無柄靈芝提取物中營養(yǎng)成分及體外抗氧化活性分析

鐘千貴,陳天賜,邱銘錳,劉新銳,李 瑩,江玉姬,,陳炳智,,*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002;2.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心,福建福州 350002)

靈芝(Ganodermalucidum(Curtis)P. Karst)民間稱靈芝草,是一種名貴的中藥材,性溫,氣味苦平無毒。常服用靈芝有滋補強身、扶正固體、延年益壽等功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)表明靈芝能產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用,能誘導(dǎo)細胞因子的產(chǎn)生,具有抗腫瘤[2]、抗炎癥[3]、抗病蟲侵入、抗氧化、抗糖尿病的能力,結(jié)合臨床實驗的證明,發(fā)現(xiàn)靈芝對各種疾病有顯著的預(yù)防和治療效果[4-7]。由于靈芝具有獨特的藥理作用和基本無副作用的特點,其中赤芝和紫芝被列到中國藥典中,在國際上也傳有盛譽[8]。作為靈芝屬的一個種,無柄靈芝GanodermaresinaceumBoud.又名圓孔靈芝、扁靈芝、樹芝、三秀靈芝等,與赤芝一樣,長期被用于預(yù)防和治療各類疾病[9]。已有研究記載無柄靈芝的提取物具有重要的抑菌活性[10],以及明顯的抗癌、增強免疫力和保肝護肝等多種藥理作用[11]。

目前對赤芝的研究比較廣泛、深入,不論是其含有的物質(zhì)結(jié)構(gòu)[12-14],活性成分還是功能作用[15-18]。然而關(guān)于無柄靈芝的研究報道相對較少,主要集中于栽培育種、無柄靈芝的分類[19-21]、三萜、雜萜生物堿等化學(xué)成分結(jié)構(gòu)分析、抗菌作用等。劉莉瑩等[22]從無柄紫靈芝的乙醇提取物的氯仿部分分離鑒定了8個三萜和1個生物堿化合物,但并未對其功能進行研究。楊橋芬[23]利用正、反相層析等技術(shù)分離純化了無柄靈芝的化學(xué)成分,分離到32個化合物,其中2個為新化合物,但未對其進行深入的功能研究。本課題組Chen等在中國赤芝主產(chǎn)區(qū)分離鑒定到了3株無柄靈芝,并發(fā)現(xiàn)無柄靈芝子實體內(nèi)三萜含量較赤芝高[24]。因此,本研究進一步以無柄靈芝為對象,赤芝為參考,對比分析了無柄靈芝提取物中的營養(yǎng)物質(zhì)及體外抗氧化能力,為下一步無柄靈芝的功能性研究以及綜合開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗所用的赤芝、無柄靈芝子實體 福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供;無水乙醇、苯酚、葡萄糖、濃硫酸、甲醇、冰乙酸、香草醛、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、過硫酸鉀 上海麥克林生化科技有限公司;三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、氨基酸標準品 日本和光純藥工業(yè)公司;檸檬酸鋰(四水)、氯化鋰檸檬酸(一水)、硫代雙乙醇、聚氧乙烯月桂醚、辛酸 南京化學(xué)試劑股份有限公司。

UV-2600型紫外分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司;SCIENTZ-12N型冷凍干燥機 寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;H-1850R型高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限司;R205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司;FZ102型中藥粉碎機 昆山市超聲儀器有限公司;L-8900型氨基酸自動分析儀 天美(中國)科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取物制備

1.2.1.1 靈芝水提物制備 赤芝、無柄靈芝子實體經(jīng)70 ℃烘干、粉碎過60目篩后置于燒杯,按料液比1∶15 g/mL,加入超純水于90 ℃水浴2 h、15 kHz超聲0.5 h、11 μm濾紙0.1 MPa抽濾后得到第一次濾液。按同等料液比往第一次濾渣中加入超純水重復(fù)水浴、超聲、減壓過濾收集第二次濾液。重復(fù)第二次步驟收集第三次濾液。最后將三次收集的濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后置于冷凍干燥機中干燥24 h備用。

