基于blaCARB-17和toxR基因的副溶血弧菌雙重PCR檢測(cè)方法的建立

胡元慶,林凱玲,周贊虎,李鳳霞

(1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建漳州 363000;2.漳州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心,福建漳州 363000)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)是弧菌科弧菌屬的一種革蘭氏陰性菌,1950年由Tsunesaburo Fujino[1-2]從一名食物中毒患者體內(nèi)首次分離。該菌廣泛分布于海洋和鹽湖中,是海產(chǎn)品中常見(jiàn)的致病菌,食物中毒病例臨床上以急性發(fā)病、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀[3-4]。近年來(lái)由VP引起的食物中毒已超過(guò)沙門(mén)菌食物中毒而躍居首位[5]。由于我國(guó)是海產(chǎn)品生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó),VP是食物中毒和沿海地區(qū)夏秋季腹瀉的主要病因[6],必須建立快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法來(lái)監(jiān)測(cè)海產(chǎn)品中的副溶血弧菌[7]。

檢測(cè)副溶血弧菌有分子生物學(xué)和分析化學(xué)法,操作步驟繁瑣[8],檢測(cè)周期較長(zhǎng)。目前PCR技術(shù)已在VP檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用,包括常規(guī)PCR[9-10]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR[11-13]、EMA-PCR[14]、納米PCR[15-16]等。雙重PCR因其操作簡(jiǎn)單,所需設(shè)備在基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)均有配置,可以同時(shí)擴(kuò)增兩條大小不同的片段,能保證較高的特異性[17]。

盡管許多靶向基因(tlh和atpA)被用作VP的種屬特異性標(biāo)記,但其中一些基因在其他弧菌中共享相似的序列,降低了檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和特異性[18]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌中有一種toxR致病基因,參與了某些毒力基因的轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)[19],該基因在副溶血弧菌的種內(nèi)相對(duì)保守[20-22],比tlh有更高的特異性[23]。blaCARB-17基因與副溶血弧菌對(duì)青霉素的固有抗性有關(guān)[18,24]。Li等分析了tlh、atpA和blaCARB-17基因的同源性,基于blaCARB-17基因的PCR特異性為100%,而基于tlh和atpA基因的PCR偶爾會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[18]。blaCARB-17基因存在于GenBank已經(jīng)登錄的所有293種副溶血弧菌株中,并且所有來(lái)源于食品的91株副溶血弧菌攜帶該基因[18,24],進(jìn)一步證實(shí)了該基因比tlh、atpA基因更為保守。blaCARB-17和toxR基因都具有很高的特異性,普遍存在于各種來(lái)源的副溶血弧菌中。國(guó)內(nèi)研究數(shù)據(jù)顯示,覃倚瑩等[25]2008年以toxR基因作為熒光定量PCR靶基因設(shè)計(jì)TaqMan探針快速檢測(cè)副溶血弧菌;白雪松等[26]2012年建立了tlh和toxR基因的雙重PCR檢測(cè)方法;張曉君等[27]2012年建立了基于toxR基因的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)病原性副溶血弧菌的方法;黃晨陽(yáng)等[28]2013年基于toxR基因建立了檢測(cè)副溶血弧菌的PCR方法;曹冬梅等[29]2013年建立了toxR和tdh基因的Taqman探針雙色熒光PCR檢測(cè)方法;慕艷娟等[9]2015年建立了以toxR-S為靶基因的副溶血弧菌PCR檢測(cè)方法。國(guó)外研究顯示,Kim等[30]1999年通過(guò)檢測(cè)toxR基因分析了副溶血弧菌;2008年Rosec等[31]比較了toxR和pR72H為靶基因的PCR;2016年Li[18]等首先建立了針對(duì)blaCARB-17的PCR檢測(cè)技術(shù),目前還沒(méi)有以此基因建立其他檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道。blaCARB-17作為一種新型的靶基因[21,32]適合設(shè)計(jì)多重PCR,這為建立雙重PCR奠定了良好的分子基礎(chǔ)。

在我國(guó)檢測(cè)副溶血弧菌的PCR方法中,大部分以tdh、tlh、trh為靶基因并鑒定菌株的毒性,而以tlh、tdh為靶基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果偶爾會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性的現(xiàn)象[18]。本文針對(duì)副溶血弧菌的blaCARB-17和toxR兩個(gè)基因合成特異性引物,建立了雙重PCR的檢測(cè)方法,以期為基層水產(chǎn)品的大批量安全檢測(cè)提供可行性方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

對(duì)照菌株(包括副溶血弧菌ATCC17802、大腸桿菌D5、金黃色葡萄球菌CMCC26003、志賀氏菌B4、蠟樣芽胞桿菌63302、單核細(xì)胞增生李斯特菌54001和沙門(mén)菌50041) 均由漳州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心微生物檢測(cè)室提供;56個(gè)副溶血弧菌分離株 分離于漳州市區(qū)的45株(花蛤17株、蟶17株、南美白對(duì)蝦2株、文蛤9株),龍海的蝦2株,東山的蝦1株,云霄的南美白對(duì)蝦7株,廈門(mén)的南美白對(duì)蝦1株;TCBS瓊脂和普通肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;Tris base 生物純,Biosharp公司;Regular Agarose G-10瓊脂糖 生物純,西班牙BIOWEST公司;2×Taq Master Mix和Trans 2K DNA Ladder 上海捷瑞生物工程有限公司;Gel Stain(10000×)核酸染料 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

