腎移植術后天然抗體對受者預后影響的相關性研究

劉偉，趙杰，宋廣平，劉偉，趙一賀，李代紅 （.天津市第一中心醫(yī)院輸血科， 天津 3009；.天津市第一中心醫(yī)院移植外科，天津 3009）

腎移植是目前終末期腎病患者最佳的腎臟替代治療方式，能夠提高患者的生活質量和預期壽命。抗體介導的排斥反應（antibody-mediated rejection，AMR）是危害腎移植長期預后的一個主要原因，也是導致移植腎加速失功的重要推動因素。目前，抗體在實體器官移植排斥反應中的作用研究主要集中在針對移植組織上的同種異基因靶器官的抗ABO血型和人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）特異性抗體上。有研究報道，MICA［1］、AT1R［2-4］、ETAR［5-6］和LG3［7］等非HLA 抗體會導致患者產生AMR。

天然抗體（natural antibodies，Nabs）主要結合一些氧化應激下脂質過氧化產生的氧化相關抗原，這些抗原包括自身抗原和外來抗原，也包括凋亡細胞的表面抗原。過氧化產生高活性產物，如丙二醛（malondialdehyde，MDA），與蛋白質或脂質共價結合形成了Nabs 識別的新表位［8］。在器官移植中，移植物的缺血/再灌注、移植物損傷、慢性排斥反應等均有氧化應激現(xiàn)象，使Nabs 結合到移植物中，最終造成移植物損傷。同時，Nabs 在維持體內穩(wěn)定和免疫保護方面也具有重要作用，但在異體移植損傷中的作用機制仍不十分明確。本研究通過回顧性分析腎移植患者對MDA 有反應的IgG Nabs 抗體的產生情況，從而探討其與移植物存活、腎組織活檢的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料：選取2015 年1 月— 2019 年6 月天津市第一中心醫(yī)院行同種異體腎移植術患者44 例，其中男性36 例，女性8 例，平均年齡為（45.8± 10.9）歲。入選標準：① 所有受者移植術前進行補體依賴淋巴細胞毒試驗結果為陰性； ② 術后均接受鈣調磷酸酶抑制劑（環(huán)孢素或他克莫司）為主的免疫抑制方案；③ 術后能夠定期隨訪，且各種資料完整；④ 所有患者均發(fā)生AMR。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測Nabs 抗體

1.2.1 血清IgG 的純化：根據(jù)試劑說明書，使用瓜子凝膠IgG 純化試劑盒（Thermo Science，Rockford，IL）純化患者血清標本中的IgG。血清樣品使用緩沖液稀釋為1：10，與甜瓜凝膠孵育5 min，然后通過離心從凝膠中洗脫IgG。

1.2.2 MDA 反應性評估：取1 mol/L 1，1，3，3-四甲氧基丙烷（湖北巨勝科技有限公司）2 ml 加入到8 ml 96 mmol/L HCl 中，37℃水解10 min，然后用1 mol/L NaOH 中和，調節(jié)pH 值到7.2 ～ 7.4。取10 ml MDA 與50 ml BSA （2 mg/ml） 溶液在37℃孵育3 h，然后4℃下用PBS 進行廣泛透析72 h，得到MDA-BSA 包被抗原。然后，將高結合96 孔板包被 10 μg/ml MDA 修飾的BSA，4℃過夜。用添加0.5%水解酪蛋白的PBS 緩沖鹽水在室溫下封閉平板1 h。待檢血清用0.5%明膠的PBS 緩沖鹽水稀釋4 倍， 50 μl/孔加入到包被孔中，37℃作用30 min，250 μl/孔 清洗液洗板3 次，然后每孔加入辣根過氧化物酶標記的驢抗人IgG （上海生工生物有限公司）100 μl在37℃孵育30 min。使用3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺底物顯色液進行顯色15 min，最后加入終止液在450 nm 處測量OD 值。移植后Nabs（Nabs+）的產生被定義為移植后血清對MDA 的血清反應性較移植前增加至少25%［9］。

1.3 Luminex 技術檢測抗HLA 抗體和抗供者特異性抗體：利用Luminex 液相芯片系統(tǒng)，采用LIFECODES LifeScreen Deluxe?PRA 和LIFE CODES LSA?Single Antigen（美國Immucor 公司）檢測腎移植術前和術后抗HLA 抗體和抗供者特異性抗體的水平。按照試劑盒操作說明書，應用Luminex 讀取檢測結果，MATCH IT Antibody 軟件進行分析。

1.4 AMR 的 診 斷：AMR 判 斷 依 據(jù)Banff 2013 標準和中國腎移植排斥反應臨床診斷與治療指南 （2016 版）的臨床和病理結果［10］。腎臟組織學評價指標包括：腎小球炎（g）、血管內膜炎（v）、間質炎癥細胞浸潤（i）、小管炎（t）、管周毛細血管焱（ptc）、小動脈玻璃樣變（ahh）、動脈內膜纖維化（cv）、間質纖維化（ci）以及小管萎縮（ct）。

1.5 統(tǒng)計學分析：應用SPSS 20.0 版軟件進行統(tǒng)計學處理，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，計數(shù)資料以率表示。組間正態(tài)分布的計量資料采用t 檢驗，組間計數(shù)資料均采用卡方檢驗，影響受者存活時間的單因素分析采用Kaplan-Meier 回歸模型，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