1.2.1.2 靈芝醇提物制備 參照Guo等[25]的方法,步驟與水提物相似,把超純水換成55%的乙醇溶液按料液比1∶30 g/mL配制,60 ℃水浴2 h、15 kHz超聲0.5 h、11 μm濾紙0.1 MPa抽濾后得到第一次濾液。按同等料液比往第一次濾渣中加入55%的乙醇溶液重復(fù)水浴、超聲、減壓過濾收集第二次濾液。重復(fù)第二次步驟收集第三次濾液。最后將三次收集的濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后置于冷凍干燥機中干燥24 h備用。

1.2.2 總糖含量測定 采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[26],以葡萄糖作為標準品,測得標準線性回歸方程為:y=8.78x-0.0322,決定系數(shù)R2=0.9992。

1.2.3 總?cè)坪繙y定 采用香草醛-冰醋酸法測定提取物中總?cè)莆镔|(zhì)含量[27],以齊墩果酸為標準品,測得標準線性回歸方程為:y=9.855x+0.0195,決定系數(shù)R2=0.9938。

1.2.4 游離氨基酸含量測定 參照Lu等[28]的方法,經(jīng)過前期預(yù)實驗及后期實驗需求將1.2.1所得樣品分別與超純水配制成3 g/L的溶液,然后過0.22 μm的濾膜。測定參數(shù):分離柱溫度57 ℃,檢測波長570 nm(脯氨酸檢測波長為440 nm);進樣量20 μL;緩沖液流速0.35 mL/min;反應(yīng)液茚三酮試劑,其流速為0.35 mL/min,單元溫度135 ℃,離子交換樹脂(4.6 mm×100 mm,粒徑7 μm),柱溫為57 ℃,反應(yīng)器在115 ℃,進樣速度為250 μL/min。緩沖液的配制:蒸餾水700 mL、檸檬酸鋰(四水)5.73 g、氯化鋰1.24 g、檸檬酸(一水)19.90 g、硫代雙乙醇5.0 mL、聚氧乙烯月桂醚4.0 mL、辛酸0.1 mL。

1.2.5 體外抗氧化活性測定

1.2.5.1 ABTS陽離子自由基(ABTS+·)清除能力的測定 參照Li等[29]的方法稍作改動。首先將1.2.1中所獲得的樣品與蒸餾水制備成500 mg/L的溶液備用;分別取0.2 mL的7.4 mmol/L ABTS溶液及2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液,充分混勻,避光靜置12 h,即得ABTS+·母液。將ABTS+·母液用95%乙醇稀釋,使其在734 nm處的吸光值變?yōu)?.700±0.020,靜置30 min后,即得ABTS+·工作液。分別吸取10 μL不同的靈芝樣品溶液加入190 ABTS+·工作液,振搖10 s以充分混勻后靜置6 min,于734 nm處測定吸光值。根據(jù)下列公式計算ABTS陽離子自由基的清除率:

ABTS陽離子自由基清除率(%)=[1-(AX-AX0)/A0]×100

式中:AX為樣品與ABTS陽離子自由基反應(yīng)的吸光值;AX0為蒸餾水代替ABTS陽離子自由基的吸光值;A0為蒸餾水代替樣品的吸光值。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力的測定 參照Morales等[30]的方法并略作修改。首先取與1.2.5.1中相同濃度的不同樣品溶液1 mL與DPPH 溶液(0.1 mmol/L,95%乙醇配制)1 mL充分混勻,室溫避光靜置30 min,517 nm測定吸光值;用1 mL 95%乙醇溶液代替DPPH溶液為樣品參比組;空白組為1 mL DPPH溶液與1 mL 95%乙醇溶液。DPPH自由基清除活力根據(jù)下式進行計算:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:Ai為樣品組吸光值;Aj為樣品參比組吸光值;A0為空白組吸光值。

1.2.5.3 羥基自由基清除能力的測定 參照王爽等[31]方法進行,取與1.2.5.1中相同濃度的不同樣品溶液備用,反應(yīng)體系如下:FeSO4(9 mmol/L)、水楊酸-乙醇溶液(9 mmol/L)、樣液及H2O2溶液各1 mL,于37 ℃反應(yīng)30 min,于510 nm處測定吸光值。

