響應(yīng)面法優(yōu)化珍珠龍膽石斑魚肉肽的酶法制備工藝及酶解產(chǎn)物的抗氧化活性

徐 杰,林澤安,李子青,江彩珍,范秀萍,2,*,蘇偉明

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心,水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室,廣東湛江 524088;2.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室,廣東湛江 524088)

珍珠龍膽石斑魚(♀Epinephelusfuscoguttatus×♂Epinephleuslanceolatus),俗稱龍虎斑,是目前中國南方地區(qū)海水養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟魚類[1]。其具有生長快、環(huán)境耐受性強、病害少、魚皮膠原蛋白含量高、肉質(zhì)纖維細膩等優(yōu)勢,目前以活體銷售為主要的消費模式,價格較高[1-4]。由于受到鮮活水產(chǎn)品?；盍魍ǚ绞脚c技術(shù)的限制,在運輸與銷售過程中的死亡個體很多,死亡個體通常以冰鮮的方式進行銷售,但價格便宜。

珍珠龍膽石斑魚肉是一種高蛋白、低脂肪的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)原料,其背部肌肉的蛋白質(zhì)(干基)含量甚至達到85.19%,可以作為各類蛋白與多肽類產(chǎn)品的原材料[5-6]。國內(nèi)外關(guān)于魚肉肽的提取制備及其活性研究主要有羅非魚[7-8]、鱈魚[9-10]、鮐鲅魚[11-13]及一些淡水魚[14-16]等,且以酶法制備為主,該法具有條件溫和、效率高等優(yōu)勢;同時也有采用發(fā)酵法制備抗氧化肽的。但對石斑魚精深加工的相關(guān)研究報道還相對較少,因此,對珍珠龍膽石斑魚肉的開發(fā)利用是目前研究的重要方向[2,17]。

本實驗以珍珠龍膽石斑魚肉為原材料,采用生物酶解法制備石斑魚肉肽,以水解度和1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率為指標(biāo),利用單因素實驗及響應(yīng)面優(yōu)化的方法探究最佳酶解條件,并采用DPPH自由基清除率、羥基自由基(·OH)清除率和總還原力為抗氧化指標(biāo)來評價其酶解產(chǎn)物及超濾分離組分的抗氧化活性,以期為珍珠龍膽石斑魚的精深加工提供新的方法與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活珍珠龍膽石斑魚 購于霞山水產(chǎn)品批發(fā)市場;風(fēng)味蛋白酶(3×104U/g)、堿性蛋白酶(15×104U/g)、木瓜蛋白酶(21×104U/g)、中性蛋白酶(20×104U/g)、動物蛋白酶(23×104U/g) 購自廣西南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司;甲醛、氫氧化鈉、無水乙醇、鹽酸、硼酸、三氯乙酸、硫酸、鄰二氮菲、H2O2、鐵氰化鉀、三氯化鐵、硫酸亞鐵 購自廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司,均為分析純;1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-dipHenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 購自上海源葉生物科技有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;BSA224S-CW型萬分之一電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;JY12002型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;5810R臺式高速大容量冷凍離心機 艾本德中國有限公司;Sorvall LYNX 6000高速落地離心機 美國賽默飛世爾科技公司;Varioskan Flash酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技公司;高速組織搗碎機 上海標(biāo)本模型廠;pHS-3C型雷磁pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;T18高速分散機ULTRA-TURRAX 德國IKA公司;Mini pellicon型超濾裝置 默克密理博實驗室設(shè)備(上海)有限公司;FD-551型冷凍干燥機 上海愛朗儀器有限公司;Vapodest凱氏定氮儀 德國格哈特分析儀器有限公司;N-1100V-WB型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理 鮮活石斑魚,取其背部及腹部肌肉(注意不要割破血管),用生理鹽水清洗后拭干,于高速組織搗碎機中搗碎,分裝,置于-20 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶法制備工藝 實驗時取出冰凍的珍珠龍膽石斑魚肉糜于室溫解凍,之后稱取一定量解凍后的石斑魚肉糜于燒杯中按料水比加入蒸餾水,再依此調(diào)節(jié)pH、溫度,按酶添加量加入酶劑在水浴鍋中酶解,酶解到特定時間后迅速取出燒杯,在沸水浴中滅酶10 min,再等冷卻至室溫后,分裝于離心管中,在4000 r/min的條件下離心10 min,取其上清液,再依此進行超濾分級、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、真空冷凍干燥,最終得到干燥粉末產(chǎn)品。

