牦牛酸奶中一株具有抗氧化活性乳酸菌的分離及鑒定

李 瀟,謝 亮，+,楊運南,高彥華,2,*

(1.西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041;2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室,四川成都 610041)

牦牛奶及其發(fā)酵產(chǎn)物是青藏高原地區(qū)牧民主要食品來源和經(jīng)濟來源[1]。發(fā)酵牦牛酸奶的營養(yǎng)價值較高,與常規(guī)酸奶制品相比,牦牛酸奶的乳脂和總蛋白含量提高了兩倍,維生素與礦物質(zhì)等養(yǎng)分含量也顯著增加[2]。牦牛發(fā)酵乳中微生物菌群組成比較復雜,優(yōu)勢菌群主要為乳酸菌(Lactic acidic bacteria,LAB),主要有乳酸桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬、明串珠菌屬、片球菌屬、腸球菌屬、魏斯氏菌屬等組成[3],此外還有酵母菌[4]。

畜禽生產(chǎn)過程中,由于環(huán)境溫度、斷奶、疾病等體內(nèi)外因素,導致動物機體產(chǎn)生活性氧自由基,高水平的氧自由基導致氧化應激,造成腸道損傷和細胞死亡[5-8]。也有研究表明,牦牛酸奶來源的乳酸菌具有抗氧化作用與清除氧自由基能力[9-11]。因此,發(fā)酵牦牛酸奶是乳酸菌的資源寶庫,從中篩選出具備較高抗氧化活性的乳酸菌生產(chǎn)抗氧化微生態(tài)制劑,對于緩解動物腸道氧化應激,提高動物免疫抗病力具有重要意義。

本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中分離出了一株新的乳酸菌X1,經(jīng)生理生化反應及16S rDNA鑒定,確定其為屎腸球菌。屎腸球菌作為一種乳酸菌,是飼料用安全菌種之一,在飼料中添加屎腸球菌能改善肉雞抗氧化應激能力[12],提高肉雞日增重和飼料轉(zhuǎn)化率[13],緩解腸道菌群失調(diào)及機體的氧化應激損傷[14],提高仔豬免疫和抗氧化功能等作用[15]。通過比較屎腸球菌X1與其他來源的屎腸球菌的體外抗氧化特性,為牦牛酸奶來源的屎腸球菌開發(fā)以及為新型抗氧化微生態(tài)制劑提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛酸奶樣品(n=3) 四川省康定縣新都橋鎮(zhèn)采集;參考菌株屎腸球菌G2 西南民族大學生命科學與技術學院羅璠副教授饋贈;TIANamp Bacteria DNA Kit細菌基因組DNA提取試劑盒、Loading buffer、DNA Ladder 北京天根生化科技有限公司;pEASY-T1 Cloning Kit、Easy Taq polymerase、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell 北京全式金生物技術有限公司;革蘭氏染色試劑盒 北京索萊寶生物科技有限公司;SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、BBI Life Sciences 4S green Plus Nucleic Acid Stain核酸熒光染料 上海生工生物工程有限公司;亮綠、1-二苯基-2苦基肼/DPPH 源葉生物技術有限公司;總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒 南京建成生物工程研究所;M17培養(yǎng)基、MPC培養(yǎng)基、BCP培養(yǎng)基、產(chǎn)酸培養(yǎng)基和乳酸菌糖醇發(fā)酵鑒定試紙條(HBIG11) 青島海博生物技術有限公司。

Biospec-nano微量核酸濃度檢測儀 日本島津公司;S1000 PCR 擴增儀 BIORAD公司;JY-SPCT型水平電泳槽 北京君意東方電泳設備有限公司;SYNGENE 凝膠成像系統(tǒng) Gene Company Limited公司;SW-CJ醫(yī)用型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;318C型酶標儀 上海沛歐分析儀器有限公司;JY98-ⅢN型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總菌與乳酸菌的菌落計數(shù) 采用平板計數(shù)法對牦牛酸奶樣品進行總菌與乳酸菌的菌落計數(shù)[9]。取酸奶樣品1 mL,測定其pH,然后加入9 mL無菌生理鹽水,制備成1∶10的酸奶稀釋液。再取100 μL加入900 μL無菌生理鹽水,進行梯度稀釋。選取105～107的稀釋梯度,吸取100 μL均勻涂布于MPC瓊脂表面,待表面吸收干后,于37 ℃培養(yǎng)48 h,對總菌數(shù)量進行計數(shù)。選取104～106的稀釋梯度,吸取100 μL均勻涂布于BCP瓊脂表面,待表面吸收干后,放在厭氧袋中,在37 ℃倒置培養(yǎng)18～24 h,對乳酸菌總數(shù)進行計數(shù)。

