3種不同溶劑中根皮苷與牛血紅蛋白的相互作用及抗氧化性

高義霞,楊 艷,周向軍

(1.天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院,甘肅天水 741001;2.甘肅省大櫻桃工程技術(shù)研究中心,甘肅天水 741001)

根皮苷(phlorizin,PHL)是根皮素與2′-β-D-葡萄糖形成的二氫查爾酮苷類化合物[1],富含于蘋果、梨、荔枝和多穗柯甜茶等組織的嫩葉、根莖及蘋果果實(shí)中[2]。研究表明,根皮苷是鈉-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SGLTs)的競爭性抑制劑[3],可減輕Ⅲ型糖尿病的胰島素抵抗,同時(shí)也可促進(jìn)葡萄糖的外排分泌,降低餐后血糖水平而不產(chǎn)生低血糖等副作用,因而對糖尿病及并發(fā)癥有良好的防治作用。同時(shí),PHL還具有保護(hù)心血管[4]、抗病毒[5]、抗感染[6]和抗氧化[7]等多種功能。

光譜法是研究蛋白質(zhì)與小分子化合物相互作用的主要手段,主要有紫外光譜法、熒光光譜法和紅外光譜法等[8]。每種光譜法均有一定局限性,應(yīng)盡可能結(jié)合上述方法進(jìn)行研究。通過紫外光譜,可判斷蛋白質(zhì)分子中芳香族氨基酸的微環(huán)境變化,分析蛋白質(zhì)與小分子是否存在相互作用;通過熒光光譜,可計(jì)算出兩者的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù),判斷結(jié)合位置和作用力類型等;通過同步熒光光譜,可克服Trp、Tyr和Phe發(fā)射光譜重疊問題,從而獲得更為清晰的熒光圖譜;通過紅外光譜,可分析蛋白質(zhì)與小分子化合物作用后二級結(jié)構(gòu)的變化。

血紅蛋白是高等生物紅細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行輸氧功能的呼吸蛋白,常作為血液緩沖劑或通過可逆結(jié)合多種配體來調(diào)節(jié)各種生命現(xiàn)象。牛血紅蛋白(bovine hemoglobin,BHb)與人血紅蛋白具有極高的一級結(jié)構(gòu)同源性,空間結(jié)構(gòu)幾乎完全一致且容易獲得,因此常用于模擬生物大分子與小分子化合物的相互作用研究。小分子化合物與血紅蛋白的相互作用,不僅影響其體內(nèi)濃度、循環(huán)、分布和生物活性等[9],而且對血紅蛋白結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮也有一定影響[10],最終影響藥物的治療效果。近年來國內(nèi)外相關(guān)研究主要集中在牛血清蛋白或單一溶劑體系,少有采用血紅蛋白或多溶劑體系的報(bào)道。但一方面,由于高濃度PHL的水溶性較差,在食品醫(yī)藥領(lǐng)域常需添加乙醇(EtOH)、二甲基亞砜(DMSO)等助溶劑[11],另一方面,小分子化合物與蛋白質(zhì)的相互作用對其抗氧化性影響也不明確。因此,本實(shí)驗(yàn)利用紫外光譜、熒光光譜、同步熒光光譜和紅外光譜法,研究在dH2O、10% DMSO(v/v)和10% EtOH(v/v)不同溶劑體系中,根皮苷與牛血紅蛋白的作用類型、猝滅機(jī)理、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合距離等,并分析PHL-BHb對DPPH和ABTS自由基清除率的影響,為研究小分子化合物與血紅蛋白的相互作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛血紅蛋白(BHb) 純度>90%,Worthingtong Biochemical Corporation;根皮苷(PHL) 純度>98%,索萊寶;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS(2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽) Sigma;DMSO和EtOH 生工生物工程(上海)股份有限公司;實(shí)驗(yàn)用水 娃哈哈純凈水。