1.2.3 酶的選擇 取魚肉20 g,分別加入400 U/g的風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、動物蛋白酶,pH為7.0(堿性蛋白酶為pH8.0)及溫度為50 ℃,料水比1∶5(魚肉與水質(zhì)量體積比,g/mL)酶解4 h,測得水解度(DH)及DPPH自由基清除率,選取最佳作用酶。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 料水比對水解度和DPPH自由基清除率的影響 選取風(fēng)味蛋白酶,酶添加量400 U/g,在pH7.0、50 ℃條件下酶解4 h,設(shè)置不同料水比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶6、1∶8),分別測得水解度及DPPH自由基清除率,考察料水比對水解度和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.4.2 pH對水解度和DPPH自由基清除率的影響 選取風(fēng)味蛋白酶,酶添加量400 U/g,在50 ℃、料水比1∶4條件下酶解4 h,設(shè)置不同pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5),分別測得水解度及DPPH自由基清除率,考察pH對水解度和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.4.3 酶解時間對水解度和DPPH自由基清除率的影響 選取風(fēng)味蛋白酶,酶添加量400 U/g,在pH7.0、50 ℃、料水比1∶4條件下酶解,設(shè)置不同時間(2、3、4、5、6、7 h),分別測得水解度及DPPH自由基清除率,考察酶解時間對水解度和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.4.4 酶解溫度對水解度和DPPH自由基清除率的影響 選取風(fēng)味蛋白酶,酶添加量400 U/g,在pH7.0、料水比1∶4條件下酶解5 h,設(shè)置不同溫度(40、45、50、55、60 ℃),分別測得水解度及DPPH自由基清除率,考察酶解溫度對水解度和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.4.5 酶添加量對水解度和DPPH自由基清除率的影響 選取風(fēng)味蛋白酶,在pH7.0、55 ℃、料水比1∶4條件下酶解5 h,設(shè)置不同酶添加量(150、300、600、900、1200 U/g),分別測得水解度及DPPH自由基清除率,考察酶添加量對水解度和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.5 酶解工藝優(yōu)化 根據(jù)Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計原理[18],運用 Design-Expert V8.0.6.1軟件,基于單因素實驗結(jié)果,采用4因素3水平的響應(yīng)面分析法,固定酶解pH7.0,以料水比(A)、酶解時間(B)、酶解溫度(C)、酶添加量(D)為自變量,酶解液水解度(DH,Y)為響應(yīng)值,各因素三個水平采用-1、0、1進行編碼,因素水平和編碼見表1。

表1 Box-Benhnken試驗因素水平設(shè)計

1.2.6 水解度測定 原料總氮含量用凱氏定氮法(GB 5009.5-2016)測定;氨基酸態(tài)氮用酸度計法(GB 5009.235-2016)測定。水解度(DH)的計算公式為:

DH(%)=(水解液中氨基態(tài)氮-原料中游離氨基態(tài)氮)/(原料中總氮含量-原料中非蛋白氮)×100

1.2.7 珍珠龍膽石斑魚肉酶法制備上清液及超濾分離 根據(jù)Box-Behnken實驗優(yōu)化確定的酶法制備的最佳工藝參數(shù),制備珍珠龍膽石斑魚肉粗酶解產(chǎn)物(EH)。選用截留不同分子量的超濾膜(8、5、3 kDa)對酶解上清液進行分離純化后冷凍干燥,分別得到不同的超濾組分:EH-1(>8 kDa)、EH-2(5～8 kDa)、EH-3(3～5 kDa)和EH-4(<3 kDa)。

1.2.8 酶解上清液及超濾組分的抗氧化活性測定

1.2.8.1 DPPH自由基清除率的測定 參照Nurdiani等[19]的方法并略有修改,取0.4 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液,加入0.4 mL新配制DPPH溶液(1×10-4mol/L),搖勻、室溫下避光放置30 min,于517 nm波長處測定吸光度(A1);以等量無水乙醇代替DPPH溶液重復(fù)上述步驟,測定吸光度(A2);以等量無水乙醇代替樣品溶液重復(fù)上述步驟,測定吸光度(A3)。清除率(Q)按下列公式計算:

1.2.8.2 羥基自由基(·OH)清除率的測定 參照Wang[20]的方法并略有修改,取0.3 mL鄰二氮菲乙醇溶液(5 mmol/L),加入0.2 mL的磷酸鹽緩沖液(0.15 mol/L,pH7.40)和0.3 mL的FeSO4溶液(0.75 mmol/L),加入待測不同質(zhì)量濃度的樣品溶液1 mL混勻后,加入0.2 mL的H2O2(0.1%)搖勻,37 ℃條件下水浴60 min,于536 nm波長處測定吸光度(A1);以等量磷酸鹽緩沖液(0.15 mol/L,pH7.40)代替鄰二氮菲乙醇溶液、FeSO4溶液和H2O2溶液重復(fù)上述步驟,測定吸光度(A2);以等量超純水代替樣品溶液和H2O2溶液重復(fù)上述步驟,測定吸光度(A3);以等量超純水代替樣品溶液重復(fù)上述步驟,測定吸光度(A4)。清除率(Q)按下列公式計算:

1.2.8.3 總還原力的測定 參照袁燕[21]的方法并略有修改,取1 mL的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6),加入0.1 mL待測不同質(zhì)量濃度的樣品溶液和1 mL的鐵氰化鉀溶液(1%),50 ℃條件下水浴反應(yīng)20 min后迅速冷卻,加入1 mL的三氯乙酸溶液(10%),3000 r/min離心20 min,取上清液1 mL,加入1 mL超純水和0.2 mL的FeCl3溶液(0.1%),混勻后室溫放置10 min,測定700 nm的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MS Excel 2010軟件作圖;采用Design-Expert V8.0.6.1軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化分析;采用IC50計算軟件計算IC50值,實驗結(jié)果均以(X±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的選擇

如圖1所示,在相同酶活力添加量的情況下,五種蛋白酶的水解效果如下:水解度:風(fēng)味蛋白酶>中性蛋白酶>木瓜蛋白酶>動物蛋白酶>堿性蛋白酶;DPPH自由基清除率:風(fēng)味蛋白酶>堿性蛋白酶>動物蛋白酶>中性蛋白酶>木瓜蛋白酶。由于酶具有專一性的特點,其與底物反應(yīng)有一定特異性,在不同蛋白酶的酶解下,魚肉水解所得的短肽有一定差異,從而影響水解度和DPPH自由基清除率。所以綜合水解度及DPPH自由基清除率兩組實驗數(shù)據(jù),選取風(fēng)味蛋白酶來進行單因素實驗及響應(yīng)面優(yōu)化,以確定該酶對于珍珠龍膽石斑魚肉的最佳酶解條件。陳周[22]、田裕心[23]等均表明用風(fēng)味蛋白酶對水產(chǎn)品進行酶解,其酶解效果及風(fēng)味均有較好改善。

圖1 不同蛋白酶對石斑魚肉酶解DH和DPPH自由基清除率的影響

2.2 單因素實驗

2.2.1 不同料水比對水解度和DPPH自由基清除率的影響 如圖2所示,隨著水添加量的上升,水解度先上升后下降,DPPH自由基清除率在1∶2的料水比時出現(xiàn)最低值;在料水比為1∶1時,DPPH自由基清除率高達96.86%,可能是由大分子的蛋白復(fù)合物也具有自由基清除作用。料水比小于1∶4時,酶與魚肉的結(jié)合較為緊密,呈現(xiàn)飽和,所以水解度達到最大值6.20%,抗氧化短肽含量也在增加;當(dāng)料水比大于1∶4時,勻漿液中酶與魚肉蛋白結(jié)合較松散,造成水解度在后期呈現(xiàn)下降趨勢;并且使得魚肉中抗氧化肽的析出變緩,所以其DPPH自由基清除率趨于平緩。因此,酶解料水比應(yīng)選擇1∶4為佳。

圖2 不同料水比對石斑魚肉酶解DH和DPPH自由基清除率的影響

2.2.2 不同pH對水解度和DPPH自由基清除率的影響 如圖3所示,當(dāng)pH<7時,水解度先迅速上升后變?yōu)槠骄?DPPH自由基清除率均處于較低水平,當(dāng)pH7時,水解度及DPPH自由基清除率達到最高,而后呈下降趨勢。這是由于酶的活性受pH影響較大,pH越低或越高,對酶活力的影響都很大,從而影響酶的催化效果,風(fēng)味蛋白酶是一種中性蛋白酶,在pH7.0時有水解度最高且DPPH自由基清除率達到99.19%。從圖3可知,當(dāng)pH5.5時與pH7.0時的DPPH自由基清除率均達到90%以上,按照趨勢pH5.5時DPPH自由基清除率應(yīng)該最低,推測是由于pH較低時水解度較低,離心之后上清液依舊含有固體懸浮物,對DPPH自由基清除率的測定造成了一定影響。因此,酶解pH應(yīng)選擇7.0為佳。

