產(chǎn)單寧酶乳酸菌發(fā)酵紅豆、扁豆酸面團(tuán)的生化特性及其對(duì)饅頭體外消化的影響

馬子琳,曹偉超,張賓樂,武 盟,羅 昆,鄭建仙,黃衛(wèi)寧,*,李 寧,Filip Arnaut

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510641;3.廣州焙樂道食品有限公司,廣東廣州 511400)

豆類是一種重要的膳食蛋白質(zhì)來源,并且能夠提供碳水化合物、膳食纖維、維生素和人體健康所需的礦物質(zhì),具有很高的營養(yǎng)價(jià)值[1-2]。饅頭是中國傳統(tǒng)的主食之一,具有鮮明的民族特色[3],將豆類應(yīng)用在饅頭體系中可以增強(qiáng)饅頭的營養(yǎng),增加饅頭種類,拓寬消費(fèi)市場。然而,豆類屬于不含有面筋的無麩質(zhì)體系,制作出的面團(tuán)無法形成持氣的網(wǎng)絡(luò)[4],導(dǎo)致制作出的饅頭比容變小,硬度增加,適口性下降[5],同時(shí)豆類中含有較多的抗?fàn)I養(yǎng)因子[6],包含單寧、植酸、寡糖等,會(huì)不同程度影響人體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[7],如單寧可以與蛋白質(zhì)、糖、消化酶等結(jié)合,形成難以被消化吸收復(fù)合物[8],這些方面限制了豆類在饅頭體系中的應(yīng)用。

酸面團(tuán)是由谷物、水和活性酵母菌或乳酸菌相互作用形成的一種面團(tuán)[9],在食品中具有悠久的應(yīng)用歷史。通過酸面團(tuán)發(fā)酵技術(shù)可以改善面團(tuán)的流變特性、增強(qiáng)風(fēng)味、改善饅頭比容、質(zhì)構(gòu)及貨架期[10-11]。此外,一些乳酸菌在酸面團(tuán)發(fā)酵過程中還會(huì)產(chǎn)生能夠降解抗?fàn)I養(yǎng)因子的酶類[12],如單寧酰基水解酶、植酸酶、α-半乳糖苷酶等,可以有效降低豆類中的抗?fàn)I養(yǎng)因子[13],從而減弱其對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的不良影響。而已有研究發(fā)現(xiàn)存在乳酸菌具有降解單寧的能力,如Osawa等[14]就從日本傳統(tǒng)發(fā)酵食品等原料中成功分離出了若干株單寧酶陽性的植物乳桿菌與戊糖片球菌,Vaquero等[15]從葡萄汁和葡萄酒中分離出了多株具有單寧酶活性的植物乳桿菌,Apinun等[16]則對(duì)來自泰國傳統(tǒng)發(fā)酵茶葉的戊糖乳桿菌所產(chǎn)的單寧酶進(jìn)行了研究。應(yīng)用這類產(chǎn)酶乳酸菌進(jìn)行酸面團(tuán)發(fā)酵或能減弱豆類單寧帶來的不利影響。

本課題組前期已從自然發(fā)酵的豆粉中分離篩選出一株高產(chǎn)單寧酶乳酸菌D23,經(jīng)鑒定為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)。本研究以紅豆、扁豆為研究基質(zhì),利用該株高產(chǎn)單寧酶乳酸菌進(jìn)行酸面團(tuán)發(fā)酵制備兩種豆類饅頭,旨在研究該株降解單寧乳酸菌對(duì)紅豆、扁豆酸面團(tuán)生化特性以及饅頭產(chǎn)品體外消化的影響,為開發(fā)以乳酸菌作為天然發(fā)酵劑的豆類饅頭提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅豆粉、扁豆粉 市售;發(fā)酵乳桿菌D23 分離自自然發(fā)酵豆粉;美玫牌低筋小麥粉 香港面粉廠有限公司;即發(fā)活性干酵母 樂斯福有限公司;MRS肉湯培養(yǎng)基 杭州百思生物技術(shù)有限公司;兒茶素、齊墩果酸 上海源葉生物科技有限公司;α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、茚三酮、高氯酸、三氟乙酸、乙腈等 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型) 碧云天生物技術(shù)有限公司。

