固態(tài)枯草芽孢桿菌菌劑的制備工藝研究

趙甜宇,潘朝陽(yáng),張朝輝,孫建安,*,毛相朝,2

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003;2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266237)

枯草芽孢桿菌是一種能形成內(nèi)生抗逆芽孢的革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌,適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng),具有較強(qiáng)的耐酸、耐鹽和耐高溫能力[1-3],且無(wú)毒無(wú)害,廣泛應(yīng)用于生物保鮮、生物防治、環(huán)境保護(hù)、種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、洗滌工業(yè)中[4-9]?？莶菅挎邨U菌列于我國(guó)農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的《飼料添加劑品種目錄(2013)》中,可在動(dòng)物飼料中使用?？莶菅挎邨U菌可以抑制有害菌的生長(zhǎng),調(diào)節(jié)腸道菌群平衡,改善腸道微生態(tài)環(huán)境,提高消化酶活力,促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收,提高免疫力[10-11]。同時(shí),枯草芽孢桿菌還是一種植物根際促生菌,可用作生物肥料,能夠提高作物抗性、促進(jìn)作物生長(zhǎng)、改良土壤、改善作物品質(zhì)[12]。固態(tài)枯草芽孢桿菌菌劑作為一種活菌制劑,易于保藏,運(yùn)輸方便,產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,貨架期長(zhǎng),相較于液態(tài)菌劑有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì),有利于菌劑由實(shí)驗(yàn)室走向?qū)嶋H應(yīng)用[13-15]。

近年來(lái),枯草芽孢桿菌因其無(wú)毒無(wú)害、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在飼料、肥料中廣泛應(yīng)用,其可作為抗生素、化學(xué)肥料和農(nóng)藥的替代品[16-17]。但目前國(guó)內(nèi)外菌劑的制備過(guò)程中,菌株發(fā)酵培養(yǎng)基多采用蛋白胨、酵母粉等,存在成分復(fù)雜、成本較高的缺點(diǎn),且所采用的干燥技術(shù)多為真空冷凍干燥、噴霧干燥等,真空冷凍干燥適用范圍廣、菌體存活率高,但設(shè)備昂貴,耗時(shí)長(zhǎng),操作復(fù)雜[18-19];噴霧干燥技術(shù)操作簡(jiǎn)單,易于連續(xù)化生產(chǎn),但熱消耗大,投資成本高,且高溫不利于菌體的存活[20-21]。因此,如何在菌劑制備過(guò)程中降低能耗成本、縮短制備周期、提高菌劑存活率,對(duì)于枯草芽孢桿菌菌劑的高效制備和推廣應(yīng)用,具有重要的理論價(jià)值和實(shí)際意義。

本研究利用實(shí)驗(yàn)室篩選的高活性益生菌株BacillussubtilisOKF-004進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng),得到一種可獲得高芽孢數(shù)的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件,再通過(guò)載體與保護(hù)劑保護(hù)條件下的鼓風(fēng)干燥,建立一種操作簡(jiǎn)單、成本低廉的固態(tài)微生物菌劑制備工藝,制備的菌劑可作為飼料添加劑和微生態(tài)制劑廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè),又可作為土壤生態(tài)制劑應(yīng)用于種植業(yè),為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用提供了一種可行的菌劑制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 實(shí)驗(yàn)室篩選菌株BacillussubtilisOKF-004;阿根廷紅蝦蝦頭、麩皮、豆粕 青島盛隆偉業(yè)科技有限公司;沸石粉、玉米淀粉 山東優(yōu)索化工科技有限公司;海藻糖、脫脂奶粉、殼聚糖 北京索萊寶科技有限公司;蛋白胨、酵母粉 英國(guó)Oxoid公司;瓊脂粉 索萊寶科技有限公司;葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、氯化鈉 國(guó)藥集團(tuán),均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HFsafe-1200LC(A2)生物安全柜 上海力申科學(xué)儀器有限公司;DK-98-1型恒溫水浴鍋 泰斯儀器有限公司;DXHY-2000恒溫培養(yǎng)搖床 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;GI80TW高壓滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;Labplant Spray Dryer-SD Basic 嘉盛(香港)科技有限公司;DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海樹(shù)立儀器儀表有限公司;DL-7M高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司;5804 R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;ESH105水分測(cè)定儀 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;JYL-C020勻漿機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司;PL202-S電子天平 Metteler Toledo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子液制備 取-20 ℃保藏的枯草芽孢桿菌甘油管菌株,以1%的接種量接種到LB培養(yǎng)基,30 ℃,200 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h,獲得種子液。

