HPLC法同時(shí)測定食用植物酵素中12種有機(jī)酸

王珍珍,沙如意,*,王高堅(jiān),徐成龍,戴 靜,葛 青,毛建衛(wèi),2,*,朱姣琳

(1.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江杭州 310023;2.浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江紹興 312000;3.富元生命科技(寧波)有限公司,浙江寧波 315194)

食用植物酵素(Edible plant source Jiaosu)[1]是以一種或多種新鮮蔬菜、水果和谷豆類、海藻類、食藥兩用本草類、菌菇類等食材為原料,加(或不加)糖類物質(zhì),經(jīng)多種有益菌通過較長時(shí)間發(fā)酵而生產(chǎn)的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品,擁有豐富的代謝產(chǎn)物、植物本身營養(yǎng)成分和益生菌等,特別是富含小分子功能成分,研究表明該類產(chǎn)品具有抗衰老、抗菌消炎、凈化血液、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力及解毒抗癌等多種保健功能[2-5]。

有機(jī)酸可影響食用植物酵素的口感、穩(wěn)定性、pH等,具有抗菌活性、控制血糖水平和調(diào)節(jié)血脂異常[6-7],軟化血管、助于消化吸收、改善食欲等功能,發(fā)酵過程中適當(dāng)?shù)乃岫炔粌H能起到抑菌的作用,還能增強(qiáng)VC、花青素、花色苷等活性成分的穩(wěn)定性[8],而且通過改變pH調(diào)控微生物的代謝,可使有機(jī)酸代謝成為酚類物質(zhì)或風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)[9]。食用植物酵素中有機(jī)酸的組成除了受原料的影響,還與菌種、代謝等因素有關(guān),有機(jī)酸的種類及含量會(huì)直接影響食用植物酵素產(chǎn)品的口感、風(fēng)味和品質(zhì)。用于定量評(píng)價(jià)發(fā)酵產(chǎn)品如發(fā)酵果蔬汁、酒類、醋類等中的有機(jī)酸含量主要方法有:液相色譜法、氣相色譜法和毛細(xì)管電泳法等,其中液相色譜(HPLC)操作簡便、精密度高,因而成為最廣泛的鑒定發(fā)酵產(chǎn)品中有機(jī)酸的方法[10-11]。

本文采用HPLC法建立同時(shí)檢測食用植物酵素中12種有機(jī)酸含量的方法,以此檢測了5種食用植物酵素中有機(jī)酸的含量,并以12種有機(jī)酸含量為變量進(jìn)行主成分分析和分層聚類熱圖分析,實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同原料植物酵素中有機(jī)酸代謝產(chǎn)物的區(qū)分,以期為食用植物酵素發(fā)酵過程監(jiān)測及品質(zhì)控制提供方法學(xué)指導(dǎo),同時(shí)為不同原料植物酵素發(fā)酵過程中有機(jī)酸代謝產(chǎn)物差異監(jiān)測提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青梅酵素、沙棘酵素、火龍果酵素 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;博伊森莓酵素(由博伊森莓、菠蘿、橙子發(fā)酵制備)、黃金酵素(由菠蘿、橘子、葡萄發(fā)酵制備) 富元生命科技(寧波)有限公司;草酸、富馬酸(98%)、馬來酸(99.7%)、蘋果酸(98%)、檸檬酸(均為標(biāo)準(zhǔn)品) 中國藥品生物制品檢定所;酒石酸(色譜純) Sigma公司;抗壞血酸、莽草酸、沒食子酸、乙酸、乳酸、磷酸二氫鉀(色譜純) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇(色譜純) 美國天地有限公司;磷酸(色譜純) 上海長哲生物科技有限公司。

Allegra X-12R型冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司;Waters e2695高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 配制0.01 mol/L KH2PO4溶液,用磷酸調(diào)pH至2.7,用于稀釋樣品和配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。取適量樣品,10000 r/min高速離心10 min,取上清液,適當(dāng)稀釋后過0.22 μm的微孔濾膜,用于有機(jī)酸分析。