潔凈工作臺(tái) 山東博科科學(xué)儀器有限公司;APX-150C型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海博迅集團(tuán)有限公司;LPZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;JYD-900L超聲波細(xì)胞粉碎儀 上海之信儀器有限公司;Scientz-10ND冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;FE-20 pH計(jì) 梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 京普析通用儀器有限責(zé)任公司;SM-25攪拌機(jī)、起酥機(jī)、SPC-40SP醒發(fā)箱 新麥機(jī)械(無錫)公司;MZ-SYH26-CB美的中式電蒸鍋 廣東美的生活電器制造有限公司;1525高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC) 美國Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅豆、扁豆酸面團(tuán)的制備及發(fā)酵特性

1.2.1.1 酸面團(tuán)的制備 將發(fā)酵乳桿菌D23活化兩代培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,將菌液以10000 r/min離心5 min,用無菌生理鹽水洗滌2次后得獲得菌泥。用稱量好的無菌水溶解菌泥后分別與紅豆、扁豆粉混合攪拌均勻(使酸面團(tuán)初始接種量達(dá)到107CFU/g),酸面團(tuán)DY值紅豆為250,扁豆為300。制作好的酸面團(tuán)于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。DY值指制作酸面團(tuán)時(shí)粉與水的質(zhì)量比,其計(jì)算公式如下:DY值=[m(粉)+m(水)/m(粉)]×100。

1.2.1.2 酸面團(tuán)的pH、總可滴定酸度(TTA)以及菌落數(shù)(CFU)的測(cè)定 分別取10 g不同發(fā)酵時(shí)間(0、4、8、12、16、20、24 h)的酸面團(tuán)放入錐形瓶中,加入90 mL去離子水,磁力攪拌30 min,靜置10 min,測(cè)定pH。用0.1 mol/L的NaOH滴定至pH達(dá)到8.6,消耗的NaOH的毫升數(shù)即為總可滴定酸度。同時(shí)取10 g不同發(fā)酵時(shí)間的酸面團(tuán),加入90 mL無菌生理鹽水混合均勻,在無菌操作臺(tái)將混合懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋,然后選取10-5～10-8的稀釋梯度,取100 μL涂布于MRS固體平板上,37 ℃培養(yǎng)48 h進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[3]。

1.2.1.3 酸面團(tuán)凍干樣品的制備 分別取不同發(fā)酵時(shí)間(0、4、8、12、16、20、24 h)的酸面團(tuán)樣品于塑封袋中,置于-80 ℃冰箱中冷凍后,放入冷凍干燥機(jī)中凍干3～4 d,取出凍干樣品研磨成粉,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 酸面團(tuán)發(fā)酵前后抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的變化

1.2.2.1 縮合單寧含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取1.0 g酸面團(tuán)凍干樣品,用10 mL鹽酸∶甲醇(1∶100)在室溫下振蕩提取2.5 h,并以4000 r/min離心20 min,取上清液。采用香草醛法[17]對(duì)樣品中縮合單寧的含量進(jìn)行測(cè)定。使用兒茶素來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定結(jié)果以兒茶素當(dāng)量表示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0.968x-0.0266,R2=0.9973。

1.2.2.2 植酸含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取0.5～1.0 g酸面團(tuán)凍干樣品于離心管中,加入20 mL HCl溶液(0.5 mol/L)在室溫下以150 r/min振蕩提取植酸3 h,6000 r/min離心20 min取上清作為提取液。取1 mL提取液,加入2 mL NH4Fe(SO4)2溶液(0.02%),沸水浴反應(yīng)30 min后用冰水冷卻,再次6000 r/min離心15 min。取上清液2.0 mL于試管中,加入3.0 mL雙吡啶溶液(1%),搖勻,在10 min內(nèi)于519 nm處測(cè)定吸光度[18],用HCl溶液溶解植酸標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的植酸含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=-4.2057x+0.9582,R2=0.9983。

1.2.2.3 皂苷含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取1.0 g酸面團(tuán)凍干樣品于離心管中,加入20 mL 75%乙醇,以250 W功率超聲處理20 min,加熱振蕩1 h,6000 r/min離心20 min取上清液,低溫?fù)]干乙醇后用甲醇溶解定容,作為待測(cè)液。根據(jù)婁在祥等[19]的方法對(duì)樣品中皂苷的含量進(jìn)行測(cè)定,吸取待測(cè)樣品液50 μL于試管中,在70 ℃水浴下?lián)]干甲醇,加入0.2 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液以及0.8 mL高氯酸,搖勻后于56 ℃水浴下保溫20 min,取出立即冰水冷卻,再加入5 mL冰乙酸,搖勻,于波長547 nm處測(cè)定吸光度值,用甲醇溶解齊敦果酸標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算樣品中的皂苷含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0.0072x-0.0144,R2=0.9962。