RF5301熒光光譜儀、UV-1800紫外可見分光光度計(jì) 日本島津;Nicolet iS5紅外光譜儀 美國賽默飛世爾;PHS-3D型pH計(jì) 上海雷磁;ME204電子天平 瑞士梅特勒托利多。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 3種不同溶劑體系中PHL對BHb紫外光譜的影響 在dH2O、10%DMSO和10%EtOH不同溶劑體系中,固定BHb終濃度為1.0×10-5mol·L-1,調(diào)節(jié)PHL用量使其終濃度分別為0、1.5×10-5、4.5×10-5、7.5×10-5、10.5×10-5、13.5×10-5mol·L-1,在298 K條件下混合均勻,20 min后在240～360 nm范圍內(nèi)測定紫外吸收光譜[12]。

1.2.2 3種不同溶劑體系中PHL對BHb熒光光譜的影響 在dH2O、10% DMSO和10% EtOH不同溶劑體系中,固定BHb終濃度為1.0×10-5mol·L-1,調(diào)節(jié)PHL用量使其終濃度分別為0、1.5×10-5、4.5×10-5、7.5×10-5、10.5×10-5、13.5×10-5mol·L-1,混合均勻,20 min后在激發(fā)波長280 nm,激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5 nm,掃描速率1200 nm/min條件下,在300～400 nm范圍內(nèi)分別測定298、304和310 K時(shí)熒光發(fā)射光譜[13]。在298 K條件下,固定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm,其它參數(shù)同熒光光譜,分別測定298 K時(shí)BHb的同步熒光光譜[14]。

1.2.3 BHb、PHL-BHb的紅外光譜 在dH2O體系中,固定PHL濃度為1.0×10-4mol·L-1,BHb濃度為1.0×10-4mol·L-1。相互作用20 min后真空冷凍干燥24 h。取2 mg樣品與200 mg KBr進(jìn)行研磨后壓成透明薄片,在分辨率為4 cm-1,掃描次數(shù)為16次,4000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描其紅外光譜。

1.2.4 3種不同溶劑體系中PHL、BHb、PHL-BHb抗氧化性 DPPH自由基清除率參考Sharma[15]方法,研究在3種不同溶劑體系下,PHL和BHb分別為1.5×10-2mol·L-1和1.5×10-5mol·L-1時(shí),其對PHL抗氧化性的影響;ABTS+·清除率參考封易成[16]方法,研究在3種不同溶劑體系下,PHL和BHb分別為1.5×10-2mol·L-1和1.5×10-3mol·L-1時(shí),其對PHL抗氧化性的影響。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜

在3種不同溶劑體系中,PHL與BHb相互作用的紫外光譜見圖1(a)、1(b)和1(c)。由圖1(a)、1(b)和1(c)可知,隨PHL濃度不斷增加,BHb在280 nm附近均逐漸出現(xiàn)增色效應(yīng),但這僅表明PHL與BHb存在相互作用[17],不能完全歸屬于BHb分子中Tyr和Trp的π-π*和n-π*躍遷,因?yàn)镻HL的λmax也在284 nm[18]左右且與BHb紫外吸收存在一定程度重合。在3種不同溶劑體系中,BHb的λmax均發(fā)生輕微紅移?？赡茉?PHL與BHb分子間的相互作用,導(dǎo)致π-π*躍遷所需能量減少[19],因而出現(xiàn)紅移。當(dāng)PHL濃度增至7.5×10-5mol·L-1時(shí),BHb分子在330 nm附近均逐漸出現(xiàn)微弱副峰,這進(jìn)一步驗(yàn)證了PHL與BHb存在相互作用。