羥基自由基清除率(%)=[1-(Ax-AX0)/A0]×100

式中:Ax為樣品的吸光值;Ax0為蒸餾水代替H2O2的吸光值;A0為蒸餾水代替樣品的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究的實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0,用Originpro 8.0、Excel 2010進行做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖含量測定結(jié)果

對2種靈芝進行提取制備,赤芝和無柄靈芝水提物的提取率分別為7.73%和8.12%,醇提物的提取率分別為9.21%和9.83%,這與劉艷芳等[32]報道的提取率相似。然后對兩種靈芝不同提取方法所獲得提取物中的總糖含量進行檢測,結(jié)果見圖1所示,可以看到赤芝水提物與無柄靈芝水提物中總糖含量均高于各自醇提物,分別為51.54%、48.77%。兩種靈芝水提物總糖含量沒有顯著性差異(P>0.05),醇提物總糖含量存在顯著性差異(P<0.05)。無柄靈芝醇提物中總糖含量最低,為22.88%?？偺呛繌母叩降鸵来螢槌嘀ニ嵛?無柄靈芝水提物>赤靈芝醇提物>無柄靈芝醇提物。其中,赤芝的提取物的總糖含量比無柄靈芝的提取物高,與Chen等[24]比較無柄靈芝與赤芝子實體多糖含量的結(jié)果相吻合。

圖1 兩種靈芝不同提取物中總糖含量

2.2 總?cè)坪繙y定結(jié)果

兩種靈芝不同提取方法所獲得提取物中靈芝三萜含量如圖2，可以看到無柄靈芝醇提物總?cè)坪孔罡邽?5.37 mg/g,無柄靈芝水提物最低為1.3 mg/g,呈顯著差異(P<0.05)。赤靈芝與無柄靈芝的醇提物三萜含量均高于各自水提物,且具有顯著性差異(P<0.05)。這與報道的結(jié)果相似,通常靈芝三萜類化合物屬醇溶性成分,醇提取物的三萜含量一般較水提取物高[33]。本研究數(shù)據(jù)顯示總?cè)坪坑筛叩降鸵来螢闊o柄靈芝醇提物>赤靈芝醇提取物>赤靈芝水提物>無柄靈芝水提物。其中無柄靈芝提取物的總?cè)坪勘瘸嘀ヌ崛∥锔?這與Chen等[24]檢測比較無柄靈芝與赤芝子實體的三萜含量的結(jié)果相吻合。

圖2 兩種靈芝不同提取物中總?cè)坪?/p>

2.3 游離氨基酸含量測定結(jié)果

兩種靈芝不同提取物中游離氨基酸含量如表1,可以看到無柄靈芝提取物中檢測出的纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸、精氨酸4種氨基酸在赤芝提取物中均未檢測出,除此之外蘇氨酸、谷氨酸、丙氨酸、賴氨酸在無柄靈芝提取物中的含量相對較高。無柄靈芝水提物與醇提物的游離氨基酸總量分別為105.224和61.144 mg/g,具有顯著性差異(P<0.05)。而赤芝水提物與醇提物中的游離氨基酸總量分別為11.177和8.295 mg/g,具有顯著性差異(P<0.05)。赤芝(醇提物與水提物)與無柄靈芝(醇提物與水提物)提取物中必需氨基酸占游離氨基酸總量比(E/T)分別為29.795%±1.091%和39.173%±4.108%,可以看出無柄靈芝中必需氨基酸占比要高于赤芝。其中無柄靈芝提取物的組氨酸含量也顯著高于赤芝提取物(P<0.05),相比劉偉等[34]報道的2種無孢靈芝(鹿角靈芝和龍芝2號)均不含組氨酸,無柄靈芝提取物的游離氨基酸組成具有特異性。

表1 不同靈芝不同提取物中游離氨基酸含量

2.4 提取物體外抗氧化活性分析

四種靈芝提取物對ABTS陽離子自由基清除率如圖3A。無柄靈芝醇提物對ABTS陽離子自由基的清除能力最強,為54.48%。在同一品種不同提取方法的情況下,醇提物的清除能力大于水提物,存在顯著差異(P<0.05)。在不同品種同一提取方法的情況下,無柄靈芝醇提物的清除能力和赤芝的醇提物具有顯著差異性(P<0.05),無柄靈芝水提物和赤芝的水提物沒有顯著差異(P>0.05)。從總體上來看,赤芝和無柄靈芝的ABTS陽離子自由基清除能力,差異不顯著(P>0.05),與赤芝相比,無柄靈芝對清除ABTS陽離子自由基的效果更好。