1.2.2.4 棉子糖含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取5.0 g酸面團(tuán)凍干樣品,加入23.75 mL超純水,混勻后以300 W功率超聲20 min,加入50%(w/v)三氯乙酸(TCA)溶液1.25 mL,置于4 ℃冰箱中靜置30 min,再于4 ℃、12000 r/min冷凍離心20 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜后,利用高效液相色譜儀測(cè)定樣品中棉子糖的含量。HPLC條件[20]:XBridge BEH Amide柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國沃特世);示差檢測(cè)器;流動(dòng)相為70%(v/v)乙腈,流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:30 ℃。使用棉子糖標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和樣品測(cè)得的峰面積計(jì)算樣品中的棉子糖含量。

1.2.3 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中α-淀粉酶酶活與α-氨基態(tài)氮含量的變化

1.2.3.1 酸面團(tuán)中α-淀粉酶活力的測(cè)定 根據(jù)Wang等[21]的方法進(jìn)行一些修改,使用DNS法測(cè)定酸面團(tuán)中α-淀粉酶活力。稱取1.0 g酸面團(tuán)凍干樣品,與20 mL去離子水振蕩混勻,1000 r/min離心取上清液進(jìn)行測(cè)定。酶活力定義為:在37 ℃下,淀粉酶每分鐘水解淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。根據(jù)測(cè)得的葡萄糖含量計(jì)算出酸面團(tuán)中的α-淀粉酶活力。

1.2.3.2 酸面團(tuán)中α-氨基態(tài)氮的測(cè)定 使用改進(jìn)的茚三酮法測(cè)定酸面團(tuán)中α-氨基態(tài)氮含量,來表征酸面團(tuán)中的蛋白酶活力情況。將1.0 g酸面團(tuán)凍干樣品與4 mL的7%高氯酸混合,并在4 ℃下保存1 h。8000 r/min離心10 min,取0.8 mL上清液,加入0.6 mL 0.43 mol/L KOH溶液以沉淀高氯酸,同樣條件再次離心,上清液即為測(cè)定液。配制試劑I(1 L H2O,50 g Na2HPO4·2H2O,60 g KH2PO4,0.5 g茚三酮,3 g果糖,pH6.7)以及試劑Ⅱ(600 mL H2O,400 mL 96%乙醇,2 g KIO3)。取200 μL測(cè)定液,加入500 μL試劑I、950 μL去離子水,將混合物在100 ℃下水浴加熱16 min,反應(yīng)結(jié)束后冰浴冷卻,再加入2.5 mL試劑Ⅱ,并在570 nm下測(cè)量樣品的吸光度[22]。使用甘氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0.3134x+0.0177,R2=1。

1.2.4 酸面團(tuán)發(fā)酵前后多肽分子量變化 準(zhǔn)確稱取1.0 g酸面團(tuán)凍干樣品,用乙腈∶水∶三氟乙酸=40∶60∶0.1 (v∶v∶v)充分溶解定容到50 mL,6000 r/min離心15 min取上清液過0.22 μm濾膜至液相進(jìn)樣瓶中。使用Waters 1525 EF高效液相色譜儀進(jìn)行分析,HPLC條件[23]:體積排阻色譜柱TSKgel 2000SWXL(300 mm×7.8 mm,5 μm,日本東曹);流動(dòng)相:乙腈∶水∶三氟乙酸=40∶60∶0.1 (v∶v∶v);紫外檢測(cè)器:220 nm;流速:0.5 mL/min;柱溫:30 ℃。

1.2.5 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中游離總酚及游離氨基酸含量的變化

1.2.5.1 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中游離總酚的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取1.0 g酸面團(tuán)凍干樣品于離心管中,加入在70 ℃預(yù)熱好的70%甲醇5 mL,充分混勻,放入70 ℃水浴鍋中浸提20 min,每5 min搖勻一次,之后冷卻至室溫,6000 r/min下離心20 min,取上清液至10 mL容量瓶中,殘?jiān)儆? mL 70%甲醇提取一次,重復(fù)操作,合并提取液定容至10 mL容量瓶中,搖勻待測(cè),采用福林酚法[24],對(duì)提取液中的游離總酚含量進(jìn)行測(cè)定。使用沒食子酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,游離總酚含量以沒食子酸當(dāng)量計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0.0053x+0.0115,R2=0.9987。

