羧甲基殼聚糖在秀麗線蟲體內(nèi)的抗衰老作用

李卓航,楊 敏,張鋒倫,龔祝南,馬世宏,束成杰,*

(1.南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院,江蘇南京 210023;2.南京野生植物綜合利用研究院,江蘇南京 211100;3.南京市江寧區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,江蘇南京 211100)

殼聚糖(Chitosan)是甲殼素堿性條件下脫乙酰后得到的產(chǎn)物,有良好的生物相容性、生物可降解性,并表現(xiàn)出一定的生物活性[1]。但是殼聚糖溶解性比較差,生物活性較弱,極大地限制了其工業(yè)化應(yīng)用。化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾是提高殼聚糖溶解性和生物活性、實現(xiàn)殼聚糖高值化利用的有效手段[2]。通過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾得到的殼聚糖衍生物在水果保鮮[3]、果汁澄清和防褐變[4]、食物保存[5]、延緩衰老[6]等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl chitosan)為殼聚糖的羧甲基化后的產(chǎn)物,是一種兩性聚電解質(zhì),安全無毒,研究表明羧甲基殼聚糖體外抗氧化能力和溶解性都明顯優(yōu)于殼聚糖[7-8],但降血脂活性低于殼聚糖[8-10]。羧甲基殼聚糖在食品、農(nóng)業(yè)、印染、化妝品、生物醫(yī)學(xué)等方面有著越來越多的應(yīng)用,但是其抗衰老、抗氧化方面尚未被合理開發(fā)[2]。

秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans,C.elegans)作為模式生物,其生命周期短,遺傳背景清晰,實驗操作方便,可用于抗衰老研究[11-12]。本實驗借助模式動物秀麗線蟲,通過對其壽命、運動能力、咽泵運動、排泄周期及體內(nèi)抗氧化酶活力等方面進行研究,探究羧甲基殼聚糖在其體內(nèi)的抗衰老作用,以期為抗衰老、抗氧化的保健產(chǎn)品開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羧甲基殼聚糖(羧化度≥99%) 上海源葉生物科技有限公司;野生型秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans,C.elegans)、埃希氏大腸桿菌OP50(E.coliOP50) 均由南京野生植物綜合利用研究院提供;氧化試劑盒 南京建成生物工程研究所;實驗所用其他試劑 均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;JW-25017HR高速冷凍離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司;OlympusBX41奧林巴斯顯微鏡 南京艾朗儀器有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;T6紫外/可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;Multiskan FC 型酶標儀 賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 秀麗線蟲培養(yǎng)方法 線蟲培養(yǎng)參照文獻[13-16],使用NGM培養(yǎng)基。配制方法:每1000 mL培養(yǎng)基含有瓊脂17 g,多聚蛋白胨2.5 g,NaCl 3 g,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min,加入滅菌后的1 mL 1 mol/L CaCl2、1 mL 1 mol/L MgSO4、25 mL 1 mol/L K3PO4緩沖液,待冷卻至50 ℃左右時,加入1 mL 5 mg/mL膽固醇,搖勻后倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi),取E.coliOP50置于培養(yǎng)皿內(nèi)于37 ℃培養(yǎng)過夜,備用。

1.2.2 秀麗線蟲暴露方法 取用產(chǎn)卵期體內(nèi)出現(xiàn)大量蟲卵的秀麗線蟲,將秀麗線蟲洗脫收集,取1 mol/L NaOH和10% NaClO按體積比1∶1混合作為秀麗線蟲裂解液裂解線蟲,得大量蟲卵,放置于涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基上,20 ℃培養(yǎng)48～60 h,得年輕成蟲。對照組加入M9緩沖液,實驗組分別給予濃度100、500、1000 mg/L的羧甲基殼聚糖,處理24 h[17-19],以壽命、運動能力、吞咽頻率、排泄周期以及體內(nèi)抗氧化酶的活力作為檢測指標。