1.2.2 有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精確稱取各有機(jī)酸,配制草酸、酒石酸、蘋果酸、莽草酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、馬來酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸、沒食子酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,其濃度分別為0.095、1.000、1.000、0.009、0.100、1.00、1.069、0.0096、1.000、0.0108、1.000、0.0098 mg/mL,分別將其不稀釋,稀釋20倍、10倍、5倍、4倍,得到不同溶度的標(biāo)準(zhǔn)混合液,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 HPLC分離條件優(yōu)化 色譜柱:AtlantisRR T3色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:A:甲醇,B:KH2PO4,用磷酸調(diào)pH至2.7;流速:1 mL/min,等度洗脫,檢測器:光電二極管陣列檢測器,進(jìn)樣量:10 μL。通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的波長掃描,確定檢測波長,3D分辨率設(shè)置為1.2 nm;通過改變緩沖鹽濃度(以0.01、0.02、0.04 mol/L KH2PO4等不同濃度的緩沖溶液為水相,流動(dòng)相A∶B=2∶98,柱溫20 ℃),流動(dòng)相比例(以0.01 mol/L KH2PO4緩沖溶液為水相,流動(dòng)相分別為A∶B=1∶99、2∶98、3∶97、4∶96,柱溫20 ℃),柱溫(以0.01 mol/L KH2PO4緩沖溶液為水相,流動(dòng)相A∶B=2∶98,柱溫分別為20、25和30 ℃),優(yōu)化HPLC分離條件。

1.2.4 方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn) 通過線性關(guān)系、檢出限、加標(biāo)回收率、精密度等考察方法的可行性。

1.2.5 主成分分析和分層聚類熱圖分析 通過主成分分析的思想,對(duì)多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理,以實(shí)現(xiàn)利用較少的變量表達(dá)原來多重復(fù)雜變量信息的目的。以12種有機(jī)酸為變量,5種食用植物酵素樣品作為研究對(duì)象,基于R軟件(R x64 3.6.2)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析和分層聚類熱圖分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.6軟件和Waters e2695自帶的Empower 3軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC分離條件優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的確定 用光電二極管陣列檢測器,檢測器在190～400 nm范圍內(nèi)分別對(duì)12種有機(jī)酸進(jìn)行波長掃描。結(jié)果表明,各有機(jī)酸的最大吸收波長分別為:莽草酸:212.4 nm;乙酸:201.8 nm;馬來酸:210.0 nm;富馬酸:208.9 nm;沒食子酸:214.7 nm;草酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸均在210 nm附近有較大吸收。綜上,選擇210 nm作為有機(jī)酸的檢測波長。

2.1.2 緩沖鹽濃度的選擇 有機(jī)酸為弱酸,在水溶液中存在著解離平衡,向流動(dòng)相中加入磷酸鹽,提高H+濃度,有利于有機(jī)酸保持分子態(tài),增加其在色譜柱上的保留時(shí)間[12]。各條件下分離效果見圖1。從圖1中可以看出,各有機(jī)酸均能有效分離,分離度較好,峰型較好,KH2PO4緩沖溶液濃度的改變對(duì)各有機(jī)酸的分離效果影響不大,考慮到高鹽度對(duì)泵和色譜柱的影響,采用0.01 mol/L KH2PO4作為流動(dòng)相緩沖液,這與Scherer等的研究結(jié)果一致[13]。

圖1 流動(dòng)相中不同濃度KH2PO4緩沖液條件下有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.1.3 流動(dòng)相中甲醇比例的選擇 增加流動(dòng)相中甲醇的比例,有機(jī)酸疏水基與固定相的相互作用減弱,保留時(shí)間縮短,能有效改善峰形[14]。流動(dòng)相中甲醇的比例對(duì)有機(jī)酸分離效果的影響見圖2,由圖2可知:隨著流動(dòng)相中甲醇含量的增加,分析時(shí)間縮短。當(dāng)流動(dòng)相中甲醇含量為1%時(shí),抗壞血酸與乳酸有部分色譜峰重疊;甲醇含量為2%,各有機(jī)酸可有效分離;甲醇含量為3%時(shí),莽草酸與抗壞血酸色譜峰有小部分重疊;當(dāng)甲醇含量為4%時(shí),蘋果酸、莽草酸與抗壞血酸的色譜峰有部分重疊,富馬酸和琥珀酸的色譜峰重疊,不能分離。綜上所述,確定流動(dòng)相中甲醇的比例為2%。