圖3 不同pH對石斑魚肉酶解DH和DPPH自由基清除率的影響

2.2.3 不同酶解時間對水解度和DPPH自由基清除率的影響 如圖4所示,當(dāng)酶解時間小于5 h時,水解度及DPPH自由基清除率均隨時間的延長而上升;當(dāng)時間到達5 h時,達到最高,隨后趨于平緩。當(dāng)在加酶量與料水比一定時,酶與魚肉作用的程度有限,延長時間可以使其充分反應(yīng),游離氨基酸及抗氧化肽析出上升,水解度及清除率增加;但當(dāng)達到體系限度時趨于平緩,游離氨基酸及抗氧化肽析出飽和,水解度及清除率液趨于平緩。因此,酶解時間應(yīng)選擇5 h為佳。

圖4 不同酶解時間對石斑魚肉酶解DH和DPPH自由基清除率的影響

2.2.4 不同酶解溫度對水解度和DPPH自由基清除率的影響 如圖5所示,當(dāng)溫度低于55 ℃時,水解度隨溫度的升高明顯增加,DPPH自由基清除率無顯著變化;當(dāng)溫度高于55 ℃時,水解度及DPPH自由基清除率均呈下降趨勢。這是由于溫度時影響酶活力的主要因素之一,當(dāng)溫度低于55 ℃時,隨著溫度的上升,酶解速度加快,水解速度增大;當(dāng)溫度高于55 ℃時,酶失活嚴重,酶解速度降低,抗氧化肽析出減少,所以水解度及DPPH自由基清除率均下降。因此,酶解溫度應(yīng)選擇55 ℃為佳。

圖5 不同酶解溫度對石斑魚肉酶解DH和DPPH自由基清除率的影響

2.2.5 酶添加量對水解度和DPPH自由基清除率的影響 如圖6所示,當(dāng)酶添加量低于900 U/g時,水解度和DPPH自由基清除率均隨酶添加量的增加而上升;當(dāng)酶添加量大于900 U/g時,水解度基本趨于平緩,DPPH自由基清除率有所下降。當(dāng)酶添加量增加的時候,底物總量不變,體系在其他因素滿足的條件下,酶解液中的游離氨基態(tài)氮含量會飽和,所以水解度后期趨于平緩;當(dāng)酶添加量增加的時候,酶解上清液的顏色加深,且腥味更重,可能會影響酶解產(chǎn)物中抗氧化肽的活性,造成DPPH自由基清除能力下降。因此,酶添加量應(yīng)選擇900 U/g為佳。

圖6 不同酶添加量對石斑魚肉酶解DH和DPPH自由基清除率的影響

2.3 Box-Benhnken試驗結(jié)果

2.3.1 Box-Benhnken試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果,利用Design-Expert V8.0.6.1軟件設(shè)計與分析,設(shè)計試驗方案及結(jié)果如表2所示,以水解度(DH)為響應(yīng)值,共設(shè)計29組試驗方案,包含24組析因試驗組及5個中心試驗組。同時也檢測了每組的DPPH自由基清除率。但以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值進行分析時,模型整體不顯著,因此文中僅以水解度作為響應(yīng)值進行分析。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

利用Design-Expert V8.0.6.1軟件對響應(yīng)值與各因素編碼值進行回歸擬合后,得到回歸方程[24]:

Y=8.51+0.18A+0.43B-0.47C+0.54D-0.26AB-0.19AC-0.017AD-0.17BC+0.052BD-0.055CD+0.049A2+0.14B2-0.69C2+0.14D2

表3 回歸模型方差分析

2.3.2 響應(yīng)面的交互作用分析 根據(jù)Design-Expert V8.0.6.1軟件,獲得響應(yīng)值的3D曲面圖,分析各因素對水解度的影響及各因素間的交互作用,響應(yīng)面圖等高線的形狀反應(yīng)交互作用的強弱,圓形表示兩因素交互作用不明顯,而橢圓則表示交互作用明顯[25-26]。圖7(a)(b)(c)所示,酶解溫度和料水比、酶解溫度和酶解時間、酶添加量和酶解溫度均存在不顯著的交互作用,與方差分析結(jié)果相符。當(dāng)固定料水比、酶解時間、酶添加量三個因素在零水平時,酶解溫度對水解度的影響均先呈現(xiàn)快速上升趨勢,溫度達到某一定值后緩慢下降。