1.2.3 秀麗線蟲壽命測定 秀麗線蟲壽命測定參考文獻方法[16,20-22]。隨機挑取暴露后的秀麗線蟲至涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上,每組33條,每組設(shè)3個平行,20 ℃培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)移當天(壽命實驗第0 d)起計算秀麗線蟲存活天數(shù),以鉑金絲碰觸秀麗線蟲仍然不動即判定為死亡,每天記錄秀麗線蟲存活和死亡條數(shù),實驗持續(xù)至最后一條秀麗線蟲死亡為止,取線蟲死亡一半的時間,記錄為半數(shù)致死時間[22-23]。

1.2.4 秀麗線蟲運動能力的測定

1.2.4.1 身體彎曲能力測定 隨機挑取暴露后的秀麗線蟲至無食物的培養(yǎng)基上觀察其身體彎曲頻率,一次成功的身體彎曲定義為以身體形成的S型中軸線為軸,向前行進一個正弦波形的過程。在顯微鏡下觀察并記錄1 min內(nèi)秀麗線蟲的身體彎曲次數(shù),以次/min為單位,作為身體彎曲頻率的指標,每組取20條觀察,同時設(shè)對照。實驗重復(fù)三次[16,22,24]。

1.2.4.2 頭部擺動能力測定 隨機挑取暴露后的秀麗線蟲至含M9緩沖液的不接種大腸桿菌的NGM培養(yǎng)基上,觀察其頭部擺動頻率,一次成功的頭部擺動定義為其頭部擺動方向改變,并改變必須轉(zhuǎn)過其身體朝向方向。在顯微鏡下觀察并記錄1 min內(nèi)秀麗線蟲的頭部擺動次數(shù),以次/min為單位,作為頭部擺動頻率的指標,每組取20條觀察,同時設(shè)對照。實驗重復(fù)三次[16,22,24]。

1.2.5 秀麗線蟲咽泵運動測定 隨機挑取20條暴露后的秀麗線蟲至涂有E.coliOP50的培養(yǎng)基上,同時設(shè)對照組,觀察其咽泵運動,一次成功的咽泵運動定義為咽泵在吞咽過程收縮運動一次,在顯微鏡下觀察并記錄1 min內(nèi)秀麗線蟲的咽泵運動速率,以次/min為單位。實驗重復(fù)三次[2]。

1.2.6 秀麗線蟲排泄周期測定 隨機挑取20條暴露后的秀麗線蟲至涂有OP50培養(yǎng)基上,單獨的秀麗線蟲被取出檢測,當秀麗線蟲體壁肌肉伸縮排泄到下一次體壁伸縮排泄的周期時間即為排泄周期,觀測其排泄周期,這一實驗需在高倍顯微鏡下觀察,實驗重復(fù)三次[25-26]。

1.2.7 秀麗線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力的測定 將暴露24 h的秀麗線蟲從培養(yǎng)皿上洗下,清洗至透明后移除上清液稱重,按比例加入生理鹽水,在冰水中進行勻漿,充分研碎,使組織勻漿化,制備成10%的勻漿液,2500 r/min,離心10 min,分別嚴格按照試劑盒說明書要求進行酶活力的測定[27-29]。

1.2.7.1 過氧化氫酶(catalase,CAT)活力測定 CAT的定義為每毫升血清或血漿每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量為一個活力單位。取離心后的組織勻漿上清液,再用勻漿介質(zhì)稀釋成不同濃度,按照試劑盒說明書加入所需試劑后混勻,于波長405 nm,光徑0.5 cm,雙蒸水調(diào)零,測定各管吸光度值[30]。實驗重復(fù)三次。

1.2.7.2 谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活力測定 GSH-Px的定義為每毫克蛋白質(zhì),扣除非酶反應(yīng)作用,每分鐘使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個酶活力單位。取離心后的組織勻漿上清液0.5 mL,加試劑一應(yīng)用液2 mL混勻,3500 r/min,離心10 min,取上清1 mL進行顯色反應(yīng),按照試劑盒說明書加入所需試劑后混勻,靜置5 min,420 nm處,1 cm光徑,雙蒸水調(diào)零,測定各管吸光度值。實驗重復(fù)三次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