圖2 流動(dòng)相中不同濃度甲醇條件下混合有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.1.4 柱溫的選擇 溫度升高,可降低傳質(zhì)阻力,縮短分離時(shí)間。不同柱溫下,有機(jī)酸的分離效果見圖3。由圖3可知:25 ℃時(shí),莽草酸與抗壞血酸的分離度降低,馬來酸與檸檬酸的分離度降低;30 ℃時(shí),莽草酸與抗壞血酸色譜峰部分重疊,馬來酸與檸檬酸色譜峰重疊,不能有效分離,20 ℃條件下,各種有機(jī)酸分離度及峰形較好。故選擇較優(yōu)的色譜柱溫度為20 ℃。

圖3 不同柱溫條件下混合有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定HPLC分離有機(jī)酸的較優(yōu)條件為:檢測波長210 nm,流動(dòng)相甲醇:KH2PO4(0.01 mol/L,pH2.7)=2∶98 (V/V),柱溫:20 ℃。

2.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

分別吸取不同濃度的12種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,在上述優(yōu)化后的HPLC分離條件下采集數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。以12種標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸的峰面積(y)對(duì)各自的濃度(x)進(jìn)行線性回歸分析,所得各種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍如表1所示,決定系數(shù)為0.9994～0.9999,表明各有機(jī)酸含量與其濃度之間線性關(guān)系良好。根據(jù)信噪比確定檢出限(RSN=3),從表1可以看出,12種有機(jī)酸的檢出限在0.05～12.47 μg/mL范圍內(nèi)。

表1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

2.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取青梅酵素發(fā)酵液2份,一份中加入有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品,平行測定3次,計(jì)算相應(yīng)的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2,各有機(jī)酸的加標(biāo)回收率在87.28%～109.78%之間,回收率較好,而且各種有機(jī)酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD的范圍在0.11%～4.19%之間,說明本方法具有較好的靈敏度和重復(fù)性。

表2 樣品加標(biāo)回收率

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,測定各組分的含量,計(jì)算精密度,結(jié)果見表3,該方法的精密度RSD(%)在0.49%～1.49%之間。

表3 方法的精密度

2.5 5種食用植物酵素中有機(jī)酸含量測定

采用上述優(yōu)化后的液相色譜條件,對(duì)不同原料制備的青梅酵素、沙棘酵素、火龍果酵素、博伊森莓酵素和黃金酵素5種食用植物酵素中有機(jī)酸的種類及含量進(jìn)行檢測,所得色譜圖峰型均較好,分離度均較高,有機(jī)酸測定結(jié)果見表4。

表4 5種食用植物酵素中有機(jī)酸含量測定結(jié)果

食用植物酵素中的有機(jī)酸除了源于原料本身外,還可以通過微生物的代謝途徑產(chǎn)生。從表4中可以看出,5種食用植物酵素中均檢測到酒石酸、乙酸和檸檬酸。青梅酵素中檢測到10種有機(jī)酸,其中蘋果酸、檸檬酸的含量較高,乙酸次之;研究表明:青梅原料中含有草酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、馬來酸和琥珀酸,其中檸檬酸的含量最高,其次是蘋果酸,馬來酸的含量極低[15-16];本研究在青梅酵素中也檢測到草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸及琥珀酸,除此之外還檢測到了少量的莽草酸和富馬酸。莽草酸作為芳香氨基酸等的前體,在經(jīng)莽草酸途徑合成的同時(shí),也會(huì)進(jìn)入其他代謝途徑;富馬酸是微生物進(jìn)行三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物,生成的同時(shí)也會(huì)通過其它途徑進(jìn)行分解代謝,因此在青梅酵素中莽草酸和富馬酸的含量較低。本研究從青梅酵素中未檢測到馬來酸,可能是因?yàn)轳R來酸在青梅酵素發(fā)酵的微生物代謝過程中不容易積累。