1.2.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將種子液按照5%的接種量接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1%玉米淀粉、1%豆粕、1%葡萄糖,自然pH)中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng),每4 h測(cè)定一次芽孢數(shù)。

1.2.3 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 以1%玉米淀粉、1%豆粕、1%葡萄糖為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,選取玉米淀粉、豆粕、葡萄糖的添加量為工藝優(yōu)化因素,分別比較不同添加量的玉米淀粉(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%)、豆粕(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%)、葡萄糖(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%)對(duì)芽孢數(shù)的影響。將種子液按照5%的接種量接種到優(yōu)化培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min培養(yǎng)28 h,測(cè)定芽孢數(shù)。

1.2.3.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定玉米淀粉、豆粕、葡萄糖添加量三個(gè)因素的水平,設(shè)置3因素3水平正交試驗(yàn),每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行,測(cè)定芽孢數(shù),獲得最佳培養(yǎng)基組分。實(shí)驗(yàn)因素和水平詳見(jiàn)表1。

表1 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.2.4 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn) 以優(yōu)化后的發(fā)酵液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌,以初始pH自然、裝液量30 mL、培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量5%為初始培養(yǎng)條件,選取初始pH、裝液量、培養(yǎng)溫度、接種量為優(yōu)化因素,分別設(shè)置不同初始pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、裝液量(20、30、40、50、70 mL)、培養(yǎng)溫度(28、30、32、34、37 ℃)、接種量(2%、4%、6%、8%、10%),200 r/min培養(yǎng)28 h,測(cè)定芽孢數(shù)。

1.2.4.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定初始pH、裝液量、培養(yǎng)溫度、接種量四個(gè)因素的水平,設(shè)置4因素3水平正交試驗(yàn),測(cè)定芽孢數(shù),獲得最佳培養(yǎng)條件。實(shí)驗(yàn)因素和水平詳見(jiàn)表2。

表2 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.2.5 不同干燥方法的比較 噴霧干燥:根據(jù)參考文獻(xiàn)[22-23]并以預(yù)實(shí)驗(yàn)為依據(jù)確定了噴霧干燥參數(shù)。在優(yōu)化后的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)枯草芽孢桿菌28 h,分別添加10%的助劑沸石粉、玉米淀粉,設(shè)置進(jìn)風(fēng)口溫度140 ℃,風(fēng)速50 m3/h,泵速7 mL/min,進(jìn)行噴霧干燥,測(cè)定噴干前后的芽孢數(shù),計(jì)算存活率。

鼓風(fēng)干燥:在優(yōu)化后的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)枯草芽孢桿菌28 h,培養(yǎng)結(jié)束后于4 ℃,5000 r/min離心15 min,將菌泥與生理鹽水以1∶5的比例復(fù)溶制得菌懸液,將載體(沸石粉、玉米淀粉)與菌懸液以1∶2的比例混合均勻,50 ℃烘干6 h,測(cè)定烘干前后的芽孢數(shù),計(jì)算存活率。

1.2.6 鼓風(fēng)干燥制備菌劑的工藝研究

1.2.6.1 載體種類的確定 在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌28 h后,4 ℃,5000 r/min離心15 min,將菌泥與生理鹽水以1∶5的比例復(fù)溶制得菌懸液,將滅菌備用的載體(麩皮、沸石粉、玉米淀粉、阿根廷紅蝦蝦頭粉末)分別與菌懸液以2∶3的比例混合均勻,50 ℃烘干6 h,測(cè)定烘干前后的芽孢數(shù),計(jì)算存活率。

