhuǎn)錄激活是必要且充分的，已在3 個(gè)纖維素合酶基因（CESA4，CESA7 和 CESA8）、4 個(gè)木聚糖生物合成基因（IRX8，IRX9，IRX14 和 IRX15-L）[11]和 9 個(gè)木質(zhì)素生物合成基因（AtPAL，AtC4H，At4CL1，AtHCT，AtC3H1，AtCCoAOMT1，AtCCR1，AtF5H 和 AtCAD6）的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了M46RE 基序，所有這些基因均被MYB46 上調(diào)[8,13,14]。MYB46 識(shí)別的啟動(dòng)子中的另一個(gè)順式作用元件為SMRE（次級(jí)壁 MYB 響應(yīng)元件，ACC [A/T]A [A/C][T/C]）[7]。MYB58 和 MYB63 啟動(dòng)子中含有 SMRE 基序，是MYB46/MYB83 的靶基因，并被證明是擬南芥次生壁形成過程中木質(zhì)素生物合成特異的轉(zhuǎn)錄激活因子[6,15-16]。

近年來，果樹中MYB 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控木質(zhì)素合成的研究也已經(jīng)有所報(bào)道。枇杷（Eriobotrya japonica）EjMYB1是果實(shí)木質(zhì)化的正調(diào)控因子，程序降溫和熱激處理均可負(fù)調(diào)控EjMYB1 表達(dá)而減緩木質(zhì)化進(jìn)程[17]。扁桃（Amygdalus communis）內(nèi)果皮厚度與木質(zhì)素含量均呈極顯著正相關(guān)，朱秋萍等[18]推測(cè)MYB46 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控扁桃內(nèi)果皮木質(zhì)素的代謝，且熒光定量PCR 數(shù)據(jù)證明較厚殼需要更高M(jìn)YB46 基因表達(dá)且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。蘋果中MdMYB46 既可以促進(jìn)木質(zhì)素的積累還可以直接調(diào)控非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)蘋果的抗鹽和滲透脅迫的能力[19]。

盡管擬南芥中次生壁生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵參與因子鑒定方面取得了進(jìn)展，但果樹的次生壁合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究尚不深入?；谲浐撕陀埠松介贩N的果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們獲得了MYB46 轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，并推測(cè)該基因可能與山楂內(nèi)果皮木質(zhì)素的合成有關(guān)[20]。本研究旨在鑒定山楂MYB46 功能，并初步揭示其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

山楂（Crataegus pinnatifida）種質(zhì)資源垂枝山里紅田間保存于國(guó)家果樹種質(zhì)沈陽山楂圃。本實(shí)驗(yàn)室篩選的蘋果（Malus domestica）基因型 GL-3[21]用于蘋果遺傳轉(zhuǎn)化。本氏煙（Nicotiana benthamiana）和擬南芥（Arabidopsis thaliana, Col-0）均保存在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取 取垂枝山里紅的葉片，在液氮中冷凍后進(jìn)行RNA 提取。使用改良的CTAB 法從植物材料中提取總 RNA[22]，用 DNase I（TaKaRa）處理 RNA 溶液 4 h。RNA 樣品的完整性通過 Agilent 2100 生物分析儀（Agilent Technologies）進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 CpMYB46 的分離和序列分析 用PrimeScriptTM第一鏈cDNA 合成試劑盒（TaKaRa）合成第一鏈cDNA。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組裝重疊群序列，設(shè)計(jì)特異性引物以獲得山楂MYB46 的全長(zhǎng)。PCR 循環(huán)程序?yàn)椋?4℃初始變性 5min；94°C 30 s，58°C 30 s 和 72°C 1min，38 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 延伸 10min。將該 cDNA 產(chǎn)物連接到 pMD18-T 載體并測(cè)序。通過搜索保守域數(shù)據(jù)庫（CDD）找到保守的R2R3-MYB 域（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd / cdd.shtml）。使用BLASTP 程序從其他物種獲得相似的序列。使用MEGA6 軟件進(jìn)行多個(gè)序列比對(duì)。

1.2.3 過表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化 為了在植物中過表達(dá)CpMYB46 基因，將CpMYB46 編碼區(qū)插入植物表達(dá)載體pRI101-AN 中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pRI101-CpMYB46。使用凍融轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pRI101-CpMYB46 分別引入根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101 和EHA105 中[23]。