沙棘酵素中檢測到11種有機(jī)酸,其中蘋果酸的含量最高,其次是酒石酸、乙酸和抗壞血酸,草酸和檸檬酸的含量較低。研究表明:沙棘原料中含有草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、抗壞血酸和乳酸,其中蘋果酸含量最高[17-18]。本研究在沙棘酵素中還檢測到莽草酸、乙酸、馬來酸、富馬酸和沒食子酸,未檢測到乳酸。沙棘酵素中檢測到?jīng)]食子酸的含量為0.003 mg/mL,孫燕[18]采用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法從沙棘葉和莖中檢測到?jīng)]食子酸,但是在沙棘果中沒有檢測到?jīng)]食子酸;沙棘酵素中的沒食子酸可能是由莽草酸途徑生成的3-脫氫莽草酸,在莽草酸脫氫酶或脫氫莽草酸脫氫酶作用下生成[19]。

火龍果酵素中檢測到9種有機(jī)酸,其中乳酸含量最高,其次是乙酸。蔣儂輝等[20]從火龍果原料中檢測到草酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、抗壞血酸8種有機(jī)酸,其中蘋果酸的含量最高,其次是檸檬酸。本研究從火龍果酵素中除檢測到上述7種有機(jī)酸(無抗壞血酸)外,還檢測到莽草酸和富馬酸。

博伊森莓酵素由博伊森莓、菠蘿和橙子3種水果發(fā)酵而成,本研究從博伊森莓酵素中檢測到10種有機(jī)酸:草酸、酒石酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸和沒食子酸,其中檸檬酸的含量最高,其次是琥珀酸,蘋果酸、乙酸、乳酸次之。研究表明:3種水果原料中含有檸檬酸、琥珀酸、馬來酸、蘋果酸、酒石酸、抗壞血酸、乳酸、草酸8種有機(jī)酸[21-25]。對(duì)比原料中的有機(jī)酸種類,發(fā)酵過程中新產(chǎn)生了莽草酸、乳酸、乙酸、富馬酸和沒食子酸。

黃金酵素由菠蘿、橘子和葡萄3種水果發(fā)酵而成,本研究從黃金酵素中檢測到酒石酸、乳酸、乙酸和檸檬酸,但4種有機(jī)酸的含量相對(duì)較低。研究表明:3種水果原料中含有蘋果酸、檸檬酸、草酸、莽草酸、酒石酸和乳酸6種有機(jī)酸[26-28],對(duì)比原料中的有機(jī)酸種類,發(fā)酵過程中丙酮酸、蘋果酸、富馬酸等有機(jī)酸可能在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化成其他代謝物。

2.6 5種食用植物酵素中有機(jī)酸代謝產(chǎn)物的主成分分析

各種有機(jī)酸賦予了酵素不同的風(fēng)味特性,蘋果酸具有溫和愉悅性的酸味,檸檬酸具有溫和的酸味,乙酸具有刺激性酸味,乳酸酸味溫和適中,琥珀酸有鮮味。不同原料制備的植物酵素中有機(jī)酸的種類及含量有較大差異,因而不同原料制備的食用植物酵素表現(xiàn)出不同的風(fēng)味特征。為了明確不同種類有機(jī)酸的差異對(duì)于酵素風(fēng)味特征的影響,以5種食用植物酵素為研究對(duì)象,以12種有機(jī)酸作為研究變量,利用R語言對(duì)所得的有機(jī)酸含量進(jìn)行主成分分析,選取特征值大于1的成分為主成分,結(jié)果如圖4所示,前2個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為42.48%和34.52%,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到77.00%,表明前2個(gè)主成分能夠較好地代表5種食用植物酵素中總有機(jī)酸77.00%的信息。其中,變量蘋果酸、檸檬酸在第一主成分的正方向有較高的載荷系數(shù),說明與第一主成分正相關(guān);變量草酸、酒石酸、莽草酸、抗壞血酸、馬來酸、富馬酸、沒食子酸在第一主成分的負(fù)方向有較高的載荷系數(shù),說明與第一主成分負(fù)相關(guān);變量乙酸、乳酸在第二主成分的正方向有較高的載荷系數(shù),說明與第二主成分正相關(guān);變量蘋果酸在第二主成分的負(fù)方向有較高的載荷系數(shù),說明與第二主成分負(fù)相關(guān)。因此,檸檬酸、蘋果酸和乳酸是影響食用植物酵素的主要特征有機(jī)酸成分,對(duì)不同原料制備的植物酵素差異影響較大。