1.2.6.2 載體與菌懸液混合比例的確定 在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌28 h后,4 ℃,5000 r/min離心15 min,將菌泥與生理鹽水以1∶5的比例復(fù)溶,制得菌懸液,將滅菌備用的載體蝦頭粉末與菌懸液以不同比例(5∶3、1∶1、2∶3、1∶2、1∶3)混合均勻,50 ℃烘干6 h,測(cè)定烘干前后的芽孢數(shù),計(jì)算存活率。

1.2.6.3 保護(hù)劑種類的確定 在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌28 h后,4 ℃,5000 r/min離心15 min,將菌泥與不同保護(hù)劑(10%的海藻糖、脫脂奶粉、甘油、可溶性淀粉、殼聚糖)以1∶5的比例復(fù)溶,制得菌懸液,將滅菌備用的載體蝦頭粉末與菌懸液以2∶3的比例混合均勻,50 ℃烘干6 h,測(cè)定烘干前后的芽孢數(shù),計(jì)算存活率。

1.2.6.4 保護(hù)劑濃度的確定 在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌28 h后,4 ℃,5000 r/min離心15 min,將菌泥與不同濃度(0、5%、10%、15%、20%)的甘油以1∶5的比例復(fù)溶,制得菌懸液,將滅菌備用的載體蝦頭粉末與菌懸液以2∶3的比例混合均勻,50 ℃烘干6 h,測(cè)定烘干前后的芽孢數(shù),計(jì)算存活率。

1.2.6.5 菌泥與保護(hù)劑混合比例的確定 在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌28 h后,4 ℃,5000 r/min離心15 min,將菌泥與5%的甘油以不同比例(1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11)復(fù)溶,制得菌懸液,將滅菌備用的載體蝦頭粉末與菌懸液以2∶3的比例混合均勻,50 ℃烘干6 h,測(cè)定烘干前后的芽孢數(shù),計(jì)算存活率。

1.2.6.6 烘干時(shí)間對(duì)芽孢數(shù)的影響 在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌28 h后,4 ℃,5000 r/min離心15 min,將菌泥與5%的甘油以1∶7的比例復(fù)溶,制得菌懸液,將滅菌備用的載體蝦頭粉末與菌懸液以2∶3的比例混合均勻,50 ℃烘干,測(cè)定不同烘干時(shí)間(0、2、4、6、8、10 h)時(shí)的芽孢數(shù)、水分含量。

1.2.7 測(cè)定方法 芽孢數(shù)測(cè)定:液體菌液直接進(jìn)行測(cè)定,固體菌劑參照《農(nóng)用微生物菌劑(GB 20287-2006)》制備成浸提液[24](取2 g固態(tài)樣品加入含有7～10顆玻璃珠的20 mL無(wú)菌水,置于200 r/min的恒溫振蕩器中振蕩30 min即獲得浸提液)后進(jìn)行測(cè)定。采用水浴涂平板法[25],將菌液/浸提液置于80 ℃水浴中維持15 min后,吸取100 μL的菌液/浸提液加入到900 μL無(wú)菌生理鹽水中,混勻制成1∶10樣品勻液,依次做10倍系列稀釋,分別吸取各稀釋度的100 μL稀釋液注入到平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基中,用涂布棒將稀釋液混勻鋪平,倒置,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,選取菌落數(shù)在30～300之間的培養(yǎng)皿計(jì)菌落數(shù)。

菌液中芽孢數(shù)(CFU/mL)=(每皿平均菌體數(shù)×該發(fā)酵液的稀釋倍數(shù)×1000)/100

固體菌劑中芽孢數(shù)(CFU/g)=(每皿平均菌體數(shù)×該浸提液的稀釋倍數(shù)×1000×浸提液體積)/(100×樣品質(zhì)量)

水分含量測(cè)定采用水分測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定,在水分測(cè)定儀將樣品烘干至恒重時(shí)直接從水分測(cè)定儀上讀數(shù)。

將噴干助劑、烘干載體、干燥后收集所得粉劑進(jìn)行稱重,并計(jì)算干燥過(guò)程中的產(chǎn)品得率:

其中,干燥后收集物的質(zhì)量指噴干或烘干后可收集得到樣品的質(zhì)量,干燥前固形物的質(zhì)量是指添加入干燥體系中的助劑或載體的質(zhì)量。

存活率的計(jì)算:

在采用鼓風(fēng)干燥方法制備固體菌劑的過(guò)程中,需經(jīng)過(guò)菌液離心、菌泥復(fù)溶步驟,在離心、復(fù)溶過(guò)程中總芽孢數(shù)的保留率即為芽孢的離心回收率。芽孢回收率的計(jì)算:

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013處理數(shù)據(jù),采用Origin軟件作圖。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行,采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析,采用Minitab 17軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

如圖1所示,在發(fā)酵前12 h,枯草芽孢桿菌產(chǎn)生芽孢緩慢,芽孢數(shù)均較少,低于1×107CFU/mL,這與徐世榮等[26]提到的37 ℃條件下芽孢的形成需要7 h的論述大致一致,芽孢的形成取決于Spo0A基因的表達(dá),而芽孢的形成相對(duì)于基因的表達(dá)具有滯后性[27]。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗,芽孢開(kāi)始迅速形成,12～28 h,芽孢數(shù)快速增加,28 h后又逐漸減少?？莶菅挎邨U菌培養(yǎng)28 h,芽孢數(shù)達(dá)到2.8×109CFU/mL,為了獲得最大數(shù)量的芽孢,此后的優(yōu)化過(guò)程中,采取發(fā)酵28 h收菌,測(cè)定芽孢數(shù)。

圖1 枯草芽孢桿菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

2.2 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 為了獲得低成本、高效率的產(chǎn)孢培養(yǎng)基,經(jīng)實(shí)驗(yàn)初期探索,選取玉米淀粉、豆粕、葡萄糖作為培養(yǎng)基組分,設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn),確定其添加量。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,隨著玉米淀粉、豆粕、葡萄糖含量的增加,芽孢數(shù)均呈先增加后減少的趨勢(shì),說(shuō)明三種物質(zhì)的濃度過(guò)高或過(guò)低均不適于芽孢的形成。玉米淀粉含量為2%時(shí),芽孢數(shù)最多(圖2a),與其他添加量相比,芽孢數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。豆粕添加量的改變對(duì)芽孢數(shù)的影響較大,豆粕添加量為3%時(shí),芽孢數(shù)最多,可達(dá)到4.4×109CFU/mL(圖2b),且與其他組相比,芽孢數(shù)具有顯著性差異(P<0.05)。多于或少于2.5%的葡萄糖含量均不適合芽孢最大量的形成,葡萄糖含量為2.5%時(shí),芽孢數(shù)量最多(圖2c),與其他添加量相比具有顯著性差異(P<0.05)。綜合考慮,玉米淀粉添加量、豆粕添加量、葡萄糖添加量分別選擇為2%、3%、2.5%。

圖2 玉米淀粉(a)、豆粕(b)、葡萄糖(c)添加量對(duì)芽孢數(shù)的影響

2.2.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以芽孢數(shù)為指標(biāo),針對(duì)玉米淀粉、豆粕、葡萄糖添加量設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3與表4所示。各因素對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響大小為A>B>C,即影響枯草芽孢桿菌產(chǎn)孢的因素依次為玉米淀粉>豆粕>葡萄糖。通過(guò)分析,培養(yǎng)基最佳方案為A3B2C1,即玉米淀粉2.5%、豆粕3%、葡萄糖2%。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確定,此時(shí)芽孢數(shù)達(dá)到3.9×109CFU/mL。

表3 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的方差分析

2.3 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)條件單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。培養(yǎng)基初始pH為5.0時(shí),嚴(yán)重抑制芽孢的形成,與中性、堿性培養(yǎng)條件相比,芽孢數(shù)具有極顯著差異(P<0.01),說(shuō)明過(guò)酸條件不利于枯草芽孢桿菌形成芽孢,在中性、堿性條件下,芽孢數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05),當(dāng)初始pH為6.0時(shí),芽孢數(shù)最多(圖3a)。裝液量為20、30、40、50 mL時(shí),芽孢數(shù)均具有顯著性差異(P<0.05),裝液量過(guò)多不利于產(chǎn)孢,過(guò)多的裝液量與正常裝液量相比,可使芽孢數(shù)降低一個(gè)數(shù)量級(jí),這可能是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌為好氧細(xì)菌,裝液30 mL時(shí),芽孢數(shù)最多(圖3b)。由圖3c可知,培養(yǎng)溫度過(guò)高亦抑制芽孢形成,34、37 ℃時(shí)與其他溫度條件下的芽孢數(shù)相比均具有極顯著差異(P<0.01),在28～32 ℃較適宜產(chǎn)孢,培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí),芽孢數(shù)量最多。接種量影響菌體生長(zhǎng)代謝速率,過(guò)高或過(guò)低的接種量均不適合芽孢的形成[28],接種8%的菌液時(shí),芽孢數(shù)最多(圖3d)且具有顯著性差異(P<0.05)。綜合考慮,pH、裝液量、溫度、接種量分別選擇為6、30 mL、30 ℃、8%。