1.2.5.2 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中游離氨基酸的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取1.0 g酸面團(tuán)凍干樣品于25 mL容量瓶中,用5%(w/v)三氯乙酸(TCA)定容,混勻后超聲波超聲1 h,雙層濾紙過濾,濾液10000 r/min離心30 min,取上清液過0.22 μm水膜至色譜進(jìn)樣瓶中。使用Agilent 1100液相色譜儀進(jìn)行分析。HPLC條件[25]:ODS Hypersil色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:醋酸鈉∶甲醇∶乙腈=1∶2∶2 (v∶v∶v),流速1.0 mL/min,柱溫:40 ℃;紫外檢測(cè)器:338 nm。

1.2.6 紅豆、扁豆酸面團(tuán)饅頭的制備以及淀粉、蛋白質(zhì)體外消化率

1.2.6.1 饅頭的制備 各組饅頭的配方如表1所示。

表1 各組豆粉饅頭配方

將原料小麥粉、豆粉/酸面團(tuán)、水、糖以及酵母倒入攪拌剛中慢速攪拌4 min使面粉與水充分混合(提前將糖溶于水,酸面團(tuán)組則提前溶于水和酸面團(tuán)),加入起酥油再慢速攪拌1 min,之后快速攪打4 min至面團(tuán)表面光滑,將面團(tuán)揉圓后覆膜松弛5 min,用起酥機(jī)反復(fù)壓片20～25次。切分面團(tuán)40 g/個(gè),整形搓圓后于38 ℃,85% RH醒發(fā)箱中醒發(fā)60 min,醒發(fā)好后大火蒸制15 min,關(guān)火后靜置5 min,取出饅頭室溫下靜置1 h,將饅頭樣品裝在塑封袋中用1.2.1.3中所述的方法凍干后干燥保存,用于后續(xù)測(cè)定。

1.2.6.2 饅頭中淀粉的體外消化率 準(zhǔn)確稱取饅頭凍干樣品1.0 g于錐形瓶中,加入15 mL pH5.2的磷酸鹽緩沖液和7顆玻璃珠,模擬胃腸道的蠕動(dòng)環(huán)境,在37 ℃水浴5 min。加入配制并預(yù)熱好的混合酶液(α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶)5 mL,分別在加入酶液后的0、2、5、10、20、30、60、120、180 min取0.5 mL樣品,加入4 mL 80%乙醇進(jìn)行滅酶處理,然后8000 r/min離心10 min,用DNS法測(cè)定上清液中的葡萄糖含量,計(jì)算出淀粉的體外消化率[26]。

1.2.6.3 饅頭中蛋白質(zhì)的體外消化率 準(zhǔn)確稱取饅頭凍干樣品1.0 g于錐形瓶中,加入7顆玻璃珠,再加入配制好的胃蛋白酶溶液15 mL,于37 ℃下振蕩搖勻進(jìn)行酶解,取消化時(shí)間0、15、30、60、90、120 min的消化液0.5 mL。到120 min后,用0.5 mol/L NaOH將待測(cè)液pH調(diào)為7.0以鈍化胃蛋白酶活性,然后加入胰蛋白酶溶液10 mL繼續(xù)消化,同樣在第0、30、60、90、120 min取消化液樣品0.5 mL,取出的樣品加入4 mL 10% TCA以滅酶并沉淀未被降解的大分子蛋白質(zhì),8000 r/min離心10 min取上清[27]。用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液及完全酶解樣品中的蛋白質(zhì)濃度,并計(jì)算蛋白質(zhì)的體外消化率,體外消化率(%)=上清液中的蛋白質(zhì)濃度/樣品中總蛋白質(zhì)濃度×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次測(cè)試重復(fù)三次,采用Origin 9.0、Microsoft Office Excel 2013和SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,利用方差分析法(ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,顯著性差異水平取P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸面團(tuán)的pH、總可滴定酸度(TTA)以及菌落數(shù)(CFU)