1.2.2 乳酸菌的分離與形態(tài)學鑒定 取酸奶樣品1 mL,加入9 mL無菌生理鹽水,制備成1∶10的酸奶稀釋液。再取100 μL加入900 μL無菌生理鹽水,進行梯度稀釋。取不同梯度稀釋液100 μL加入M17(加入2.5%的CaCO3)培養(yǎng)基中,用三角棒涂布均勻,放在厭氧袋中,37 ℃倒置培養(yǎng)24 h。仔細觀察菌落,挑取白菌落形態(tài)規(guī)則、大小適中、有透明溶鈣圈的單菌落。在M17液體培養(yǎng)基中富集,吸取10 μL進行革蘭氏染色,然后在M17固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)(37 ℃,24 h)。制備菌液涂片,利用100倍油鏡觀察菌體形態(tài)。

1.2.3 乳酸菌的產(chǎn)酸試驗與生化反應鑒定 挑取乳酸菌單菌落接種于產(chǎn)酸培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min,厭氧培養(yǎng)48 h,測量菌液pH。采用文獻[10]的方法對菌液進行過氧化氫酶實驗。采用乳酸菌生化鑒定試劑盒,37 ℃培養(yǎng)24～48 h,按產(chǎn)品說明判斷各種生化反應的結(jié)果類型,對菌株進行初步鑒定。

1.2.4 乳酸菌16S rDNA的分子鑒定 挑取M17固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)的單菌落,接種于5 mL M17液體培養(yǎng)基,37 ℃,厭氧培養(yǎng)24 h,采用TIANamp Bacteria DNA Kit細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA。采用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)對菌株的16S rDNA 進行PCR擴增。本實驗應用的RCR體系(50 μL)包括:細菌基因組DNA 2 μL,27F引物(10 μmoL/L)1 μL,1492R引物(10 μmoL/L)1 μL,10×Easy Taq Buffer 5 μL,Easy Taq polymerase 1 μL,2.5 mmol/L dNTPs 4 μL,ddH2O 36 μL,總體積50 μL。PCR的反應條件為:94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s,51 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,從變性到延伸30個循環(huán);72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。參考試劑盒說明書,將PCR產(chǎn)物連接至pEASY-T1載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞。挑選陽性重組子,37 ℃,200 r/min培養(yǎng)16～18 h后,提取質(zhì)粒,送交生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將測序結(jié)果用NCBI在線BLAST軟件與GenBank中已知的細菌16S rDNA基因序列進行同源性比較,選擇近緣菌株的16S rDNA基因序列,用MEGA X軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 乳酸菌的抗氧化活性測定 挑取分離鑒定出的乳酸菌單菌落于5 mL M17液體培養(yǎng)基中,37 ℃,厭氧培養(yǎng)24 h。8000×g離心20 min,收集培養(yǎng)上清液,轉(zhuǎn)移至新離心管中。將上述步驟離心的菌體沉淀用PBS緩沖液(pH7.4,5 mL)重懸,4 ℃,8000×g離心20 min,取沉淀,重復操作3次。之后將菌體重懸于等體積 PBS緩沖液中,50 Hz冰浴超聲波破碎細胞10 min,之后4 ℃,8000×g,離心30 min,收集上清液即為菌體裂解液。離心后的菌體沉淀經(jīng)PBS緩沖液(pH7.4,5 mL)洗滌,4 ℃,8000×g離心20 min,重復3次。用等體積的PBS緩沖液使菌體重懸,制備為菌體PBS重懸液。

乳酸菌總抗氧化能力根據(jù)總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒的說明書進行。DPPH自由基清除率和羥自由基清除率的測定方法參考文獻[11]。DPPH自由基清除率的測定:取0.5 mL樣品,加入濃度為0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液1 mL,混勻用錫箔紙包裹試劑管在室溫下避光反應30 min,并在10000×g離心1 min,取上清液在517 nm波長處測定吸光度?？瞻捉M以等體積無水乙醇代替DPPH溶液,對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液。DPPH自由基清除率計算見式(1);