四種靈芝提取物對DPPH自由基清除率如圖3B。四種提取物都具有一定的清除DPPH自由基能力,其中無柄靈芝醇提物最強。在同一提取方法不同品種的情況下,無柄靈芝的醇提物和赤芝醇提物的清除能力存在顯著差異(P<0.05),無柄靈芝的水提物和赤芝水提物之間的清除能力無顯著差異(P>0.05);在不同提取方法同一品種的情況下,赤芝的醇提物和水提物的清除能力存在顯著差異(P<0.05),醇提物的清除能力大于水提物,無柄靈芝的醇提物和水提物具有顯著差異(P<0.05),無柄靈芝醇提物的清除能力大于水提物。雖然從總體上看,無柄靈芝對DPPH自由基的清除率會略大于赤芝,但沒有顯著性差異(P>0.05)。

四種靈芝提取物對羥自由基清除率如圖3C。由于Fe2+與H2O2混合可以產(chǎn)生·OH,水楊酸是最常用的捕獲劑,故使用水楊酸將其捕獲,并產(chǎn)生有色物質(zhì)。若加入具有清除·OH能力的樣液,則會與水楊酸競爭·OH,使得有色物質(zhì)產(chǎn)量降低,可以看出:無柄靈芝和赤芝提取物都具有一定的清除羥自由基的能力,但兩種靈芝的水提物清除率都偏低。在同一品種不同提取方法的情況下,赤芝水提物與赤芝醇提物的清除能力具有顯著性差異(P<0.05),無柄靈芝的水提物和醇提物之間存在顯著差異(P<0.05),無柄靈芝醇提物對羥自由基的清除能力強于無柄靈芝水提物;在不同品種同一提取方法的情況下,對羥自由基的清除能力,赤芝水提物和無柄靈芝水提物之間沒有顯著性差異(P>0.05),赤芝醇提物和無柄靈芝醇提物之間存在顯著性差異(P<0.05)。

圖3 兩種靈芝不同提取物相同濃度對三種自由基的清除能力

無柄靈芝與赤芝的醇提取物比這2種靈芝的水提取物具有較高的自由基清除活性。通過相關(guān)性分析可知,ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率和羥自由基清除率與三萜含量的相關(guān)性值分別為0.907、0.922、0.972;說明無柄靈芝醇提取物中的三萜類物質(zhì)與其抗氧化性正相關(guān)。梁磊等的研究結(jié)果顯示,靈芝三萜對DPPH自由基清除效果優(yōu)于茶多酚,具有較強的清除自由基活性[35]。李田田等[36]對樹舌靈芝研究表明在同等劑量下,三萜的抗氧化能力要強于多糖。本文的結(jié)果與他們的結(jié)果相似,因此,可以進一步推測無柄靈芝的抗氧化能力與其三萜類物質(zhì)有關(guān)。

3 結(jié)論

本試驗對比分析了無柄靈芝與赤芝這兩種靈芝不同提取物中的總糖、總?cè)啤⒖傆坞x氨基酸的含量及在同等濃度下對三種自由基的清除能力,發(fā)現(xiàn)不同靈芝子實體的不同的提取溶劑提取物中這三種物質(zhì)組成存在差異。兩種靈芝在總糖和總游離氨基酸方面,水提取物的含量比醇提取物的含量高,而在三萜方面,無柄靈芝水提取物的含量卻比醇提取物的含量低。另外,赤芝的提取物的總糖含量比無柄靈芝的提取物高;而無柄靈芝提取物的總?cè)坪勘瘸嘀サ母?。在總游離的氨基酸方面,無柄靈芝的提取物的含量比赤芝的高。在清除ABTS自由基、DPPH自由基、羥基自由基方面,兩種靈芝的提取物都具有一定的清除能力,并且醇提物要比其水提物的清除效果較好。因此,在今后的不同功能成分的提取開發(fā)方面,應(yīng)考慮使用不同的溶劑提取。本研究結(jié)果為今后進一步開發(fā)利用無柄靈芝提供了數(shù)據(jù)支持。