1.6 倫理學：本研究符合醫(yī)學倫理學標準：得到倫理委員會審批（審批號：2019N164KY）。

2 結 果

2.1 腎移植術后患者一般資料分析（表1）：兩組腎臟移植受者在性別、年齡、術前并發(fā)癥、HLA錯配數(shù)、DSA 產生情況、免疫抑制劑方案等方面的差異均無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。

表1 腎移植受者一般臨床資料

2.2 Nabs+組與Nabs-組移植腎存活率的比較 （圖1）：隨訪期間共有5 例腎移植受者出現(xiàn)移植腎功能喪失，其中Nabs+組3 例，Nabs-組2 例。Nabs+組移植術后移植物存活率明顯低于Nabs-組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.044）。

圖1 Nabs+組與Nabs-組移植腎存活率比較

2.3 Nabs 抗體與移植病理結果的比較：移植術后Nabs+的患者在腎小球炎癥（g）、間質淋巴單核細胞侵潤（i）、腎小管炎（t）和C4d 沉積的平均Banff評分都顯著升高，其中間質淋巴單核細胞侵潤（i）有顯著性差異（P=0.047，圖2D）。管周毛細管（ptc）（P=0.23，圖2B）、腎小球炎癥（g）（P=0.24，圖2C）、腎小管炎（t）（P=0.84，圖2E）和C4d沉積（P=0.59，圖2A）兩組間比較無顯著性差異。

2.4 兩組Nabs 與移植腎功能的關系：Nabs+組eGFR的均值為（19.0±4.0） ml/（min·1.73 m2）, Nabs- 組估算腎小球過濾率（estimated glomerular filtration rate，eGFR） 的 均 值 為（21.7±2.5） ml/（min·1.73 m2）， eGFR 測定的腎功能在Nabs+ 患者與Nab- 患者相比有所下降，但差異無顯著性 （P=0.64， 圖3）。

圖3 Nabs+組和Nabs-組eGFR 值的比較

3 討 論

在實體器官移植AMR 中，非HLA 抗體的作用日益被認識到。以往的研究，Nabs 是與腎臟和心臟移植的不良結果相關的非HLA 抗體［11-12］。移植環(huán)境中自身抗體的產生取決于多種因素，通過缺血/再灌注、同種異體免疫和慢性炎癥介導的移植物損傷可導致凋亡細胞表面表達細胞內蛋白，提高了這些細胞作為自身抗原的可能性。隨后，在細胞外小泡或第三級淋巴組織中，自身抗原可由受體或供體抗原提呈細胞呈遞給自身反應性T 細胞和B 細胞，更好地理解自身抗體產生的機制可能導致識別新的治療策略，以預防或控制移植排斥反應和異常血管重塑。目前對在移植過程中引發(fā)免疫反應的自身抗原的不完全了解，從而阻礙了AMR 的診斷和治療。本研究探討了Nabs的發(fā)生與移植后的長期結果和移植物損傷之間的關系，Nabs+組移植術后移植物存活率明顯低于Nabs-組。本研究與See 等［9］報道的結果相 一致。

由于入組的腎移植患者均發(fā)生了排斥反應，本文進一步研究了Nabs 與移植腎穿刺活檢和Banff評分之間的關系，結果顯示移植術后Nabs+的患者在腎小球炎癥（g）、間質淋巴單核細胞侵潤（i）、腎小管炎（t）和C4d 沉積的平均Banff 評分都顯著升高，其中間質淋巴單核細胞侵潤（i）有顯著性差異。

Nabs 的產生機制及其作用方式仍不明確。有研究報道，供體特異性抗體（donor specific antibody，DSA）介導的移植物損傷暴露內皮細胞新表位，導致產生針對移植物的自身抗體［13］。然而，本文的研究結果表明，在沒有DSA 的情況下，Nabs 可以產生。此外，對小鼠的研究表明，缺 血/再灌注損傷暴露了導致組織破壞的隱蔽自身抗原［14］。人類移植腎的這種早期損傷可能會刺激內皮脂質過氧化，導致氧化特異性表位暴露和Nabs的產生。手術創(chuàng)傷引起的局部炎癥和移植物組織損傷，殘留的T 細胞同種異體反應，甚至某些免疫抑制劑的腎毒性也可能觸發(fā)Nabs 的產生。此外，已知氧化特異性表位與細菌抗原（如肺炎鏈球菌的抗原)發(fā)生交叉反應［15］。因此，接觸細菌也可能是Nabs 產生的潛在機制。

據(jù)文獻報道，HLA 和非HLA 抗體都通過補體非依賴性的方式引起移植物損傷，包括抗體依賴的細胞毒性和內皮細胞的激活［16-17］，Nabs 也可能以類似的方式激活移植物內皮。已有報道研究，DSA 和AT1R 抗體這兩種抗體可能存在生物協(xié)同作用［18-19］。但由于本研究樣本量較少，沒有涉及Nabs 和DSA 之間的相加效應，但在這兩種抗體的患者中觀察到的移植物存活率是顯著降 低的。

總體而言，本研究對發(fā)生排斥反應的腎移植受者進行的回顧性研究強調了Nabs 作為移植物丟失的獨立免疫危險因素的相關性。Nabs 與移植后年組織損傷的組織學標志物之間的關系也表明它們參與導致長期移植失敗的移植物退化過程。下一步我們會增加樣本量作進一步深入研究，從而指導臨床疾病狀態(tài)的分析及進一步的免疫抑制治療，并制定策略，以改善長期移植結果。