式(1)

式中:A0為對照組吸光度;Ai為樣品組吸光度;Aj為空白組吸光度。

羥自由基清除率的測定:取鄰菲啰啉(0.75 mmol/L)1 mL于試管中,依次加入PBS(pH7.4)2 mL,蒸餾水1 mL,充分混勻后,加入FeSO4溶液(2.5 mmol/L)1 mL,混勻加H2O2(質(zhì)量分數(shù)為0.12%)l mL,在37 ℃水浴1.5 h后,在536 nm波長處測定其吸光度Ap;用1 mL蒸餾水代替1 mL H2O2測定其吸光度Ab;用1 mL樣品代替1 mL的蒸餾水測定其吸光度As。羥自由基清除率計算見式(2)

式(2)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

測定結(jié)果均表示為3次平行實驗的平均值±標準偏差(SEM)。試驗結(jié)果采用SPSS 20.0的一般線性模型進行兩因素方差分析,采用Duncan’s方法進行組間的多重比較,差異顯著性水平設置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛酸奶樣品的pH和乳酸菌菌落計數(shù)結(jié)果

牦牛酸奶樣品的pH及主要菌落數(shù)量結(jié)果見表1。由菌落計數(shù)的結(jié)果可知,在本實驗的牦牛酸奶樣品中,乳酸菌占總菌的比例為14.02%。

表1 牦牛酸奶樣品的pH與乳酸菌菌落計數(shù)結(jié)果

2.2 乳酸菌的形態(tài)學鑒定結(jié)果

圖1為分離得到乳酸菌X1的形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果。由圖1可知,從加鈣的M17培養(yǎng)基中分離出1株能夠產(chǎn)生溶鈣圈的乳酸菌X1,挑單菌落于M17液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)并制備涂片,在100倍油鏡下觀察發(fā)現(xiàn),菌株X1呈現(xiàn)球菌形態(tài),一般為單個菌體散在或多個菌體聚集(圖1a),革蘭氏染色為藍紫色,是革蘭氏陽性菌(圖1b)。在M17瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)18～24 h,X1能夠形成較大的圓形菌落,直徑約1～2 mm,表面突起且光滑(圖1c)。

圖1 乳酸菌X1菌落的形態(tài)

2.3 乳酸菌的產(chǎn)酸試驗與生化反應試驗結(jié)果

表2為乳酸菌X1的產(chǎn)酸試驗與生化反應試驗結(jié)果。由表2可知,產(chǎn)酸試驗后乳酸菌培養(yǎng)液的pH為4.24,呈現(xiàn)弱酸性,說明菌株X1具備產(chǎn)酸特性。而過氧化氫酶反應結(jié)果為陰性,也進一步說明菌株X1為乳酸菌。通過生化反應試劑盒對乳酸菌X1與參考菌株G2做了11種底物的生化反應鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸菌X1對七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、棉子糖和乳糖共7種底物反應為陽性。對照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》,菌株X1表現(xiàn)為屎腸球菌生化反應特征,并且與參考菌株屎腸球菌G2的生化反應結(jié)果一致,提示菌株X1可能是一種屎腸球菌。

表2 產(chǎn)酸試驗與生化反應試驗結(jié)果

2.4 乳酸菌的16S rDNA的分子鑒定結(jié)果

乳酸菌X1的PCR擴增結(jié)果見圖2。由圖2可知,利用細菌通用引物對乳酸菌X1的16S rDNA基因進行PCR擴增,獲得片段大小約1500 bp的單一、清晰條帶。經(jīng)克隆測序得到長度為1524 bp的X1菌株16S rDNA序列。經(jīng)BLAST比對,目的條帶與屎腸球菌DSM 20477(NR_114742.1)、屎腸球菌LMG11423(NR_042054.1)、海氏腸球菌ATCC 9790(NR_075022.1)以及杜氏腸球菌98D(NR_036922.1)的同源性均達到了99%。

圖2 16S rDNA擴增片段的2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

利用MEGAX軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖3,由系統(tǒng)發(fā)育樹可知,乳酸菌X1與屎腸球菌DSM20477同屬一個分支,親緣關系最近,與形態(tài)學及生化反應鑒定結(jié)果一致,由此可以確定將菌株X1歸屬于屎腸球菌,命名為屎腸球菌X1(EnterococcusfaeciumX1)。