圖7 兩因素的交互作用的響應(yīng)面圖

2.3.3 最佳酶解工藝參數(shù)的確定 根據(jù)Box-Benhnken實驗結(jié)果與回歸分析,可得到珍珠龍膽石斑魚肉酶解的最佳工藝參數(shù)為:酶解pH7.0、料水比1∶3.50、酶解時間5.50 h、酶解溫度53.24 ℃、酶添加量1049.96 U/g,在此條件預(yù)測的水解度為10.05%。為方便實驗操作將實驗條件定為酶解pH7.0、料水比1∶3.5、酶解時間5.5 h、酶解溫度53 ℃、酶添加量1050 U/g。為驗證響應(yīng)面的可行性,用此最佳工藝參數(shù)進行驗證性實驗,設(shè)置三組平行實驗,實驗所得到的水解度為9.99%±0.39%,與理論值誤差在±1%以內(nèi),說明采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的酶法制備的最佳工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.4 石斑魚肉酶解產(chǎn)物的抗氧化活性

2.4.1 對DPPH自由基清除率的影響 DPPH自由基是很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,常用于體外清除自由基活性評價[27]。如表4所示,珍珠龍膽石斑魚酶解產(chǎn)物及超濾組分對DPPH自由基有一定的清除能力,EH、EH-1、EH-2、EH-3和EH-4對DPPH自由基清除率的IC50值均低于抗壞血酸的清除能力(VC的IC50值為(3.02±0.35) μg/mL)。但一般認為某種物質(zhì)DPPH自由基清除率的IC50值<10 mg/mL時,即可認為有較好的抗氧化性[28]。所以本實驗所得珍珠龍膽石斑魚酶解產(chǎn)物是一種DPPH自由基清除能力較高的產(chǎn)品,且優(yōu)于段宙位等[6]制備的石斑魚酶解產(chǎn)物,其DPPH自由基清除率的IC50值為1.18 mg/mL。

2.4.2 對羥基自由基(·OH)清除率的影響 羥基自由基(·OH)是一種氧化能力很強的活性氧自由基,對身體有很大的損傷性[29]。根據(jù)鄰二氮菲比色法,可以測得其清除能力的強弱。如表4所示,石斑魚酶解產(chǎn)物對羥基自由基(·OH)有一定的清除能力,EH-2和EH-3的羥基自由基(·OH)清除能力較強。但低于抗壞血酸的清除能力(VC的IC50值為(0.24±0.02) μg/mL)。

表4 VC和石斑魚肉酶解產(chǎn)物的DPPH、羥基自由基清除作用的IC50

2.4.3 對總還原力的影響 物質(zhì)的自身的抗氧化能力與還原性質(zhì)有關(guān),通過測定總還原力來表示抗氧化能力的強弱,還原力越強,抗氧化能力越強[30]。如圖8所示,石斑魚酶解產(chǎn)物隨質(zhì)量濃度的上升而還原能力增強,其粗酶解產(chǎn)物的還原力明顯高于超濾組分,可能是由于超濾分離將某些還原性物質(zhì)拆分,造成超濾分離產(chǎn)品的還原力下降。抗壞血酸的還原能力明顯比石斑魚酶解產(chǎn)物強,但酶解產(chǎn)物仍具有一定還原能力,這與DPPH自由基清除能力及羥基自由基(·OH)清除能力表現(xiàn)的抗氧化能力相似。

圖8 VC(a)和石斑魚肉酶解產(chǎn)物(b)的總還原力

3 結(jié)論

珍珠龍膽石斑魚肉是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白源,經(jīng)風(fēng)味蛋白酶在pH7.0、料水比1∶3.5、酶解時間5.5 h、酶解溫度53 ℃、酶添加量1050 U/g條件下,得到具有抗氧化活性的酶解產(chǎn)物,其水解度為9.99%±0.39%。酶解產(chǎn)物及超濾組分的DPPH自由基清除能力IC50值在0.63～0.88 mg/mL之間;超濾組分EH-2(5～8 kDa)和EH-3(3～5 kDa)羥基自由基清除能力IC50值分別為16.94和16.38 mg/mL;酶解產(chǎn)物及超濾組分均具有較明顯的還原能力。本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化珍珠龍膽石斑魚肉制備蛋白肽工藝,所得的制備條件有效可行;且酶解產(chǎn)物及超濾組分均具有良好的抗氧化活性,可用于食品、藥品與化妝品等領(lǐng)域。