圖1顯示了乳酸菌D23在三種豆類基質(zhì)的發(fā)酵過程中酸度以及菌落數(shù)的變化情況。由于乳酸菌在生長的過程中會(huì)釋放大量乳酸、乙酸等有機(jī)酸[28],所以在發(fā)酵的過程中酸面團(tuán)的pH逐漸降低,TTA逐漸升高(圖1a),至發(fā)酵24 h時(shí),紅豆、扁豆酸面團(tuán)的最終pH分別達(dá)到了4.34、4.16,最終TTA分別達(dá)到了21.0、23.8 mL,這與Curiel等研究者[13]在扁豆、鷹嘴豆、豌豆等豆類基質(zhì)中的研究結(jié)果類似,其測(cè)定的豆類酸面團(tuán)發(fā)酵24 h后pH為4.0～4.4,TTA范圍為20.4～27.0 mL。由圖1b可知,在發(fā)酵的過程中,菌株D23在紅豆、扁豆酸面團(tuán)中前0～4 h為對(duì)數(shù)生長期,4 h后進(jìn)入了穩(wěn)定生長期,在生長至24 h時(shí)菌落數(shù)分別增長到了7.83、7.88 lg CFU/g,保持穩(wěn)定的生長狀態(tài)。

圖1 菌株D23分別在紅豆、扁豆酸面團(tuán)中的pH、TTA(a)與CFU(b)

2.2 酸面團(tuán)發(fā)酵前后抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的變化

由表2可知,在兩種豆類酸面團(tuán)發(fā)酵后,縮合單寧、植酸、棉子糖、皂苷四種抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量都顯示了不同程度的下降,其中紅豆、扁豆的縮合單寧含量分別顯著(P<0.05)下降了57.87%、53.54%,紅豆酸面團(tuán)中的降解程度更高,并且扁豆酸面團(tuán)的降解效果優(yōu)于Curiel等[13]使用植物乳桿菌和短乳桿菌發(fā)酵扁豆酸面團(tuán)的研究結(jié)果。這可能與D23菌株能夠在含有單寧的基質(zhì)中產(chǎn)生單寧酶有關(guān),其產(chǎn)生的單寧?；饷缚梢詫螌庮愇镔|(zhì)降解為小分子酚酸與多元醇,相比普通乳酸菌的發(fā)酵作用具有更顯著的降解效果。其他三種抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量也都發(fā)生了顯著(P<0.05)的下降,在紅豆酸面團(tuán)中,發(fā)酵前后植酸、棉子糖、皂苷的含量分別下降了8.04%、30.43%、11.91%,在扁豆酸面團(tuán)中則分別下降了38.52%、35.14%、15.29%,這可能是由于酸面團(tuán)的酸化作用,激活了豆類原料所攜帶的內(nèi)原酶,如植酸酶、α-半乳糖苷酶等,并且酸面團(tuán)中微生物代謝過程中也會(huì)在環(huán)境的誘導(dǎo)下產(chǎn)生這些酶類,在一定程度上降解了對(duì)應(yīng)的抗?fàn)I養(yǎng)因子[12]。總體上經(jīng)過D23菌株的酸面團(tuán)的發(fā)酵作用,紅豆、扁豆這兩類豆類基質(zhì)中的抗?fàn)I養(yǎng)因子水平,尤其是縮合單寧含量,出現(xiàn)了大幅的下降。

表2 酸面團(tuán)發(fā)酵前后抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的變化

2.3 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中α-淀粉酶酶活與α-氨基態(tài)氮含量的變化

圖2表示了酸面團(tuán)發(fā)酵過程中α-淀粉酶活圖2a與α-氨基態(tài)氮含量圖2b的變化情況,從圖2a中可以看出,在酸面團(tuán)發(fā)酵過程中,兩種豆類基質(zhì)中的α-淀粉酶活力都呈現(xiàn)出了先增加后降低的趨勢(shì),在前4 h內(nèi),紅豆和扁豆酸面團(tuán)中的α-淀粉酶活力緩慢增加,與菌株的生長特性保持一致,4 h后開始快速增加,分別在16和12 h達(dá)到最高值,為2.25和1.22 U/g,隨后逐漸降低。這是由于乳酸菌在生長的過程中產(chǎn)生的大量乳酸、乙酸等有機(jī)酸會(huì)激活豆類內(nèi)源性α-淀粉酶活力[29],而縮合單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解也有助于α-淀粉酶活力的增加[7,13],使淀粉酶作用于淀粉分子生成低分子糊精、麥芽糖以及葡萄糖,同時(shí)菌株自身也會(huì)分泌淀粉酶,使整體的淀粉酶活力呈現(xiàn)增加的趨勢(shì),而隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,有機(jī)酸過多的積累反而會(huì)對(duì)α-淀粉酶的活力產(chǎn)生抑制的作用,所以在發(fā)酵后期酶活力逐漸降低。