圖4 不同酵素樣品的有機(jī)酸主成分分析

樣品博伊森莓酵素和青梅酵素沿第一主成分正方向分布,在第二主成分方向的投影比較短,表明檸檬酸、蘋果酸占有較高的比重,對(duì)兩種酵素的風(fēng)味產(chǎn)生明顯影響。沙棘酵素沿第二主成分負(fù)方向分布,表明蘋果酸占有較高的比重,對(duì)于沙棘酵素的風(fēng)味產(chǎn)生明顯影響?；瘕埞退睾忘S金酵素沿第二主成分正方向分布,表明乙酸和乳酸占有較高的比重,從而顯著影響兩種酵素的風(fēng)味特征。這些有機(jī)酸含量的差異,賦予了不同植物酵素的特征風(fēng)味差異。

2.7 5種食用植物酵素中有機(jī)酸代謝產(chǎn)物的聚類分析

為了進(jìn)一步確定不同原料制備的植物酵素有機(jī)酸代謝產(chǎn)物表達(dá)的定量差異,對(duì)5種植物酵素樣品進(jìn)行層次聚類分析,并繪制了樣品中有機(jī)酸代謝產(chǎn)物含量的熱圖,結(jié)果如圖5所示,通過歐式距離法聚類分析,把5種來源食用植物酵素分成3類,火龍果酵素和黃金酵素為一類,乳酸和乙酸含量較高;青梅酵素和沙棘酵素為一類,蘋果酸含量較高;博伊森莓酵素為一類,其中的檸檬酸和琥珀酸含量較高。對(duì)五種不同原料制備的食用植物酵素有機(jī)酸進(jìn)行聚類分析,可以將有機(jī)酸分為三類,一類為OA1:草酸、酒石酸、莽草酸、乳酸、乙酸、富馬酸、琥珀酸、沒食子酸、馬來酸和抗壞血酸;一類為OA2:蘋果酸;另一類OA3為檸檬酸;這與圖4有機(jī)酸的主成分分析結(jié)果相一致。

圖5 不同酵素樣品的有機(jī)酸熱圖和聚類分析

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)檢測食用植物酵素中12種有機(jī)酸的HPLC方法,優(yōu)化后的色譜條件為:檢測波長210 nm,流動(dòng)相為甲醇:KH2PO4(0.01 mol/L,pH2.7)=2∶98 (V/V),柱溫20 ℃;所得各種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)為0.9994～0.9999,加標(biāo)回收率為87.28%～109.78%之間,該方法的精密度RSD(%)在0.49～1.49%之間,該方法具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確度高、精密度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。利用此法對(duì)青梅酵素、沙棘酵素、火龍果酵素、博伊森莓酵素和黃金酵素5種食用植物酵素中的有機(jī)酸種類及含量變化進(jìn)行測定,分別檢測到10、11、9、10、4種有機(jī)酸,均檢測到酒石酸、乙酸和檸檬酸。該方法適合食用植物酵素樣品中有機(jī)酸的檢測,為食用植物酵素樣品中有機(jī)酸檢測提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

對(duì)5種食用植物酵素的有機(jī)酸含量進(jìn)行主成分分析,提取2個(gè)主成分反映酵素中有機(jī)酸的77.00%的信息。檸檬酸、蘋果酸和乳酸是食用植物酵素主要特征有機(jī)酸成分,對(duì)不同原料來源的植物酵素差異影響較大。通過分層聚類熱圖分析,可將5種來源的食用植物酵素分成三類,其中火龍果酵素和黃金酵素為一類,乳酸和乙酸含量較高,青梅酵素和沙棘酵素為一類,蘋果酸含量較高,博伊森莓酵素為一類,檸檬酸和琥珀酸含量較高。對(duì)5種不同原料制備的食用植物酵素有機(jī)酸進(jìn)行聚類分析,可以將有機(jī)酸分為三類,一類以乳酸為主,一類以蘋果酸為主,另一類以檸檬酸為主。本研究通過對(duì)不同原料制備的食用植物酵素中有機(jī)酸含量進(jìn)行分析,闡明了不同原料發(fā)酵的食用植物酵素有機(jī)酸的差異,為食用植物酵素的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。