Tprofessional Thermocycler PCR儀 德國(guó)Biometra公司;Red型凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)ProteinSimple公司;MIKRO 220R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hettich公司;BSM-30R立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;HSY-B-200恒溫振蕩搖床 金壇市鴻科儀器廠;DYY-6D電泳儀 北京市六一生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物序列及合成blaCARB-17基因引物參考Li等[18]設(shè)計(jì),toxR基因的引物參考Kim等[30]文獻(xiàn)設(shè)計(jì),引物序列見(jiàn)表1,均委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 擴(kuò)增基因的引物序列

1.2.2 副溶血弧菌的培養(yǎng) 將副溶血弧菌ATCC17802接種于TCBS培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。挑取TCBS培養(yǎng)基上的單菌落,接種于3% 氯化鈉堿性蛋白胨水,37 ℃恒溫振蕩搖床培養(yǎng)12 h。對(duì)照菌接種到普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上,37 ℃培養(yǎng)18～24 h;挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)18～24 h。

1.2.3 副溶血弧菌DNA的提取 移液槍吸取1.2.2中的菌液1 mL于1.5 mL離心管中,高速離心機(jī)12000 r/min離心5 min,去上清液,重復(fù)1～2次;移液槍吸取1 mL無(wú)菌水加入離心管并吹打,高速離心機(jī)12000 r/min離心5 min,去上清液;取100 μL無(wú)菌水懸浮沉淀;于沸水浴中加熱10 min;高速離心機(jī)12000 r/min離心5 min,取上清液(即副溶血弧菌DNA模板)到另一潔凈的離心管中,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 單重PCR檢測(cè)方法建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化 以副溶血弧菌ATCC17802株的DNA提取物作為模板,分別建立以blaCARB-17和toxR為靶基因的單重PCR。25 μL單重PCR體系為:12.5 μL的2×Taq Master Mix,上下游引物各1 μL,DNA模板3 μL,用ddH2O補(bǔ)足。優(yōu)化退火溫度、退火時(shí)間和模板量等反應(yīng)參數(shù),確定最優(yōu)的反應(yīng)條件。

1.2.5 雙重PCR檢測(cè)方法建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化 以副溶血弧菌ATCC17802株的DNA提取物作為模板,建立以blaCARB-17和toxR為靶基因的雙重PCR。25 μL體系中,加12.5 μL的2×Taq Master Mix,兩對(duì)上下游引物各1 μL,DNA模板3 μL,用ddH2O補(bǔ)足。優(yōu)化退火溫度、退火時(shí)間和引物比例等反應(yīng)參數(shù),確定最優(yōu)的反應(yīng)條件。

1.2.6 PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè) 配制1.5%電泳凝膠,在膠液中加入5 μL Gel Stain(10000×)電泳染料,制成電泳凝膠待用。取5 μL PCR產(chǎn)物上樣,98 V電泳35 min。電泳后凝膠于成像系統(tǒng)中成像并拍照。

1.2.7 特異性檢測(cè) 以大腸桿菌D5、金黃色葡萄球菌CMCC26003、志賀氏菌B4、蠟樣芽胞桿菌63302、單核細(xì)胞增生李斯特菌54001和沙門(mén)菌50041為對(duì)照,按照優(yōu)化后的退火溫度、退火時(shí)間和引物比例進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分析其特異性。

1.2.8 靈敏度檢測(cè) 將副溶血弧菌ATCC17802株用1.2.2的方法培養(yǎng)增菌,并進(jìn)行10 倍梯度稀釋,然后用1.2.3的方法制備不同稀釋度菌液的基因組DNA。按上述優(yōu)化后條件進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增,電泳確定其靈敏度。

1.2.9 人工污染樣品檢測(cè) 取1.2.8中的菌液1 mL均勻涂在樣品蝦的表面,放置4 h后,用1 mL無(wú)菌去離子水回收菌液,用1.2.3的方法制備基因組DNA。取1 μL DNA模板加入1.2.5已優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得出人工污染樣品的檢測(cè)限。

1.2.10 實(shí)驗(yàn)室中副溶血弧菌分離株的驗(yàn)證 采用本實(shí)驗(yàn)建立的blaCARB-17基因的單重PCR和雙重PCR體系分別檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室鑒定保存的56個(gè)副溶血弧菌分離株,驗(yàn)證雙重PCR的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重PCR檢測(cè)方法建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化

以副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17802基因組DNA為模板,分別用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,blaCARB-17和toxR基因均有清晰的條帶,大小分別為303、350 bp,見(jiàn)圖1。通過(guò)梯度PCR對(duì)退火溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,確定blaCARB-17基因最佳擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 min預(yù)變性;95 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增;最后72 ℃延伸5 min。toxR基因最佳擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 min預(yù)變性;95 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增;最后72 ℃延伸 5 min。模板最佳用量為3 μL。