圖2 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中α-淀粉酶活(a)與α-氨基態(tài)氮含量(b)的變化

在圖2b中,α-氨基態(tài)氮的含量變化可以反映酸面團(tuán)中蛋白質(zhì)的降解情況以及蛋白酶活力的變化,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,紅豆、扁豆酸面團(tuán)中的α-氨基態(tài)氮含量都逐漸增加,分別從0 h的1.98、5.27 μmol/mL增加到24 h的5.29、11.51 μmol/mL。表明在整個(gè)發(fā)酵過程中,由低pH環(huán)境所激活的內(nèi)源性蛋白酶[30]以及菌株自身分泌的蛋白酶一直在作用于酸面團(tuán)中的蛋白質(zhì),將蛋白質(zhì)降解為小分子多肽以及氨基酸,所以α-氨基態(tài)氮的含量不斷上升?？梢钥闯?由于紅豆中的蛋白質(zhì)含量較低,被水解的蛋白質(zhì)較少,所以α-氨基態(tài)氮含量整體上低于扁豆酸面團(tuán)。扁豆酸面團(tuán)在發(fā)酵后期α-氨基態(tài)氮含量增加較快,說明此時(shí)其中的蛋白酶活力較高。

2.4 酸面團(tuán)發(fā)酵前后多肽分子量分布

圖3為紅豆(a)、扁豆(b)酸面團(tuán)發(fā)酵前后多肽分子量分布色譜圖,其中保留時(shí)間最短、最先出峰的是分子量在20000 Da以上的大分子肽,肽分子量越小,保留時(shí)間越長,出峰也越晚,可以看出,兩種豆類酸面團(tuán)經(jīng)發(fā)酵后,大分子量的肽含量都降低了,其中分子量在20000 Da以上的大分子肽含量在紅豆、扁豆酸面團(tuán)中分別從40.53%、31.37%降低到了30.75%、27.84%(表3),并且同時(shí)保留時(shí)間靠后的小分子肽含量也明顯增加,如分子量小于300 Da的小分子肽含量在紅豆酸面團(tuán)中從52.31%增加到了59.45%,但扁豆酸面團(tuán)中分子量300 Da以下的小肽含量卻有略微降低,這可能是因?yàn)檫@些小分子肽在蛋白酶的作用下被進(jìn)一步水解成了游離氨基酸。這與α-氨基態(tài)氮的測(cè)定結(jié)果相一致,即在豆類酸面團(tuán)的發(fā)酵過程中,蛋白酶水解了部分蛋白質(zhì)及大分子肽生成了更多小分子多肽,同時(shí)縮合單寧等可與蛋白酶結(jié)合的抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解也在一定程度上解除了其對(duì)蛋白酶活性的抑制[7],從而使蛋白酶能更好地作用于大分子蛋白質(zhì)與多肽,將其降解為分子量較低的小肽以及游離氨基酸,有利于人體對(duì)這些營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收。

圖3 紅豆(a)、扁豆(b)酸面團(tuán)發(fā)酵前后多肽分子量分布色譜圖

表3 紅豆、扁豆酸面團(tuán)發(fā)酵前后多肽分子量分布

續(xù)表

2.5 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中游離總酚及游離氨基酸含量

2.5.1 游離總酚含量 由圖4可知,紅豆中的游離總酚含量最高,其次是扁豆,并且兩種酸面團(tuán)中的游離總酚含量均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸增加,這與Coda等[31]研究人員的研究結(jié)果一致,發(fā)酵0 h,紅豆與扁豆酸面團(tuán)中的游離總酚含量分別為26.91、8.92 mg/g,發(fā)酵24 h時(shí)分別為47.28、14.81 mg/g,相比發(fā)酵前分別顯著(P<0.05)增加了75.74%、65.94%,這可能與發(fā)酵過程中的酸性環(huán)境使得多酚類物質(zhì)從結(jié)合的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x的狀態(tài)有關(guān),并且單寧也屬于一種酚類物質(zhì),在被單寧酶降解后可能會(huì)生成一些聚合度較低的小分子酚類物質(zhì),由聚合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)[32],這也從側(cè)面證明了單寧類物質(zhì)的降解。此外,發(fā)酵過程也會(huì)破壞作物細(xì)胞膜的通透性,使酚類物質(zhì)更容易游離出來[33]。