實驗結(jié)果以Excel 2010軟件、SPSS 22.0統(tǒng)計軟件和Photoshop 2019繪圖軟件進行統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羧甲基殼聚糖對秀麗線蟲壽命的影響

壽命是秀麗線蟲暴露前后變化最直接的反映,實驗結(jié)果如圖1A所示,對照組和100 mg/L羧甲基殼聚糖處理過的秀麗線蟲組存活率變化趨勢相近,從第5 d開始明顯下降,在第18 d存活率為0,所以100 mg/L的羧甲基殼聚糖處理對秀麗線蟲的壽命無顯著影響。1000 mg/L羧甲基殼聚糖處理過的秀麗線蟲組存活率在第6 d開始明顯下降,在第19 d存活率降為0,所以1000 mg/L的羧甲基殼聚糖能處理夠在一定程度上延長秀麗線蟲的壽命。500 mg/L羧甲基殼聚糖處理秀麗線蟲組存活率下降趨勢明顯較緩,從第10 d開始明顯下降,至第21 d存活率降為0,所以500 mg/L羧甲基殼聚糖處理可以更好地延長秀麗線蟲的壽命。與對照組半數(shù)致死天數(shù)(9.5±0.5) d相比,100 mg/L羧甲基殼聚糖處理過的秀麗線蟲組半數(shù)致死天數(shù)為(10.3±0.4) d,無顯著性差異(P>0.05);而1000、500 mg/L的羧甲基殼聚糖分別能顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)延長秀麗線蟲的半數(shù)致死天數(shù)至(12.2±0.32)和(14.25±0.88) d(圖1B)。因此,500、1000 mg/L的羧甲基殼聚糖在線蟲體內(nèi)表現(xiàn)出良好的抗衰老作用。

圖1 不同濃度羧甲基殼聚糖對秀麗線蟲壽命的影響

2.2 羧甲基殼聚糖對秀麗線蟲運動行為的影響

秀麗線蟲的運動行為與其神經(jīng)系統(tǒng)的基本功能有關(guān),常采用頭部擺動和身體彎曲兩個表型指標來評價運動行為能力。實驗結(jié)果如圖2顯示,與對照組相比,100 mg/L羧甲基殼聚糖能顯著(P<0.05)提高秀麗線蟲頭部擺動頻率,500 mg/L羧甲基殼聚糖能極顯著(P<0.01)提高秀麗線蟲頭部擺動頻率(圖2A)。與對照組相比,100 mg/L羧甲基殼聚糖能顯著(P<0.05)提高秀麗線蟲身體彎曲次數(shù),500 mg/L羧甲基殼聚糖能極顯著(P<0.01)提高秀麗線蟲身體彎曲次數(shù)(圖2B),而1000 mg/L羧甲基殼聚糖對秀麗線蟲的頭部擺動頻率和身體彎曲次數(shù)影響不顯著。其中,500 mg/L羧甲基殼聚糖對秀麗線蟲的運動行為影響極顯著(P<0.01)。因此,一定濃度的羧甲基殼聚糖能提高秀麗線蟲運動行為能力,降低線蟲機體氧化,維持神經(jīng)系統(tǒng)功能,延緩線蟲衰老。

圖2 不同濃度羧甲基殼聚糖對秀麗線蟲運動行為的影響

2.3 羧甲基殼聚糖對秀麗線蟲咽泵運動速率的影響

咽泵運動能夠直接反映出秀麗線蟲的攝食能力,并且秀麗線蟲壽命可以通過咽泵運動速率來間接進行評價[31]。實驗結(jié)果如圖3所示,與對照組相比,1000 mg/L的羧甲基殼聚糖對秀麗線蟲的咽泵運動速率影響不顯著(P>0.05)。100 mg/L的羧甲基殼聚糖顯著(P<0.05)提高了秀麗線蟲的咽泵運動速率;500 mg/L的羧甲基殼聚糖極顯著(P<0.01)提高了秀麗線蟲的咽泵運動速率。進一步說明100、500 mg/L的羧甲基殼聚糖處理使秀麗線蟲攝食能力加快,證明一定濃度的羧甲基殼聚糖在體內(nèi)發(fā)揮了一定的抗衰老作用。