圖3 pH(a)、裝液量(b)、溫度(c)、接種量(d)對(duì)芽孢數(shù)的影響

2.3.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以芽孢數(shù)為指標(biāo),設(shè)計(jì)初始pH、裝液量、培養(yǎng)溫度、接種量四個(gè)因素的三水平實(shí)驗(yàn),由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表5、表6可知,各因素對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響大小為A>B>D>C,即影響枯草芽孢桿菌產(chǎn)孢的因素依次為初始pH>裝液量>接種量>溫度。通過(guò)分析,培養(yǎng)條件最佳方案為A3B2C3D1,即初始pH為6.5、裝液量30 mL、溫度32 ℃、接種量7%。

表5 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件的方差分析

設(shè)計(jì)培養(yǎng)條件為初始pH6.5、裝液量30 mL、溫度32 ℃、接種量7%的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確定,在最優(yōu)培養(yǎng)條件下,芽孢數(shù)可達(dá)到1.10×1010CFU/mL,比吳東等[29]研究的用于制備菌劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)所得生物量7.90×109CFU/mL更高,且培養(yǎng)基組分簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉。

2.4 菌劑制備工藝研究

2.4.1 不同干燥方法的比較 目前常用的干燥技術(shù)有真空冷凍干燥、噴霧干燥、鼓風(fēng)干燥、微波真空干燥等。由于真空冷凍干燥、微波真空干燥的時(shí)間成本、運(yùn)行成本較高[25],不適合商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn),本實(shí)驗(yàn)選取噴霧干燥、鼓風(fēng)干燥兩種干燥方式進(jìn)行比較,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示。菌液噴霧干燥后,所得菌劑所含芽孢數(shù)較多,沸石粉為助劑進(jìn)行噴干,產(chǎn)品中芽孢數(shù)為8.8×109CFU/g,以玉米淀粉為助劑進(jìn)行噴霧干燥,芽孢數(shù)可達(dá)到1010CFU/g,且得率較沸石粉高,但也僅為34.33%。鼓風(fēng)干燥實(shí)驗(yàn),以沸石粉為載體進(jìn)行烘干所得菌劑的芽孢數(shù)較玉米淀粉為載體的高,為4.5×109CFU/g,且鼓風(fēng)干燥得率較高,固形物基本無(wú)損失?？紤]到噴霧干燥的熱能、電能消耗較高,且得率較低,接下來(lái)針對(duì)鼓風(fēng)干燥進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化。

表7 不同干燥方法制備菌劑

2.4.2 鼓風(fēng)干燥制備菌劑的工藝研究

2.4.2.1 載體種類的確定 選取合適的基質(zhì)作為吸附菌液的載體,才能夠保證菌劑的產(chǎn)品質(zhì)量和使用效果[25,30]。本實(shí)驗(yàn)選取沸石粉、玉米淀粉、麩皮粉末、蝦頭粉末作為干燥載體,從圖4可以看出,蝦頭粉末作為烘干載體時(shí),較其他載體的存活率高,且超過(guò)100%,這可能是因?yàn)樵诤娓蛇^(guò)程中原本的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞因環(huán)境變得惡劣而休眠,形成了芽孢,也可能是蝦頭作為一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),有利于菌體在溫度不高的烘干過(guò)程中再次增殖。蝦類廢棄物含有甲殼素、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、鈣鹽等有價(jià)值的化合物,然而大多蝦副產(chǎn)物卻未能利用[31]。蝦類廢棄物日益增加,造成了嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題,因此,若能將其作為微生物菌劑載體進(jìn)行高值化利用,具有重要意義[32]。由于本研究的目的是獲得成本低廉且含高芽孢數(shù)的菌劑,因此,本實(shí)驗(yàn)選取蝦頭粉末作為載體,進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn),同時(shí)可實(shí)現(xiàn)蝦頭的高值化利用。