圖1 3種不同溶劑體系中PHL-BHb的紫外光譜

2.2 熒光光譜

2.2.1 熒光光譜 在3種不同溶劑體系中,PHL與BHb相互作用的熒光光譜見圖2(a)、2(b)和2(c)。理論上采用280 nm波長激發(fā)時(shí),Phe熒光發(fā)射可忽略,Tyr熒光峰應(yīng)在313 nm附近,但本實(shí)驗(yàn)313 nm處未見熒光峰,而在320 nm附近出現(xiàn)熒光峰?？赡茉?盡管每個(gè)BHb分子含有10個(gè)Tyr殘基和6個(gè)Trp殘基,但BHb疏水腔內(nèi)的β-37Trp為其內(nèi)源熒光的主要來源[20],因此,可能是BHb分子發(fā)生了Tyr到Trp的能量轉(zhuǎn)移,從而導(dǎo)致Tyr熒光猝滅和Trp熒光增強(qiáng)。在3種不同溶劑體系中,隨PHL濃度不斷增加,一方面,BHb熒光峰在320 nm附近逐漸變寬甚至消失;熒光強(qiáng)度成規(guī)律性降低,且降低程度逐漸減弱。這表明PHL對BHb發(fā)生了熒光猝滅,且BHb分子中可被PHL結(jié)合的位點(diǎn)被不斷占據(jù)而最終使熒光猝滅程度趨于穩(wěn)定[21]。當(dāng)PHL濃度增至7.5×10-5mol·L-1時(shí),3種不同溶劑體系中的BHb熒光峰出現(xiàn)峰裂分,即原來320 nm處的單峰逐漸裂分為極其微弱的二重峰,其中一個(gè)峰紅移至340 nm附近,可認(rèn)為是Trp的發(fā)射峰;另一個(gè)峰藍(lán)移至315 nm附近,可認(rèn)為是Tyr的發(fā)射峰。對于熒光二重峰歸屬問題,目前尚無明確定論,初步認(rèn)為:隨PHL濃度增大(>7.5×10-5mol·L-1),BHb分子中Tyr殘基受PHL誘導(dǎo)而終止與Trp殘基的能量共振轉(zhuǎn)移,從而發(fā)射Tyr熒光峰的趨勢逐漸增強(qiáng)[22]。

圖2 3種不同溶劑體系中PHL-BHb熒光光譜

在dH2O體系中,隨PHL濃度增大,BHb的λem由321 nm逐漸紅移至349 nm;在10% DMSO體系中,BHb的λem由321 nm逐漸紅移至350 nm;在10% EtOH體系中,BHb的λem由322 nm逐漸紅移至349 nm。一般認(rèn)為,Trp處于非極性介質(zhì)時(shí),熒光峰在310～324 nm范圍;處于分子內(nèi)部疏水介質(zhì)時(shí),熒光峰在326～332 nm范圍;暴露分子表面時(shí),熒光峰在350～353 nm范圍[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,3種不同溶劑體系中的Trp處于從疏水性介質(zhì)向分子表面暴露階段,即部分位于疏水介質(zhì)中。PHL分子中存在的給電子基團(tuán)-OH,可誘導(dǎo)BHb發(fā)生紅移,這是分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移而引起的能量轉(zhuǎn)移結(jié)果[24]。

2.2.2 熒光猝滅機(jī)理 假設(shè)PHL對BHb的熒光猝滅為動(dòng)態(tài)猝滅,根據(jù)Stern-Volmer曲線擬合:

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

式(1)

式(1)中:F0和F分別為未加和加入PHL時(shí)的熒光強(qiáng)度,[Q]為PHL濃度,Kq為速率常數(shù),τ0為無PHL時(shí)熒光壽命(10-8s),Ksv為猝滅常數(shù)。

lg[(F0-F)/F]=nlg[Q]+lgKa

式(2)

式(2)中:n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù),Ka為結(jié)合常數(shù)。

根據(jù)PHL濃度及熒光強(qiáng)度,計(jì)算KSV、Kq、Ka等,結(jié)果見表1。在3種不同溶劑體系中,Kq均為1012L·(mol·S)-1數(shù)量級且大于2.0×1010L·(mol·S)-1,故PHL對BHb為靜態(tài)猝滅[25]。在3種不同溶劑體系中,平均結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)分別為1.57、1.58和1.57,n和Ka均隨溫度升高而降低,這表明溫度升高降低了PHL-BHb穩(wěn)定性,符合靜態(tài)猝滅。3種不同溶劑體系中,Ka均為107L·mol-1數(shù)量級,表明理論上PHL與BHb的結(jié)合作用較強(qiáng)[26],可被蛋白質(zhì)運(yùn)輸或儲存。