圖3 不同濃度羧甲基殼聚糖對秀麗線蟲咽泵運動的影響

2.4 羧甲基殼聚糖對秀麗線蟲排泄周期的影響

排泄周期是評價羧甲基殼聚糖體內(nèi)抗氧化能力的重要指標。生長狀態(tài)好的秀麗線蟲代謝能力較強,排泄周期較短,所以排泄周期能夠直接反映出羧甲基殼聚糖在秀麗線蟲體內(nèi)的抗氧化能力[32-33]。結(jié)果如圖4所示,與對照組相比,給藥組均能縮短秀麗線蟲的排泄時長,其中100 mg/L的羧甲基殼聚糖能夠顯著(P<0.05)縮短秀麗線蟲的排泄時長,500 mg/L的羧甲基殼聚糖能夠極顯著(P<0.01)縮短排泄時長,而1000 mg/L的羧甲基殼聚糖對縮短秀麗線蟲的排泄時長影響不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明,一定濃度羧甲基殼聚糖能縮短秀麗線蟲的排泄時長,提高代謝能力,提高機體抗衰老能力。

圖4 不同濃度羧甲基殼聚糖對秀麗線蟲排泄周期的影響

2.5 羧甲基殼聚糖對秀麗線蟲體內(nèi)CAT活性的影響

CAT是在生物演化過程中建立起來的生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一,能有效清除各種活性氧基團,從而防止這些基團對細胞膜系統(tǒng)的破壞[30]。實驗結(jié)果如圖5所示,與對照組相比,100、500和1000 mg/L羧甲基殼聚糖均能夠極顯著(P<0.01)增強秀麗線蟲體內(nèi)的CAT的活力,從而增強秀麗線蟲的抗氧化能力,有效延緩衰老。

圖5 不同濃度羧甲基殼聚糖對秀麗線蟲體內(nèi)CAT活力的影響

2.6 羧甲基殼聚糖秀麗線蟲體內(nèi)GSH-Px活力的影響

圖6 不同濃度羧甲基殼聚糖對秀麗線蟲體內(nèi)GSH-Px活力的影響

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明,500和1000 mg/L的羧甲基殼聚糖均能顯著延長線蟲壽命(P<0.05),而100和500 mg/L的羧甲基殼聚糖能顯著提高秀麗線蟲的運動行為能力和攝食能力(P<0.05),縮短秀麗線蟲排泄周期(P<0.05),提高秀麗線蟲體內(nèi)抗氧化酶活性(P<0.01),與報道的羧甲基殼聚糖明顯延長果蠅的存活時間,提高小鼠體內(nèi)SOD酶活性,并降低MDA含量的作用基本一致[34]。通過對比可發(fā)現(xiàn)相較于500 mg/L羧甲基殼聚糖,1000 mg/L羧甲基殼聚糖的抗衰老能力有所減弱,可能是因為羧甲基殼聚糖濃度過高,其攜帶的負電荷對酶的反應(yīng)環(huán)境造成影響,抑制了其與脂類物質(zhì)的結(jié)合[35]。綜上所述,500 mg/L的羧甲基殼聚糖抗衰老、抗氧化效果最佳。本實驗借助秀麗線蟲探究羧甲基殼聚糖的體內(nèi)抗衰老活性,可為羧甲基殼聚糖哺乳動物體內(nèi)抗衰老研究提供思路,也為羧甲基殼聚糖的產(chǎn)品開發(fā)利用提供理論參考。