圖4 載體種類對(duì)菌體存活率的影響

2.4.2.2 載體與菌懸液混合比例的確定 將載體與菌懸液以不同的配比進(jìn)行混合,找到最適配比以取得最高的存活率。由圖5可知,隨著載體添加量的減少,存活率呈先升高后降低的趨勢(shì)。在一定范圍內(nèi),菌懸液添加量的增多引起菌體與載體結(jié)合的增多,存活率增大,當(dāng)載體與菌懸液以2∶3的比例混合時(shí),存活率最高。當(dāng)菌懸液添加量增大到一定程度,載體過(guò)飽和,菌體無(wú)法與之結(jié)合,使得存活率降低,載體與菌懸液以1∶3的比例混合時(shí),可觀察到有少許菌液無(wú)法吸附。因此,載體與菌懸液比例選擇為2∶3 g/mL。

圖5 載體與菌懸液混合比例對(duì)菌體存活率的影響

2.4.2.3 保護(hù)劑種類的確定 在干燥過(guò)程中,細(xì)胞因脫水引起滲透壓增高、細(xì)胞萎縮、蛋白質(zhì)變性從而導(dǎo)致菌體死亡[33]。如圖6所示,添加海藻糖、脫脂奶粉、甘油作為保護(hù)劑,相對(duì)于直接用生理鹽水復(fù)溶的菌體存活率高,以甘油為保護(hù)劑,存活率最高。甘油作為一種滲透性保護(hù)劑[34],能夠進(jìn)入細(xì)胞,維持其滲透壓,同時(shí)其帶有的羥基能夠取代水分子與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)形成氫鍵,維持、保護(hù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[35-36]。可溶性淀粉、殼聚糖作為保護(hù)劑時(shí),存活率低于生理鹽水復(fù)溶的菌懸液,可能是因?yàn)闅ぞ厶菧缇蟮娜芙庑暂^差,未能完全發(fā)揮作用造成的,而可溶性淀粉滅菌冷卻后呈凝膠狀,不利于操作的進(jìn)行。因此,保護(hù)劑選擇為甘油。

圖6 保護(hù)劑種類對(duì)菌體存活率的影響

2.4.2.4 保護(hù)劑濃度的確定 如圖7所示,甘油的加入可以提高菌體存活率,甘油濃度為5%時(shí),存活率最高,隨著甘油濃度的增大,存活率開(kāi)始降低,這可能與滲透壓升高有關(guān),且20%的甘油由于濃度過(guò)高,添加后使產(chǎn)品變得粘膩。因此,保護(hù)劑濃度選擇為5%。

圖7 保護(hù)劑濃度對(duì)菌體存活率的影響

2.4.2.5 菌泥與保護(hù)劑混合比例的確定 由圖8可知,在一定范圍內(nèi),菌泥與保護(hù)劑的比例比值越小,即保護(hù)劑的添加量越多,存活率越高,因?yàn)楸Ｗo(hù)劑添加量不足會(huì)使得大量菌體因裸露而得不到保護(hù),影響存活率。菌泥與甘油的質(zhì)量/體積混合比例為1∶7時(shí),存活率最高,隨著比值繼續(xù)減小,存活率降低。這可能是因?yàn)榫嗯c保護(hù)劑的混合比例不同引起的菌體周圍保護(hù)劑濃度的變化,過(guò)高的濃度會(huì)影響枯草芽孢桿菌細(xì)胞的滲透壓和通透性,從而導(dǎo)致存活率不高[28,36]。因此,菌泥與保護(hù)劑混合比例選擇為1∶7 g/mL。