表1 不同溶劑中PHL-BHb的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

2.2.3 熱力學(xué)和相互作用力 當(dāng)溫度變化范圍較小時(shí),ΔH可視為常數(shù),故PHL-BHb熱力學(xué)參數(shù)可采用Van’t Hoff方程計(jì)算。

式(3)

ΔG=ΔH-TΔS

式(4)

式(3)中:R為氣體摩爾常數(shù),8.31J/(mol·K);Ka為結(jié)合常數(shù)。

計(jì)算結(jié)果見表2。由表2可知,各不同溶劑體系的ΔG<0,說明反應(yīng)可自發(fā)進(jìn)行;ΔS<0,ΔH<0,說明PHL-BHb相互作用以范德華力和氫鍵為主[27]。

表2 不同溶劑體系中PHL-BHb的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.2.4 結(jié)合距離 根據(jù)Forster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移機(jī)理及下列關(guān)系式

式(5)

式(6)

J=∑F(λ)ε(λ)λ4Δλ/∑F(λ)Δλ

式(7)

式(5)中,F0為熒光發(fā)射強(qiáng)度,F為熒光發(fā)射體/熒光受體濃度比為1∶1時(shí)的熒光強(qiáng)度;式(6)中,K2、N、φ和J分別表示偶極空間取向因子,介質(zhì)折射常數(shù),BHb熒光量子產(chǎn)率,供體熒光發(fā)射譜與受體吸收譜的重疊積分;式(7)中,F(λ)為BHb在波長λ處的熒光強(qiáng)度,ε(λ)為熒光受體在波長λ處的摩爾吸光系數(shù)。在相同條件下測定BHb熒光光譜和PHL的紫外光譜,將兩光譜重疊見圖3(a)、(b)和(c),并利用式(7)計(jì)算重疊面積J。

圖3 3種不同溶劑體系中BHb發(fā)射光譜與PHL吸收光譜重疊圖

Trp量子產(chǎn)率Φ=0.15,N為1.366,K2為2/3,結(jié)果見表3。在dH2O、DMSO、EtOH 3種不同溶劑體系中,BHb與PHL的結(jié)合距離r0分別為4.561、4.576、4.566 nm,均小于7 nm,說明PHL與BHb在不同溶劑體系中均發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移[28]。

表3 不同溶劑體系中PHL-BHb的結(jié)合距離

2.3 同步熒光光譜

BHb分子中Trp、Tyr和Phe熒光峰存在重疊現(xiàn)象,采用同步熒光光譜法可判斷其微環(huán)境和極性變化。Δλ=15 nm和Δλ=60 nm分別代表Tyr和Trp的熒光光譜[29]。圖4(a)和4(b)、圖5(a)和5(b)、圖6(a)和6(b)分別表示dH2O、10% DMSO和10% EtOH體系在Δλ1=15 nm和Δλ2=60 nm的同步熒光光譜,其熒光發(fā)射峰約在307 nm和333 nm左右。由圖4(a)和4(b)、圖5(a)和5(b)、圖6(a)和6(b)可知,隨PHL濃度增加,Tyr和Trp熒光強(qiáng)度均逐漸降低,且代表Trp的熒光強(qiáng)度下降程度大于代表Tyr的熒光強(qiáng)度,表明PHL主要與Trp殘基而非Tyr相互作用[30]。根據(jù)Horst[31],同步熒光還可用來判斷蛋白質(zhì)分子的共軛度,熒光峰紅移,共軛度增加,反之,共軛度降低。隨PHL濃度增加,在dH2O中,Tyr發(fā)生輕微紅移,而Trp發(fā)生輕微藍(lán)移,其它2種溶劑體系無明顯紅/藍(lán)移,這表明,在dH2O中,PHL使BHb共軛度受到一定影響而下降,且Trp殘基的微環(huán)境更加疏水[32]。