對(duì)擬南芥種子進(jìn)行表面滅菌，然后在含有0.7%（w/v）瓊脂和3%（w/v）蔗糖的1/2MS 培養(yǎng)基上發(fā)芽。使種子在1/2 MS 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10d，然后轉(zhuǎn)移到含基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件為23℃、8h 光照/16h黑暗光周期。將生長(zhǎng)30d 抽薹開花的擬南芥植株用于轉(zhuǎn)化。將擬南芥花序浸入含有10%蔗糖和0.02%Silwet 的1/2MS 液體培養(yǎng)基懸浮的根癌農(nóng)桿菌[GV3101（pRI101-CpMYB46）]菌液中，然后將擬南芥避光在23°C 的生長(zhǎng)室中放置1d，最后移入光照培養(yǎng)箱中正常生長(zhǎng)。每隔4d 左右侵染1 次，大約3 次以后收集種子，在含有30 mg·L-1卡那霉素的1/2MS 培養(yǎng)基中篩選陽性苗，并通過PCR 鑒定轉(zhuǎn)基因幼苗。

煙草的轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法[24]，農(nóng)桿菌菌株為EHA105（pRI101-CpMYB46）。通過PCR 和qRTPCR 對(duì)卡那霉素（30mg·L-1）篩選的抗性植株進(jìn)一步鑒定。

蘋果基因型GL-3 的轉(zhuǎn)化以葉片為外植體，農(nóng)桿菌菌株為EHA105（pRI101-CpMYB46），方法詳見文獻(xiàn)[21]。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄激活分析 將CpMYB46 的全長(zhǎng)編碼區(qū)，N 端和C 端區(qū)域分別與pGBKT7 載體中的GAL4 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域框內(nèi)融合。將重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y2H GOLD 中，使所得轉(zhuǎn)化體在缺乏色氨酸的合成缺失（SD）培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并且還點(diǎn)樣在缺乏色氨酸、組氨酸和腺嘌呤的SD 培養(yǎng)基上進(jìn)行X-alpha-gal 測(cè)定。

1.2.5 EMSA 檢測(cè) 將編碼NAC 轉(zhuǎn)錄因子的山楂CpSND1 基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)與GST 標(biāo)記的載體pGEX-5x-1進(jìn)行融合，并在濃度為1 mmol·L-1IPTG 誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21 中表達(dá)蛋白。使用PierceTMGST 試劑盒（Thermo Scientific）純化GST-SND1 融合蛋白，然后用于EMSA 分析。CpMYB46 啟動(dòng)子中的SNBE 位點(diǎn)在3'端被生物素標(biāo)記。將純化的蛋白質(zhì)GST-SND1 與生物素標(biāo)記的SNBE 位點(diǎn)或200X 未標(biāo)記的雙鏈核苷酸（在競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中）在LightShiftTM化學(xué)發(fā)光EMSA 試劑盒（Thermo Scientific）中的結(jié)合緩沖液中孵育。

2 結(jié)果與分析

2.1 CpMYB46 基因的克隆及序列分析

前期研究表明，一些R2R3 MYB 家族成員在硬核山楂中的表達(dá)水平高于軟核山楂[20]，其中8_Unigene_BMK.9503 被注釋為MYB46 基因。為了研究山楂軟硬內(nèi)果皮形成的分子機(jī)制，基于轉(zhuǎn)錄組拼接序列設(shè)計(jì)引物，本研究從山楂 cDNA 中擴(kuò)增得到了 8_Unigene_BMK.9503 基因，該基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為1044 bp，編碼347 個(gè)氨基酸。多個(gè)氨基酸序列比對(duì)顯示，該基因產(chǎn)物包含兩個(gè)富含色氨酸的重復(fù)序列（R2 和R3），并且與AtMYB46 的R2R3 結(jié)構(gòu)域具有高度相似性，因此將該基因命名為 CpMYB46。利用 MEGA6 軟件繪制了 Cp-MYB46 與 126 個(gè)擬南芥MYB 成員的系統(tǒng)發(fā)育樹 （圖1A），也發(fā)現(xiàn) CpMYB46 與 AtMYB46 具有更高的同源性，但是 CpMYB46 與AtMYB46 在C 端激活結(jié)構(gòu)域有很大差異。氨基酸序列比對(duì)還顯示，CpMYB46 和蘋果MdMYB46 之間的序列一致性達(dá)到98.27%，在C 端激活域中只有6 個(gè)氨基酸不同（圖1B）。

2.2 CpMYB46 蛋白的轉(zhuǎn)錄活性分析

為了檢測(cè)CpMYB46 是否具有與AtMYB46 一樣的轉(zhuǎn)錄激活活性，本研究進(jìn)行了酵母雙雜交分析。檢測(cè)了山楂MYB46 全長(zhǎng)，缺失C 端轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域和缺失N 端DNA 結(jié)合區(qū)域在酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性（圖2A），結(jié)果表明CpMYB46 的全長(zhǎng)和C 端能夠激活酵母細(xì)胞中LacZ 基因的表達(dá)（圖2B），表明它是轉(zhuǎn)錄激活因子。