圖1 單重PCR的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 雙重PCR檢測(cè)方法建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化

首先梯度PCR優(yōu)化了退火溫度和時(shí)間,然后對(duì)引物比例進(jìn)行篩選,確定了副溶血弧菌的最佳雙重PCR的反應(yīng)條件。以blaCARB-17和toxR基因建立的雙重PCR的最佳擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 min預(yù)變性;95 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,25個(gè)循環(huán);最后72 ℃ 延伸5 min。反應(yīng)體系(25 μL):12.5 μL的2×Taq Master Mix,blaCARB-17基因上下游引物各1 μL,toxR基因上下游引物各1 μL,DNA模板3 μL,5.5 μL ddH2O。

圖2 雙重PCR的擴(kuò)增結(jié)果

2.3 雙重PCR特異性檢測(cè)

應(yīng)用上述體系對(duì)副溶血弧菌ATCC17802和6個(gè)對(duì)照菌株進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示副溶血弧菌擴(kuò)增出303和350 bp雙條帶,其他6株對(duì)照菌均未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶(見(jiàn)圖3),表明所建立的副溶血弧菌雙重PCR檢測(cè)方法有很好的特異性。

圖3 雙重PCR的擴(kuò)增結(jié)果

2.4 靈敏度檢測(cè)

由圖4可知,本實(shí)驗(yàn)所建立的雙重PCR方法在濃度1×106～1×102CFU/mL均可以擴(kuò)增出雙條帶,模板DNA為1×101CFU/mL和1 CFU/mL只有單條帶(350 bp),表明本實(shí)驗(yàn)雙重PCR方法檢測(cè)模板DNA的檢測(cè)限為1×102CFU/mL。該雙重PCR與很多學(xué)者報(bào)道的副溶血弧菌多重PCR檢測(cè)能力基本相當(dāng)。胡元慶等[33]建立了檢測(cè)水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌的雙重PCR方法,檢測(cè)限為1×102CFU/mL。蔣蔚等[34]建立的水產(chǎn)品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌多重PCR檢測(cè)方法,檢測(cè)限為1×102CFU/mL。桑燕嬌等[35]建立的副溶血弧菌和溶藻弧菌的雙重PCR檢測(cè)技術(shù),檢測(cè)限為2×102CFU/mL。與趙現(xiàn)鋒等[36]建立的干燥型熒光PCR試劑盒的檢測(cè)限140 CFU/mL相當(dāng)。虞艷等[37]建立的水產(chǎn)品中副溶血弧菌交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)限可達(dá)14 CFU/mL,與該技術(shù)的高靈敏性有關(guān),但其反應(yīng)所用的Bst DNA聚合酶價(jià)格較高?？傊?本研究建立的雙重PCR不需要昂貴的儀器和試劑,檢測(cè)限完全滿足實(shí)際需要。

圖4 檢測(cè)副溶血弧菌純培養(yǎng)物的雙重PCR靈敏度

2.5 人工污染樣品雙重PCR檢測(cè)

由圖5可知,本實(shí)驗(yàn)所建立的雙重PCR方法在濃度1×106～1×102CFU/mL均可以擴(kuò)增出雙條帶,模板DNA為1×101CFU/mL和1 CFU/mL只有隱約的單條帶,表明本實(shí)驗(yàn)雙重PCR方法檢測(cè)人工污染樣品的檢測(cè)限為1×102CFU/mL。

圖5 雙重PCR檢測(cè)人工污染樣品的靈敏度

2.6 副溶血弧菌分離株檢測(cè)

對(duì)56個(gè)副溶血弧菌分離株進(jìn)行blaCARB-17的單重PCR擴(kuò)增及blaCARB-17和toxR基因的雙重PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明56個(gè)菌株可擴(kuò)增出大小約為303 bp單條帶(結(jié)果見(jiàn)圖6)和350、303 bp的雙條帶(結(jié)果見(jiàn)圖7)。參考Li等[18]建立的blaCARB-17單重PCR,本研究成功對(duì)56株副溶血弧菌擴(kuò)增到預(yù)期條帶,在此基礎(chǔ)上建立的雙重PCR也成功擴(kuò)增到2條目的條帶,符合率100%,表明本實(shí)驗(yàn)建立的雙重PCR方法準(zhǔn)確可靠,無(wú)假陽(yáng)性和漏檢情況。

圖6 blaCARB-17單重PCR的擴(kuò)增結(jié)果

圖7 雙重PCR的擴(kuò)增結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了以blaCARB-17和toxR為靶基因的雙重PCR方法,主要用于檢測(cè)水產(chǎn)食品中的副溶血弧菌，優(yōu)化了雙重PCR的退火溫度、退火時(shí)間和引物比例等反應(yīng)參數(shù),檢測(cè)了雙重PCR的特異性和靈敏性,通過(guò)檢測(cè)人工污染樣品和副溶血弧菌分離株驗(yàn)證了其穩(wěn)定性。該雙重PCR最低檢測(cè)限為1×102CFU/mL,可特異地檢測(cè)食品中的副溶血弧菌污染。