圖4 dH2O中PHL-BHb同步熒光光譜

圖5 10% DMSO中PHL-BHb同步熒光光譜

圖6 10% EtOH中PHL-BHb同步熒光光譜

2.4 紅外光譜

PHL對BHb紅外光譜的影響見圖7。由圖7可知,PHL使BHb酰胺Ⅱ帶的N-H彎曲振動(dòng)和C-N伸縮振動(dòng)從1541.809 cm-1紅移至1540.363 cm-1,這歸屬于α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的疊加[33],PHL使BHb酰胺I帶的C=O伸縮振動(dòng)從1657.517 cm-1紅移至1656.071 cm-1,這歸屬于α-螺旋的特征吸收峰[34],這表明PHL與BHb存在相互作用且使BHb分子中C=O、N-H、C-N的存在狀態(tài)發(fā)生了某種變化,改變了BHb二級結(jié)構(gòu)。另外,PHL使BHb酰胺I帶和酰胺Ⅱ帶強(qiáng)度均增強(qiáng),這可能是由于PHL的酚羥基與BHb分子中C=O或C-N基團(tuán)通過氫鍵作用,使BHb有序性降低而發(fā)生某種重排所致[35]。朱穎[36]研究表明,花青素引起大豆分離蛋白的酰胺Ⅰ和Ⅱ帶發(fā)生藍(lán)移,而韓敬美[37]研究表明,煙堿使胃蛋白酶的酰胺I帶和酰胺Ⅱ帶分別發(fā)生紅移和藍(lán)移,這說明不同種類蛋白質(zhì)和小分子化合物作用,其引起蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化不同。

2.5 3種不同溶劑體系對PHL、BHb、PHL-BHb抗氧化性的影響

在3種不同溶劑體系中,BHb、PHL、PHL-BHb對DPPH和ABTS自由基清除率分別見圖8(a)和8(b)。PHL抗氧化性主要取決酚羥基的供氫或供電子能力[38]。通過測定PHL對DPPH和ABTS自由基清除率的大小,分析加入BHb后不同溶劑體系對PHL氧化性的影響。由圖8(a)可知,當(dāng)加入BHb后,在dH2O和10%DMSO體系中,PHL對DPPH自由基清除率均顯著增加(P<0.05);在10%DMSO體系中,PHL對DPPH自由基清除率增加顯著(P<0.05);在10%EtOH體系中,PHL對DPPH自由基清除率顯著下降(P<0.05)。由圖8(b)可知,當(dāng)加入BHb后,在3種不同溶劑體系中,PHL對ABTS自由基清除率均顯著增加(P<0.05)。這表明在不同的抗氧化體系中,BHb對PHL抗氧化性的影響不同。

3 結(jié)論

在3種不同溶劑體系中,紫外光譜表明PHL與BHb均存在相互作用,熒光光譜表明PHL對BHb具有熒光猝滅作用,且猝滅機(jī)理均為靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移,相互作用力以范德華力和氫鍵為主。同步熒光光譜表明,BHL與PHL的相互結(jié)合位點(diǎn)更接近BHb的Trp殘基而非Tyr殘基。紅外光譜表明,在dH2O體系中,酰胺Ⅰ和Ⅱ帶發(fā)生輕微紅移。對DPPH和ABTS自由基清除率表明,除10%EtOH-DPPH體系外,PHL-BHb均不同程度提高了PHL對DPPH和ABTS自由基的清除率。前人有關(guān)小分子化合物與生物大分子的相互作用研究,大多為單一溶劑體系且主要以牛血清白蛋白為模型蛋白,而本實(shí)驗(yàn)在dH2O、10% DMSO和10% EtOH等溶劑體系,研究了PHL與BHb的相互作用及其對PHL抗氧化性的影響,這為拓展水溶性較差的小分子活性化合物與生物大分子的相互作用提供了新視角,但PHL與BHb相互作用的具體結(jié)合位點(diǎn)仍有待于通過分子模擬等手段進(jìn)一步闡明,同時(shí)PHL與BHb的相互作用對BHb生物學(xué)功能的影響也有待于進(jìn)一步研究。