圖4 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中游離總酚含量

2.5.2 游離氨基酸含量 在酸面團(tuán)發(fā)酵的過程中,游離氨基酸作為微生物在谷物等基質(zhì)中生長作用的一種代謝產(chǎn)物,對(duì)最終產(chǎn)品的風(fēng)味、營養(yǎng)與感官品質(zhì)都具有重要影響。從表4中可以看出,紅豆、扁豆酸面團(tuán)在發(fā)酵后,幾乎所有的游離氨基酸的含量都發(fā)生了明顯增加,總游離氨基酸含量分別從發(fā)酵前0 h的278.62、355.79 mg/100 g增加至24 h的691.92、788.21 mg/100 g,即分別增加為原來的2.48、2.22倍,其中7種必需氨基酸含量分別增加了429.31%、358.20%,在紅豆酸面團(tuán)中增加的比例更大。這表明通過D23菌株的發(fā)酵,都能夠大幅增加這兩種豆類的總游離氨基酸含量,提升必需氨基酸比例,使其營養(yǎng)更加豐富,有利于人體吸收。兩種酸面團(tuán)中氨基酸含量的差異可能與基質(zhì)本身以及菌株在這兩種基質(zhì)中的代謝狀況不同有關(guān)。此外,谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸等氨基酸作為風(fēng)味物質(zhì)前體,其含量的增加會(huì)為最終饅頭產(chǎn)品的風(fēng)味帶來積極影響,如脯氨酸在饅頭蒸制過程中會(huì)與糖類發(fā)生美拉德反應(yīng)帶來焦糖味或奶甜味[34]。

表4 兩種豆類酸面團(tuán)發(fā)酵前后游離氨基酸含量

2.6 紅豆、扁豆酸面團(tuán)饅頭的淀粉、蛋白質(zhì)體外消化率

2.6.1 饅頭的淀粉體外消化率 以測(cè)得整個(gè)消化過程中消化液還原糖含量的變化來表示淀粉的體外消化率,還原糖含量越多,代表淀粉消化率也就越高。從圖5中可以看出,在消化初期(0～30 min)各饅頭組別表現(xiàn)出一致的消化趨勢(shì),即淀粉迅速被消化液中的α-淀粉酶與淀粉葡萄糖苷酶水解,產(chǎn)生大量還原糖,淀粉的消化率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),但酸面團(tuán)組具有更高的水解速率,其中紅豆酸面團(tuán)組的水解速率最高。并且從圖5中可以看出,隨著消化時(shí)間的延長,淀粉的消化速率逐漸放慢,趨于平緩,在180 min到達(dá)消化終點(diǎn)時(shí),紅豆、扁豆酸面團(tuán)饅頭消化液中的還原糖含量分別為6.00、6.09 mg/mL,相較于普通紅豆、扁豆饅頭的5.81、5.77 mg/mL,分別顯著(P<0.05)增加了3.27%、5.55%,即獲得了更高的最終淀粉體外消化率。這說明經(jīng)酸面團(tuán)發(fā)酵可以提高豆類饅頭的淀粉體外消化率,使其更易被消化酶分解,有利于人體的消化與吸收。這可能是由于酸面團(tuán)組經(jīng)過了乳酸菌發(fā)酵作用,其中所含有的部分淀粉分子已經(jīng)被酸面團(tuán)中的內(nèi)源性淀粉酶或者乳酸菌產(chǎn)生的α-淀粉酶作用過,由長鏈結(jié)構(gòu)變成較短的分子結(jié)構(gòu)[35],所以在經(jīng)歷體外消化時(shí)能夠更快地被分解為葡萄糖等還原糖,提高其消化速率。此外,還可能是由于在不含酸面團(tuán)的組別中,豆類中的單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子,如縮合單寧,會(huì)與淀粉酶等消化酶結(jié)合[36],使其水解活力降低,進(jìn)而降低消化率。而酸面團(tuán)組的縮合單寧含量更低,故可以在一定程度上減小其對(duì)淀粉酶活力的影響,從而提高淀粉的體外消化率。