圖1 CpMYB46 序列分析Figure 1 Analysis of CpMYB46

圖2 酵母細(xì)胞中CpMYB46 的轉(zhuǎn)錄活性分析Figure 2 Transcriptional activity analysis of CpMYB46 in yeast cells

2.3 異位表達(dá)CpMYB46 誘導(dǎo)次生壁沉積

為了研究CpMYB46 在次級(jí)細(xì)胞壁形成中是否具有與AtMYB46 相似的功能，將CpMYB46 基因的全長(zhǎng)編碼序列插入植物過表達(dá)載體pRI101-AN 中，然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將CpMYB46 基因轉(zhuǎn)入到擬南芥中。20 株轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中有13 株表現(xiàn)出與AtMYB46 過表達(dá)相同的表型，例如生長(zhǎng)矮小，葉片向上卷曲，萼片發(fā)育不良和不育（圖3A、B 和C）。為了進(jìn)一步確認(rèn)CpMYB46的功能，將CpMYB46 基因轉(zhuǎn)入進(jìn)煙草中。與轉(zhuǎn)pRI101-AN 空載體煙草植株相比，異位表達(dá)CpMYB46 的煙草植株矮小，并且葉片向上卷曲（圖3D）。山楂與蘋果具有非常近的親緣關(guān)系，而CpMYB46 的氨基酸序列與Md-MYB46 具有高度一致性（圖1B）。由于山楂的轉(zhuǎn)化非常困難，為了進(jìn)一步研究CpMYB46 在次生壁生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用，本研究在GL-3 蘋果中異位表達(dá)了CpMYB46 基因。但是異位表達(dá)CpMYB46 基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株之間的形態(tài)上沒有明顯差異（圖3E）。

為進(jìn)一步研究CpMYB46 對(duì)擬南芥次生細(xì)胞壁形成的影響，利用定量PCR 技術(shù)對(duì)擬南芥纖維素合成基因（AtCESA4、AtCESA7 和 AtCESA8）、半纖維素合成基因（AtFRA、AtIRX8 和 AtIRX9）、木質(zhì)素合成基因（At4CL和AtCCoAoMT1）的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明在異位表達(dá)CpMYB46 基因的擬南芥中它們的表達(dá)量顯著上調(diào)（圖4）。

CpMYB46 的異位表達(dá)導(dǎo)致木質(zhì)素在擬南芥和煙草葉片中沉積并限制了轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步確定山楂CpMYB46 在木質(zhì)素合成過程中的功能，利用石蠟切片技術(shù)觀察了異位表達(dá)CpMYB46 的擬南芥、煙草和蘋果植株莖的橫切面。分別取光照培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)1 個(gè)月的擬南芥莖部（根部靠上1 cm 處），組培瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)1個(gè)月的煙草和蘋果莖部 （貼近培養(yǎng)基向上1 cm 處），經(jīng)過常規(guī)石蠟切片制作和番紅固綠染色，在顯微鏡下觀察。發(fā)現(xiàn)異位表達(dá)CpMYB46 的轉(zhuǎn)基因擬南芥、煙草和蘋果植株次生壁厚度都明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株（圖5A～C）。

圖3 CpMYB46 在擬南芥、煙草和蘋果植株中異位表達(dá)的表型Figure 3 Phenotypes of CpMYB46 ectopic expression in Arabidopsis, tobacco and apple plants

2.4 CpSND1 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)CpMYB46 啟動(dòng)子的綁定

MYB46 屬于 SND1 直接靶標(biāo)[25]。為了研究山楂中CpSND1 是否對(duì)MYB46 的啟動(dòng)子具有直接綁定功能，本研究根據(jù)染色體步移法從山楂總DNA 中擴(kuò)增得到了1355bp 的啟動(dòng)子序列。通過分析發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子中含有SND1 特異識(shí)別的SNBE 綁定位點(diǎn)。于是將CpSND1 的CDS 序列插入原核表達(dá)載體pGEX-5X-1 中，與GST 標(biāo)簽構(gòu)成融合蛋白，經(jīng)過大腸桿菌誘導(dǎo)出GST-CpSND1的體外蛋白（圖6A 紅色箭頭所指），經(jīng)過純化后與生物素標(biāo)記的SNBE 位點(diǎn)序列共同孵育，pGEX-5X-1 空載體誘導(dǎo)的蛋白作為陰性對(duì)照，未經(jīng)過生物素標(biāo)記的200 倍的SNBE 位點(diǎn)序列作為競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與擬南芥中調(diào)控模式相同，CpSND1 可以直接綁定CpMYB46 的啟動(dòng)子（圖6B）。