圖3 乳酸菌X1基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 乳酸菌的抗氧化活性測定結(jié)果

2.5.1 乳酸菌總抗氧化能力 乳酸菌總抗氧化能力測定結(jié)果見圖4。由圖4可知,不同組分之間總抗氧化能力差異明顯,菌株和菌液組分之間存在互作效應(P=0.024)。乳酸菌X1和參考菌株G2各自的培養(yǎng)上清液的總抗氧化能力均顯著高于對應的菌體裂解液和重懸液(P<0.05),兩種菌株的上清液總抗氧化能力都大于0.8 mmol/L(菌株X1為0.86 mmol/L,菌株G2為0.85 mmol/L)。菌株X1與G2相比,菌體裂解液的總抗氧化能力差異顯著(P<0.05)。

圖4 總抗氧化能力的測定結(jié)果

2.5.2 DPPH自由基清除能力 乳酸菌X1對DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果見圖5。由圖5可知,不同組分之間對DPPH自由基的清除能力差異顯著(P<0.05),菌株和菌液組分之間存在互作效應(P=0.001)。菌株X1和參考菌株G2培養(yǎng)基上清液對DPPH自由基清除率最強,均高于60%,兩種菌株培養(yǎng)上清液的DPPH自由基清除率均顯著高于其對應的菌體裂解液和菌體PBS重懸液(P<0.05),說明乳酸菌X1的抗氧化組分主要存在于菌體培養(yǎng)液中。此外,菌體PBS懸液的DPPH自由基清除率顯著高于菌體裂解液(P<0.05),菌體裂解液對DPPH自由基的清除率最低,均低于20%。菌株X1與G2相比,培養(yǎng)上清液與菌體PBS重懸液對DPPH自由基清除能力存在顯著差異(P<0.05)。

圖5 DPPH自由基清除率的測定結(jié)果

2.5.3 羥自由基清除能力 乳酸菌X1對羥自由基清除能力的測定結(jié)果見圖6。由圖6可知,不同組分之間對羥自由基的清除能力差異明顯,菌株和菌液組分之間存在互作效應(P=0.004)。菌株X1和參考菌株G2的菌體PBS重懸液對羥自由基清除率最強,均大于95%。菌株X1和G2的菌體PBS重懸液對羥自由基的清除率均顯著高于培養(yǎng)上清液與菌體裂解液(P<0.05)。菌株X1與參考菌株G2的菌體裂解液羥自由基的清除率存在顯著差異(P<0.05)。

圖6 羥自由基清除率的測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

中國約有1300萬頭牦牛,約占世界牦牛總數(shù)的94%,牦牛數(shù)量、牦牛奶及其奶制品產(chǎn)量均居世界首位[16]。傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶是乳酸菌的良好來源,如西藏地區(qū)牦牛發(fā)酵酸奶中乳酸菌活菌數(shù)量為6.76～9.37 lg CFU/mL,大部分樣品乳酸活菌數(shù)在108CFU/mL以上[17],甘肅和四川地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶制品乳酸菌活菌數(shù)變化范圍在4.00～9.15 lg CFU/mL,大多數(shù)樣品乳酸菌數(shù)在6.00 lg CFU/mL以上[18]。本研究分析了來自于四川甘孜州的發(fā)酵牦牛酸奶樣品,發(fā)現(xiàn)乳酸菌數(shù)量在1.81×108～2.65×108CFU/mL,與西藏地區(qū)牦牛酸奶中乳酸菌含量接近,也高于國家衛(wèi)生標準GB 16321-2003中判定標準(酸奶中的乳酸菌數(shù)≥1×106CFU/mL)。此外,很多報道證實牦牛發(fā)酵酸奶中的乳酸菌種類豐富,如吳均[10]從發(fā)酵酸牦牛乳中篩選出2株堅忍腸球菌和1株干酪乳桿菌,陳明等[11]從牦牛酸奶中篩選出1株植物乳桿菌XM5,張俊等[19]從牦牛酸奶中篩選出了副干酪乳桿菌優(yōu)勢菌株等,上述研究結(jié)果說明牦牛酸奶中具有豐富的可供利用的乳酸菌資源。