圖5 不同組饅頭的淀粉體外消化率曲線

2.6.2 饅頭的蛋白質(zhì)體外消化率 圖6為通過兩步酶解法測(cè)得的饅頭的蛋白質(zhì)體外消化率曲線,從圖6中可以看出,四組饅頭樣品在消化的過程中整體上表現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì),即在前120 min內(nèi),先由在酸性環(huán)境中具有活性的胃蛋白酶作用于樣品中的蛋白質(zhì),切斷肽鏈之間的肽鍵,將大分子的蛋白質(zhì)降解為小分子的多肽[37],所以在0～30 min內(nèi)蛋白質(zhì)消化率迅速上升,隨著時(shí)間的延長,水解產(chǎn)物逐漸增多,消化速度逐漸變緩,消化率達(dá)到約35%～45%,而120～240 min,則由加入的胰蛋白酶發(fā)揮蛋白水解作用,進(jìn)一步將蛋白質(zhì)降解為小肽以及氨基酸,蛋白質(zhì)消化率又呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì),最終達(dá)到65%～80%。從圖6中可以看出,消化速率最快的為扁豆酸面團(tuán)組,紅豆酸面團(tuán)組與扁豆空白團(tuán)組的變化較為接近。扁豆酸面團(tuán)組在兩個(gè)消化階段都表現(xiàn)出了較快的水解速率,而紅豆酸面團(tuán)組在胃蛋白酶消化階段水解較快,在胰蛋白酶消化階段則較為緩慢。整體上觀察,相比于不添加酸面團(tuán)制作的豆類饅頭,酸面團(tuán)饅頭組都具有對(duì)應(yīng)更快的蛋白質(zhì)消化速度,并且最終體外消化率顯著(P<0.05)增加(紅豆、扁豆組分別為67.68%、70.21%,對(duì)應(yīng)酸面團(tuán)組分別為73.21%、76.97%)。這一方面可能與酸面團(tuán)組中抗?fàn)I養(yǎng)因子縮合單寧等的降解有關(guān),已有研究表明,單寧可以降低豆類、谷物等作物中蛋白質(zhì)的體外消化率,如Charlene等[38]發(fā)現(xiàn)綠豆中的縮合單寧會(huì)降低綠豆種子的蛋白質(zhì)體外消化率,Kristen等[39]的研究也表明高粱縮合單寧與小麥谷蛋白會(huì)發(fā)生明顯的相互作用,導(dǎo)致最終產(chǎn)品蛋白質(zhì)消化率降低。Marisela等[40]也將發(fā)酵豆類蛋白質(zhì)消化率的提升主要?dú)w因于單寧的微生物降解。另一方面,則是在酸面團(tuán)發(fā)酵的過程中已將部分蛋白質(zhì)降解為多肽及氨基酸,從而提高了在消化過程中的蛋白水解速率,對(duì)最終的消化率產(chǎn)生積極影響。

圖6 不同組饅頭的蛋白質(zhì)體外消化率曲線

3 結(jié)論

本研究利用一株高產(chǎn)單寧酶的發(fā)酵乳桿菌對(duì)D23分別發(fā)酵紅豆、扁豆酸面團(tuán)并制備饅頭,通過該株菌的發(fā)酵作用,兩種豆類酸面團(tuán)中縮合單寧含量顯著下降(P<0.05),在紅豆、扁豆酸面團(tuán)中分別降低了57.87%、53.54%;大分子量多肽在蛋白酶的作用下被降解為更易吸收利用的小分子量多肽;同時(shí)游離總酚含量分別升高了75.74%、65.94%;必需氨基酸含量增加了429.31%、358.20%;并且酸面團(tuán)發(fā)酵的紅豆、扁豆饅頭最終消化液中還原糖含量分別增加了3.27%、5.55%,淀粉的體外消化率得到了提升,同時(shí)蛋白質(zhì)的最終體外消化率也分別由67.68%、70.21%增加為73.21%、76.97%。因此,該株具有單寧酶活力的乳酸菌可以通過酸面團(tuán)的發(fā)酵作用有效降低豆類酸面團(tuán)中縮合單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子帶來的不利影響,提升包括必需氨基酸在內(nèi)的游離氨基酸含量,并且對(duì)最終產(chǎn)品的淀粉與蛋白質(zhì)體外消化率帶來有利影響,提升其營養(yǎng)價(jià)值,可以作為一種天然的功能配料應(yīng)用于豆類產(chǎn)品的制作。