圖8 菌泥與保護(hù)劑混合比例對(duì)菌體存活率的影響

2.4.2.6 烘干時(shí)間對(duì)芽孢數(shù)的影響 如圖9所示,隨著烘干時(shí)間的增加,固態(tài)發(fā)酵樣品的水分含量逐漸降低,并在6 h后基本穩(wěn)定。隨著烘干時(shí)間的延長(zhǎng)、水分含量的降低,單位質(zhì)量中的干物質(zhì)增加,則單位質(zhì)量中的活菌數(shù)隨之增加,并在6 h后,活菌數(shù)趨于穩(wěn)定,考慮到時(shí)間成本,可選擇烘干時(shí)間6 h作為制備菌劑的最佳時(shí)間。

圖9 烘干時(shí)間對(duì)芽孢數(shù)、菌劑水分含量的影響

2.4.2.7 菌劑制備過(guò)程 通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定了菌劑制備工藝后,對(duì)菌劑制備過(guò)程進(jìn)行了整理,如表8所示,以便對(duì)制備工藝整體把握,明確各步驟指標(biāo),有利于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。本研究中的離心、復(fù)溶步驟芽孢回收率僅54.65%,與嚴(yán)美婷[26]提到的93.07%的納豆菌活菌回收率相比較低,今后的研究可針對(duì)離心步驟進(jìn)行優(yōu)化,以減小離心過(guò)程帶來(lái)的損失。本研究通過(guò)鼓風(fēng)干燥所得固體菌劑芽孢數(shù)為4.8×109CFU/g,雖然與周亮成等[37]研究的枯草芽孢桿菌BSF01菌劑、王群[38]研究的菌劑相比芽孢數(shù)不算高,但以蝦頭粉末作為載體營(yíng)養(yǎng)多、價(jià)格低,有利于蝦頭的高值化利用。

表8 菌劑制備過(guò)程

3 討論與結(jié)論

本文通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn),探究了液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的最適形成芽孢的培養(yǎng)基組分與培養(yǎng)條件,優(yōu)化結(jié)果表明,采用2.5%玉米淀粉、3%豆粕、2%葡萄糖的培養(yǎng)基,在初始pH為6.5、裝液量30 mL、溫度32 ℃、接種量7%的條件下培養(yǎng)枯草芽孢桿菌時(shí),最適合形成芽孢,芽孢數(shù)最高可達(dá)到1.1×1010CFU/mL。另外,本文經(jīng)過(guò)對(duì)噴霧干燥與鼓風(fēng)干燥兩種制備固態(tài)微生物菌劑方法的比較,研究了通過(guò)鼓風(fēng)干燥方法制備菌劑的工藝流程,結(jié)果表明,將菌泥與濃度5%的保護(hù)劑甘油以1∶7 g/mL的比例復(fù)溶后制成菌懸液,以蝦頭作為烘干載體,將載體與菌懸液以2∶3 g/mL的比例混合后,于50 ℃烘干6 h,所得菌劑存活率最好,可達(dá)140.91%。液態(tài)發(fā)酵菌液含枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)為(0.8～1.1)×1010CFU/mL,根據(jù)原料市購(gòu)價(jià)格計(jì)算,得到液態(tài)發(fā)酵菌液原料成本為0.2元/L;本菌劑產(chǎn)品為紅棕色粉末狀物質(zhì),枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)為(3.2～6.3)×109CFU/g,非微生物成分為蝦頭和甘油,根據(jù)原料市購(gòu)價(jià)格可知,得到固態(tài)菌劑成品的原料成本為2.2元/kg。與陳晶等[39]研究的B8干粉菌劑0.19元/g,賈濤等[3]提到的復(fù)合型微生態(tài)產(chǎn)品價(jià)格30元/kg相比,本研究制備的菌劑具有一定價(jià)格優(yōu)勢(shì)。本文研究的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、發(fā)酵周期短、培養(yǎng)芽孢數(shù)量高,固態(tài)微生物菌劑的制備方法簡(jiǎn)便、易于操作、成本低廉,適合工業(yè)化生產(chǎn),且其原料豆粕、玉米淀粉、蝦頭等物質(zhì)綠色且易于獲取,本工藝可將其高值化,應(yīng)用于飼料添加劑、生物肥料當(dāng)中,具有實(shí)際意義。