圖4 異位表達(dá)CpMYB46 基因的擬南芥中次生壁合成基因的表達(dá)水平Figure 4 The expression level of secondary cell wall biosynthesis genes in CpMYB46 ectopically expressed Arabidopsis

圖5 異位表達(dá)CpMYB46 的擬南芥、煙草及蘋果植株莖部橫切面觀察Figure 5 Observation of the cross section of stems from Arabidopsis, tobacco and apple plants ectopically expressed CpMYB46

圖6 CpSND1 蛋白誘導(dǎo)（A）及凝膠遷移率（B）Figure 6 CpSND1 protein induction（A） and electrophoretic mobility shift（B）

3 討論與結(jié)論

作為調(diào)節(jié)次生細(xì)胞壁生物合成的關(guān)鍵開關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，MYB46 與MYB83 具有功能冗余。MYB46 和MYB83的表達(dá)直接受到擬南芥中SND1、NST1/2 和VND6/7 的調(diào)控[8,12]。雙突變體myb46/myb83 在次級(jí)細(xì)胞壁的合成中出現(xiàn)更嚴(yán)重的缺陷。過表達(dá)MYB46 或過表達(dá)MYB83 可以激活擬南芥中次生細(xì)胞壁成分如木質(zhì)素、纖維素和木聚糖的生物合成基因，并顯示出嚴(yán)重卷曲的葉片[8-9,12]。在楊樹中，MYB46/MYB83 直系同源物PtrMYB3、PtrMYB20、PtrMYB2 和PtrMYB21 的過表達(dá)導(dǎo)致次生壁的異位沉積，次生壁增厚[26]。擬南芥中異位表達(dá)Zm-MYB46 和OsMYB46 誘導(dǎo)木質(zhì)素和木聚糖的沉積，并增加表皮細(xì)胞壁中纖維素的積累[27]。當(dāng)樺樹的MYB46 基因在樺樹中過表達(dá)時(shí)，它可以誘導(dǎo)次級(jí)細(xì)胞壁的合成，也可以增強(qiáng)對(duì)非生物脅迫的抗性[28]。本研究表明，異位表達(dá)山楂CpMYB46 基因可以促進(jìn)擬南芥、煙草和蘋果中次生細(xì)胞壁的生物合成并誘導(dǎo)次生壁的異位沉積（圖3和圖5）。

在樺樹中過表達(dá)或抑制BplMYB46 基因，樺樹生長(zhǎng)表型沒有任何差異，例如生長(zhǎng)限制和卷曲的葉子，這表明BplMYB46 不會(huì)影響樺木的生長(zhǎng)或生長(zhǎng)速率[28]。在本研究中，異位表達(dá)CpMYB46 的轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草嚴(yán)重矮化且葉片卷曲，但是異位表達(dá)CpMYB46 的轉(zhuǎn)基因蘋果植株的生長(zhǎng)沒有受到限制，且沒有向上卷曲的葉片（圖3E）。然而，在轉(zhuǎn)基因蘋果中次生壁在一些韌皮部細(xì)胞和幾乎所有木質(zhì)部細(xì)胞中都增厚（圖5C），這說明MYB46 雖然沒有引起木本植物的生長(zhǎng)缺陷但是在次生壁合成過程中仍有重要的調(diào)控作用。在多年生木本植物的莖中，細(xì)胞壁木質(zhì)化程度最高，它們需要更多的木質(zhì)素以使其直立生長(zhǎng)，但是在一年生草本植物中，莖中過多的木質(zhì)素可能會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)受限。木本植物和草本植物的表型不同，可能是由于木質(zhì)素的需求量不同。

MYB46 啟動(dòng)子中含有SND1 可以識(shí)別綁定的SNBE 位點(diǎn)（[T/A]NN[C/T][T/C/G]TNNNNNNNA[A/C]GN [A/C/T][A/T]），能被SND1 直接綁定從而調(diào)控其表達(dá)[29]。本研究在山楂cDNA 中擴(kuò)增得到了CpMYB46 的啟動(dòng)子序列，并通過分析發(fā)現(xiàn)在其-347bp 處有1 個(gè)SNBE 基序，通過EMSA 實(shí)驗(yàn)證明發(fā)現(xiàn)，CpSND1 可以直接綁定Cp-MYB46 的啟動(dòng)子，這說明在植物次生壁合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，SND1-MYB46 的調(diào)控功能是相對(duì)保守的。

本研究表明山楂CpMYB46 的功能與AtMYB46 的功能相似，能被上游轉(zhuǎn)錄因子SND1 直接綁定調(diào)控，并且在次生壁沉積過程中起重要作用。