屎腸球菌是一類獲得我國農(nóng)業(yè)部、歐盟和聯(lián)合國糧農(nóng)組織批準使用的飼料添加劑,可以作為一種安全的微生態(tài)制劑應用于畜禽飼料,且在一定程度上能夠替代飼用抗生素的使用[20-22]。在畜禽日糧中添加屎腸球菌,可以增強動物對不良環(huán)境的抵抗力,緩解養(yǎng)殖過程中發(fā)生的氧化應激。如丁爽等[23]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加屎腸球菌能顯著提高28日齡斷奶仔豬血清中IgG水平,楊志遠等[24]研究也說明屎腸球菌對維持仔豬腸道菌落平衡、促進養(yǎng)分吸收、增強抗病能力等起著重要作用。此外,馮寶寶等[25]的研究還發(fā)現(xiàn)屎腸球菌可以有效調(diào)節(jié)脂代謝和能量代謝,增強機體的抗氧化性能,胡真真等[26]研究表明屎腸球菌具有改善肉雞小腸絨毛發(fā)育及活性,提高肉雞生長性能的作用。因此,探索牦牛酸奶來源屎腸球菌的體外抗氧化功能,將其開發(fā)為一種天然安全的微生態(tài)制劑,在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中具有廣泛的應用前景。

抗氧化的一個重要機理是清除自由基。動物體內(nèi)的自由基是機體正常的代謝產(chǎn)物,正常情況下處于不斷產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡中,但如果自由基的數(shù)量過多,會破壞細胞結(jié)構,引起脂質(zhì)過氧化,造成氧化應激[27]。常用于評價抗氧化性能的指標有乳酸菌總抗氧化能力、超氧陰離子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、羥自由基的清除能力等[28],本實驗采用平板培養(yǎng)法,在含有2.5% CaCO3的M17培養(yǎng)基上分離出一株乳酸菌,通過16S rDNA分子鑒定以及乳酸菌生化鑒定,確定菌株X1為屎腸球菌。通過測定乳酸菌總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力,對屎腸球菌X1進行抗氧化活性評價,結(jié)果發(fā)現(xiàn)屎腸球菌X1的培養(yǎng)上清液、菌體裂解液、菌體PBS重懸液的總抗氧化能力、對DPPH自由基和羥自由基的清除率存在差異。屎腸球菌X1培養(yǎng)上清液對DPPH自由基的清除率達到63.07%,高于吳貝等[29]研究的華中農(nóng)業(yè)大學屎腸球菌HDRsEf1(56.5%)。屎腸球菌X1菌體裂解液對DPPH自由基的清除率相對較低(8.61%),但高于鞏蕾等[30]研究的屎腸球菌JT1菌體裂解液對DPPH自由基的清除率(8.281%),并且與HDRsEf1菌株菌體裂解液對DPPH自由基無清除作用相比,屎腸球菌X1的菌體和培養(yǎng)上清都具有一定的利用價值。屎腸球菌X1菌懸液對DPPH自由基的清除率處于培養(yǎng)上清液與菌體裂解液之間,但其對羥自由基的清除率大于90%,與吳貝等研究的華中農(nóng)業(yè)大學屎腸球菌HDRsEf1專利菌株相當(94.9%),高于鞏蕾等研究的屎腸球菌JT1菌懸液對DPPH自由基的清除率(23.873%)。菌懸液對羥自由基的清除率較高可能原因為,菌體重懸液中的活細胞會持續(xù)分泌抗氧化物質(zhì),或其細胞膜上附著一些因子會增強對羥自由基的消除能力。綜合來看,屎腸球菌X1的抗氧化物質(zhì)主要存在于菌體培養(yǎng)上清液即其菌體胞外代謝產(chǎn)物中,與王曦等的研究結(jié)果類似[31],可能與特定乳酸菌菌株不同的組分具有相對獨立的抗氧化機制有關[32],菌株X1的具體抗氧化活性成分及其抗氧化機理還未知,有待于進一步深入研究討論。

綜上所述,本研究揭示了發(fā)酵牦牛酸奶來源的屎腸球菌X1具有較好的抗氧化活性,其乳酸菌總抗氧化活性以及DPPH自由基清除活性物質(zhì)主要存在于菌體培養(yǎng)液上清中,這為進一步將其開發(fā)為抗氧化微生態(tài)制劑,并在畜禽生產(chǎn)中應用提供了理論基礎。